RNA干擾趨化因子受體CXCR7基因對黑素瘤M14細胞侵襲和遷移的影響

劉排 田蔚蔚 李小靜 李志鋒 燕霞 孫建方

RNA干擾趨化因子受體CXCR7基因對黑素瘤M14細胞侵襲和遷移的影響

劉排 田蔚蔚 李小靜 李志鋒 燕霞 孫建方

目的探討靶向沉默趨化因子受體CXCR7基因對黑素瘤細胞株M14侵襲和遷移能力的影響。方法采用Western印跡實驗檢測黑素瘤M14和A375細胞CXCR7蛋白的表達，選取高表達CXCR7蛋白的M14細胞作為研究對象。將M14細胞分為實驗組、陰性對照組和空白對照組：實驗組轉染CXCR7-siRNA，陰性對照組轉染陰性對照siRNA，空白對照組不做任何處理。采用實時定量PCR和蛋白質印跡法分別檢測CXCR7 mRNA和蛋白在M14細胞中的表達水平，Transwell小室法及細胞劃痕法檢測干擾前后細胞侵襲及遷移能力的變化。結果實驗組M14細胞CXCR7 mRNA及蛋白相對表達量分別為0.412±0.023、0.144±0.005，明顯低于陰性對照組（1.211±0.117、1）以及空白對照組（1.000±0.102、1.016±0.004），差異均有統(tǒng)計學意義（F值分別為30.068、11 485.5，P值分別為0.001、0.000）。實驗組M14細胞穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)為（20.617±1.503）個，明顯少于陰性轉染對照組［（42.000±6.018）個］和空白對照組［（43.627±2.152）個］，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=32.416，P=0.001）。劃痕實驗中，實驗組每高倍視野（×200）下細胞遷移數(shù)為15.00±1.10，明顯少于陰性對照組（44.90±2.20）和空白對照組（45.30±2.30），3組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=2 411.945，P=0.000）。結論靶向沉默CXCR7能顯著抑制黑素瘤M14細胞的侵襲和遷移，有望為皮膚黑素瘤提供潛在的治療靶點。

黑色素瘤，實驗性；受體，CXCR7；RNA干擾；腫瘤侵潤；細胞遷移分析

我們前期研究表明［1］，皮膚黑素瘤組織及細胞系中趨化因子受體 7（chemokine receptor 7，CXCR7）表達升高，可能參與其惡性侵襲與轉移過程。為進一步探討CXCR7在皮膚黑素瘤侵襲轉移中的作用，我們通過RNA干擾技術，觀察CXCR7對黑素瘤細胞侵襲、遷移等生物學行為的影響。

作者單位：330001南昌，江西省皮膚病?？漆t(yī)院皮膚內科（劉排、田蔚蔚）；河北工程大學附屬醫(yī)院皮膚科（李小靜、李志鋒、燕霞）；中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院皮膚病研究所病理科（孫建方）

材料與方法

一、主要試劑和儀器

Trizol、G418產自美國Invitrogen公司，實時熒光定量PCR試劑盒產自美國Promega公司，黑素瘤細胞系A375、M14細胞產自美國標準生物品收藏中心（ATCC），兔抗人CXCR7多克隆抗體為美國Santa Cruz公司產品，CytoSelect24孔細胞移行試驗試劑盒為美國Cell Biolabs公司產品，細胞計數(shù)CCK-8（cell counting kit-8）試劑盒為日本同仁株式會社化學研究所產品；Transwell小室為美國Corning公司產品。

二、細胞培養(yǎng)和實驗方法

1．細胞培養(yǎng)：細胞系A375、M14細胞用含10%胎牛血清的高糖Dulbecco極限必需培養(yǎng)基（Dulbecco′s minimum essential medium，DMEM）培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。

2.Western印跡實驗檢測黑素瘤M14和A375細胞CXCR7蛋白表達:采用免疫印跡法檢測黑素瘤M14和A375細胞CXCR7蛋白表達，選擇高表達CXCR7蛋白的細胞作為研究對象。具體檢測步驟如下：提取兩組細胞總蛋白，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞后，加入預冷的蛋白裂解液裂解細胞，收集上清，提取細胞總蛋白，Brodford法測定蛋白含量。取70 μg蛋白上樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）垂直電泳、聚亞乙烯雙氧化物（PVDF）轉膜，加入一抗（1 ∶400）、二抗（1 ∶5 000），X線曝光、顯影及定影，用CXCR7灰度值與3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）灰度值的比值代表CXCR7蛋白的相對表達量。所有內參均使用β肌動蛋白。每組樣本各重復實驗3次。

3.引物設計：基因庫上查找CXCR7的基因全系列后，Primer zpremier5.0軟件設計，通過使用核酸序列數(shù)據(jù)庫檢索程序排除其他的可能同源序列。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。CXCR7：上游引物：5′-GCGTCCAACAATGAGACCT ACTG-3′，下游引物：5′-GGCAAAGCCCAAGACAAC GGAGA-3′，目的產物 302 bp。

4.siRNA序列設計以及分組：用美國Ambion公司和德國Qiagen公司的siRNA設計軟件，設計siRNA序列，其中CXCR7-siRNA片段正義鏈5′-G GAAAGGAUCAUCUUCUCCATT-3′，反義鏈 5′-UAG GGAAGAAGAUGAUCUUCGG-3′，陰性對照siRNA片段正義鏈 5′-UUCUUCCGAACGUGUCACCGTT-3′，反義鏈 5′-ACGUUGACACGUUCGGAGGATT-3′。由南京金斯特公司合成雙鏈siRNA編碼序列。將M14細胞隨機分為實驗組、陰性對照組和空白對照組：實驗組轉染CXCR7-siRNA，陰性對照組轉染陰性對照siRNA，空白對照組不做任何處理。

5．細胞轉染：選擇對數(shù)生長期細胞接種于24孔板，按照Lipofectamine2000脂質體轉染試劑盒說明書進行轉染操作。細胞轉染后繼續(xù)孵育48 h后接種于培養(yǎng)瓶。1 000 mg/L的G418濃度為最終確定的篩選濃度，維持該濃度2周進行篩選。將篩選的細胞接種形成克隆，且尚未發(fā)生融合時，在熒光顯微鏡下挑取克隆，繼續(xù)培養(yǎng)于含G418 500 mg/L的培養(yǎng)基中。

6.實時定量PCR方法檢測M14細胞轉染前后CXCR7 mRNA的表達水平：首先應用Trizol試劑分別提取總RNA，測定總RNA的質量和濃度，吸光度比值（A260/A280）在1.9～2.1之間為合格，各樣本取大致等量的總RNA，按說明書推薦條件將其反轉錄為cDNA。引物設計和合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。CXCR7引物見上。內參照β肌動蛋白：上游引物5′-GAAGGATTCCTATGTGGG CGAC-3′，下游引物 5′-AGCCTGGATAGCAACGTA CATGG-3′，目的片段268 bp。PCR擴增目的基因片段，其反應條件為：95℃預變性2 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次，最后72℃再延伸10 min。得到的PCR產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，凝膠紫外線成像儀下觀察、拍照，檢驗各電泳條帶的灰度值，計算Gadd45a mRNA/β肌動蛋白mRNA比值。所有實驗均重復3次。

7.Western印跡實驗檢測M14細胞轉染前后CXCR7蛋白的表達水平：實驗分組同上，取3組實驗的對數(shù)生長期細胞，48 h后提取各組細胞總蛋白，實驗步驟同前述。

8.Transwell實驗測定轉染對M14細胞侵襲能力的影響：在每個Transwell小室的多聚碳酸酯膜上鋪人工基底膜膠（Matrigel），制成人工基底膜。分別取對數(shù)生長期的實驗組、陰性對照組和空白對照組M14細胞，胰蛋白酶消化計數(shù)后，以無血清培養(yǎng)基調整濃度為0.6×106/ml，將Transwell小室置入24孔板中，在小室中加入無血清培養(yǎng)基，室溫放置2 h，在小室外部加入含10%血清的培養(yǎng)基500 μl，棄去小室內部的無血清培養(yǎng)基，加入300μl細胞懸液，孵育48h，并在下室中加入10μg/LCXCR7配體CXCL12，作用12 h后棄去小室內的上清并輕拭去小室內膜多聚碳酸脂膜上的細胞，小室置入含有500 μl染液的培養(yǎng)孔中染色20 min，顯微鏡下計數(shù)高倍（×200）視野下穿過小室的細胞數(shù)，每組實驗重復3次。

9.細胞劃痕法測定轉染前后細胞的遷移能力：制備轉染前后M14單層細胞后，用10 μl移液槍槍頭在單層細胞上呈“一”字劃痕，用PBS清洗3次，孵育24 h后換成含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液，孵育24 h后，吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次后，在高倍鏡下計數(shù)遷移到劃痕區(qū)的細胞數(shù)目。

10.統(tǒng)計學分析：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，作方差齊性檢驗，采用方差分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)，組間比較采用LSD檢測，以P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、CXCR7在黑素瘤細胞中的表達

CXCR7蛋白在M14和A375細胞中均有表達，其表達值分別為0.649±0.008、0.288±0.004，因此本實驗選擇CXCR7蛋白表達較高的M14細胞用于后續(xù)實驗研究（圖1）。

圖1 黑素瘤細胞株M14和A375中CXCR7蛋白表達情況

二、siRNA轉染后M14細胞內CXCR7基因、蛋白表達

經(jīng)過G418篩選和單克隆挑選后，表達綠色熒光蛋白的細胞達到95%以上，轉染空質?；蜣D染帶有shRNA片段的質粒對細胞形態(tài)幾乎無影響。

干擾后實驗組中CXCR7 mRNA的相對表達量為0.412±0.023，陰性對照組1.211±0.117，空白對照組1.000±0.102，3組間差異有統(tǒng)計學意義（F=30.068，P=0.001）。組間比較顯示，實驗組與陰性對照組和空白對照組間差異均有統(tǒng)計學意義（P值分別為 0.000、0.002）。

干擾后3組細胞均不同程度表達CXCR7，實驗組CXCR7蛋白表達強度為0.144±0.005，陰性對照組為1.000±0.002，空白對照組為1.016±0.004，3組間差異有統(tǒng)計學意義（F=11 485.5，P=0.000）。組間比較顯示，實驗組與陰性對照組和空白對照組間差異均有統(tǒng)計學意義（P值均為0.000）。見圖2。

圖2 免疫印跡法檢測shRNA干擾后3組黑素瘤細胞株M14細胞CXCR7蛋白表達

三、CXCR12/CXCR7對黑素瘤細胞M14細胞侵襲和遷移的影響

1.siRNA干擾對M14細胞侵襲能力的影響：Transwell小室實驗顯示，在10 μg/L CXCL12趨化下，每高倍（×200）視野下遷移穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)在實驗組為20.617±1.503，陰性對照組為42.000±6.018，空白對照組為43.627±2.152，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=32.416，P=0.001）。組間比較顯示，實驗組與陰性對照組和空白對照組間差異均有統(tǒng)計學意義（P值分別為0.001、0.000）。

2.特異性沉默CXCR7對人黑素瘤細胞M14遷移能力的影響：體外培養(yǎng)轉染后的M14細胞，在10μg/L CXCL12趨化下，單層細胞劃痕24 h后，實驗組細胞遷移數(shù)為15.00±1.10，陰性對照組為44.90±2.20，而空白對照組為45.30±2.30，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=2 411.945，P=0.000）。組間比較顯示，實驗組與陰性對照組和空白對照組間差異均有統(tǒng)計學意義（P值均為0.000）。

討 論

研究表明，黑素瘤細胞系存在多種趨化因子受體及配體共表達［2］。趨化因子與瘤細胞表面受體結合后參與黑素瘤血管形成、瘤細胞生長、侵襲、轉移等惡性過程［3］。其中黑素瘤細胞表面表達CXCR4受體與原位黑素瘤表面潰瘍形成、浸潤深度及致死率增高有關［4］。免疫組化染色顯示，CXCR3在原發(fā)性侵襲性黑素瘤中表達，且CXCR3陽性瘤細胞浸潤深度＞1 mm［5］。體外實驗研究顯示，鼠黑素瘤B16F10細胞表達CXCR3及其配體CXCL9、CXCL10，可導致肌動蛋白聚合、侵襲；趨化因子受體CCR7、CCR10、CXCR3和CXCR4高表達參與黑素瘤淋巴轉移。其中CCR10與黑素瘤定向轉移皮膚有關，CXCR3和CXCR4參與黑素瘤肺部定向轉移過程。Lee 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，CXCR7 與受體 CXCL12 結合后可導致正常人表皮黑素細胞CXCL12誘導的遷移過程。研究顯示，在黑素瘤瘤組織及黑素瘤細胞株A375和M14細胞中均存在CXCR7蛋白表達，提示CXCR7可能在黑素瘤生物學行為中發(fā)揮作用［1］。

CXCR7參與多種腫瘤生長、生存和轉移過程［7］。研究顯示，CXCR7 在乳腺癌［8］、胰腺癌［9］、甲狀腺乳頭狀癌［10］，前列腺癌［11］等多種腫瘤組織表達升高，并且靶向沉默肝癌、結腸癌細胞株CXCR7表達后可有效抑制腫瘤細胞增殖和遷移能力［12-13］；與腫瘤分期、分級有關，可促進血管生成，參與腫瘤細胞與內皮細胞之間的黏附，增強瘤細胞侵襲力，促進腫瘤侵襲轉移。在前列腺癌中，缺氧誘導因子1a（HIF-1a）誘導CXCR7表達升高后，激活表皮生長因子受體（EGFR）信號轉導，促進癌細胞生長［14］。CXCR7 在多種人類髓系惡性細胞系中高表達，通過核因子κB（NF-κB）依賴性調節(jié)，導致絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）p42/44和蛋白激酶B磷酸化，促進細胞黏附和遷移［15］。

我們通過RNA干擾技術阻斷黑素瘤M14細胞表達CXCR7，進而觀察干擾后細胞侵襲、轉移相關生物學行為的變化。首先利用免疫印跡技術檢測2株黑素瘤細胞CXCR7蛋白表達量，實驗證實，M14細胞株表達上調明顯，故選擇M14細胞作為后續(xù)實驗。利用RNAi干擾技術后觀察到細胞表達CXCR7基因和蛋白量均明顯下調。Transwell小室實驗及細胞劃痕實驗結果均顯示，CXCR7-shRNA干擾組到達聚碳酸酯膜下表面的細胞數(shù)較兩個對照組均明顯下降，表明干擾后在CXCL12趨化下細胞遷移能力明顯下降。因此推測，CXCR7參與M14細胞侵襲遷移過程以及黑素瘤的惡性侵襲過程。關于CXCR7與其配體結合后激活的具體信號轉導通路及相關分子作用機制以及與其他趨化因子受體信號通路之間的交互作用等方面的研究還有待深入。

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Effects of RNA interference targeting the chemokine receptor 7 gene on the invasion and migration of the human melanoma cell line M14

Liu Pai*,Tian Weiwei,Li Xiaojing,Li Zhifeng,Yan Xia,Sun Jianfang.*Department of Dermatology,Jiangxi Province Dermatosis Special Hospital,Nanchang 330001,China

ObjectiveTo explore the effects of targeted silencing of the chemokine receptor 7 （CXCR7）gene on the invasion and migration of the melanoma cell line M14.MethodsWestern-blot analysis was performed to determine the protein expression of CXCR7 in melanoma cell lines M14 and A375,and CXCR7-overexpressing M14 cells were used in this study.Cultured M14 cells were divided into three groups:experimental group transfected with a small interfering RNA（siRNA）targeting CXCR7（CXCR7-siRNA）,negative control group transfected with a negative control siRNA,blank control group receiving no treatment.Real-time quantitative PCR and Western-blot analysis were conducted to determine the mRNA and protein expressions of CXCR7 respectively in M14 cells,Transwell chambers were used to evaluate the invasive activity of M14 cells,and wound healing assay to estimate the migratory activity of M14 cells.ResultsThe experimental group showed significantly decreased mRNA and protein expressions of CXCR7 compared with the negative control group and blank control group（CXCR7 mRNA:0.412±0.023 vs.1.211±0.117 and 1.000±0.102,F=30.068,P=0.001;CXCR7 protein:0.144±0.005 vs.1 and 1.016±0.004,F=11 485.5,P=0.000）.The number of M14 cells crossing the polycarbonate membrane per high-power field（×200）was significantly smaller in the experimental group than in the negative control group and blank control group（20.617±1.503 vs.42.000±6.018 and 43.627 ± 2.152,F=32.416,P=0.001）.Similarly,the number of migrating M14 cells in wound healing assay was significantly decreased in the experimental group compared with the negative control group and blank control group（15.00±1.10 vs.44.90±2.20 and 45.30±2.30,F=2 411.945,P=0.000）.ConclusionTargeted silencing of the CXCR7 gene can significantly inhibit the invasion and migration of M14 cellsin vitro,which may provide a potential target for the treatment of cutaneous melanoma.

Melanoma,experimental;Receptors,CXCR7;RNA interference;Neoplasm invasiveness;Cell migration assays

s:Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com;Li Xiaojing,Email:zlmdsh@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.12.007

孫建方，Email：fangmin5758@aliyun.com；李小靜，Email：zlmdsh@126.com

2015-02-05）

（本文編輯：尚淑賢）