β聯(lián)蛋白對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖活性及凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

田黎明 謝紅付 李吉 楊婷 彭圓 胡威

·論著·

β聯(lián)蛋白對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖活性及凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax表達(dá)的影響

田黎明 謝紅付 李吉 楊婷 彭圓 胡威

目的 觀察高表達(dá)的β聯(lián)蛋白對(duì)過(guò)氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)衰老人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）增殖活性以及凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax表達(dá)的影響。方法 實(shí)驗(yàn)分3組。HSF細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-β聯(lián)蛋白或空載體pcDNA3.1，然后150 μmol/L H2O2處理2 h。噻唑藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平，RTPCR和Western印跡分析凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax的表達(dá)。結(jié)果 HSF+空載體組、HSF+空載體+H2O2組、HSF+β聯(lián)蛋白+H2O2組細(xì)胞增殖活性分別為0.792±0.012、0.462±0.012、0.521±0.015，細(xì)胞凋亡率分別為（3.407±0.217）%、（24.555±1.793）%、（15.360±0.755）%，各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。HSF+空載體+H2O2組Bcl-2 mRNA和蛋白水平（與GAPDH mRNA和蛋白的比值分別為0.333±0.003和0.336±0.004）明顯低于HSF+空載體組（分別為0.507±0.013和0.514±0.021），兩組比較，均P＜0.01。HSF+β聯(lián)蛋白+H2O2組Bcl-2 mRNA和蛋白水平分別為0.404±0.006和0.411±0.005明顯高于HSF+空載體+H2O2組，兩組比較，均P＜0.01。HSF+空載體+H2O2組Bax mRNA和蛋白水平（與GAPDH mRNA和蛋白的比值分別為0.451±0.002和0.460±0.008）明顯高于HSF+空載體組，兩組比較，均P＜0.01。HSF+β聯(lián)蛋白+H2O2組Bax mRNA和蛋白水平（分別為0.339±0.012和0.346±0.013）明顯低于HSF+空載體+H2O2組，兩組比較，均P＜0.01。結(jié)論 高表達(dá)的β聯(lián)蛋白能夠提高衰老人皮膚成纖維細(xì)胞增殖活性。

成纖維細(xì)胞；細(xì)胞衰老；β聯(lián)蛋白；細(xì)胞凋亡；基因，Bcl-2；基因，Bax

β聯(lián)蛋白（β-catenin）是經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路的下游效應(yīng)器。研究發(fā)現(xiàn)，β聯(lián)蛋白在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡和衰老方面有著重要的作用［1-3］。本課題前期［4］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，β 聯(lián)蛋白在過(guò)氧化氫（H2O2）所致的人皮膚成纖維細(xì)胞（HSF）衰老中的表達(dá)明顯下調(diào)；β聯(lián)蛋白能夠抑制細(xì)胞衰老相關(guān)β-半乳糖甘酶（SA-β-gal）和細(xì)胞活性氧（ROS）的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)SOD的活性［5］，推測(cè)β聯(lián)蛋白可能具有抗細(xì)胞衰老的作用。我們進(jìn)一步研究高表達(dá)的β聯(lián)蛋白對(duì)H2O2所致衰老的HSF增殖活性以及凋亡相關(guān)基因B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān) x蛋白（Bax）表達(dá)的影響，探討β聯(lián)蛋白對(duì)衰老成纖維細(xì)胞增殖活性和凋亡相關(guān)基因的調(diào)節(jié)作用。

資料與方法

一、資料

T-Gradient Thermoblock PCR儀產(chǎn)自德國(guó)Denver公司，凝膠影像分析系統(tǒng)Jeldoc 2000型產(chǎn)自美國(guó)BioRad公司，Synergy H4全功能酶標(biāo)儀產(chǎn)自美國(guó)BioTek公司，流式細(xì)胞儀產(chǎn)自德國(guó)Miltenyi Biotec GmbH公司，抗Bcl-2單抗、抗bax單抗、抗GAPDH單抗產(chǎn)自美國(guó)Santa Cruz生物公司。

二、方法

1.HSF分離與培養(yǎng)［4］：小兒包皮獲得HSF，DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清（FBS）培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合后0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）1∶1消化傳代擴(kuò)增，取2～4代HSF用于試驗(yàn)。

2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)［5］。

3.H2O2處理HSF誘導(dǎo)衰老模型：實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)［5］。

4.實(shí)驗(yàn)分組：轉(zhuǎn)空載體組（HSF+空載體）、轉(zhuǎn)空載體H2O2處理組（HSF+空載體+H2O2）以及轉(zhuǎn)β聯(lián)蛋白H2O2處理組（HSF+β聯(lián)蛋白+H2O2）。

5.噻唑藍(lán)（MTT）測(cè)定細(xì)胞增殖活性：轉(zhuǎn)染前后的HSF細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，各實(shí)驗(yàn)組在5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)70%以上時(shí)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組未經(jīng)H2O2處理。然后每孔加入MTT 溶液（5 g/L）20 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。用Synergy H4全功能酶標(biāo)儀，波長(zhǎng)在570 nm處，測(cè)定各孔的吸光度（A值），以示細(xì)胞增殖活性情況。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)：培養(yǎng)24 h后收集轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞，4℃PBS洗滌細(xì)胞2次，棄上清，加結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，取100 μl細(xì)胞懸液到5 ml管中，每管加Annexin V FITC和PI各5 μl混勻，室溫避光 5 min，加 400 μl結(jié)合緩沖液，0.5 h 內(nèi)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

7.RT-PCR檢測(cè)HSF中Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)：Trizol抽提細(xì)胞總RNA，RT-PCR分別檢測(cè)Bcl-2 Bax在各實(shí)驗(yàn)組HSF中mRNA的表達(dá)。根據(jù)在線引物設(shè)計(jì)軟件（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）設(shè)計(jì)的Bcl-2 基因，正向引物：5′-GCCTCTGTTTGATTTCTCC T-3′；反向引物：5′-TCACTTGTGGCCCAGATAGG-3′Bax基因，正向引物：5′-CTGAGCAGATCATGAAGAC A-3′；反向引物：5′-CTCTGCAGCTCCATGTTACT-3′內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）基因，正向引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′；反向引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)［4］。用凝膠分析系統(tǒng)掃描拍照檢測(cè)各電泳條帶的灰度值（Bcl-2/GAPDH比值、Bax/GAPDH比值），得到Bcl-2、BaxmRNA的相對(duì)含量。

8.Western印跡檢測(cè)HSF中Bcl-2、Bax蛋白的水平：Western印跡方法參照文獻(xiàn) ［4］。在冰上用PIPA溶解細(xì)胞，旋轉(zhuǎn)使細(xì)胞充分破碎，離心后的上清分裝到0.5 ml離心管中，測(cè)蛋白濃度或放于-70℃保存。取蛋白樣品加入5×變性上樣緩沖液，100 V電壓跑膠，轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫振蕩封閉1 h。加入一抗（Bcl-2 1 ∶200或 Bax 1∶200；GAPDH 1 ∶3 000）4℃過(guò)夜，TTBS洗膜，10 min×3次，加入二抗（HRP 1∶10 000），室溫振蕩孵育1 h。在PVDF膜上均勻的涂抹化學(xué)發(fā)光底物，保持2 min。采用凝膠成像分析軟件分析，記錄每條蛋白電泳帶的灰度值。

9.統(tǒng)計(jì)分析：所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)結(jié)果

HSF+空載體+H2O2組較HSF+空載體組細(xì)胞增殖活性明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；HSF+β聯(lián)蛋白+H2O2組較HSF+空載體+H2O2組細(xì)胞增殖活性明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

二、各組細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果

HSF+空載體組細(xì)胞凋亡率是（3.407±0.217）%，HSF+空載體 +H2O2組細(xì)胞凋亡率是（24.555±1.793）%，HSF+β聯(lián)蛋白 +H2O2組細(xì)胞凋亡率是（15.360±0.755）%。HSF+空載體+H2O2組較HSF+空載體組細(xì)胞凋亡率明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。HSF+β聯(lián)蛋白+H2O2組較HSF+空載體+H2O2組細(xì)胞凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

三、各組HSF中Bcl-2、Bax的表達(dá)

HSF+空載體 +H2O2組較HSF+空載體組Bcl-2的表達(dá)水平明顯下調(diào)，而B(niǎo)ax水平明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。HSF+β聯(lián)蛋白+H2O2組較HSF+空載體+H2O2組Bcl-2的表達(dá)水平明顯上升，而B(niǎo)ax水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表2。

討 論

研究表明，氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性降低，引起細(xì)胞凋亡加速，導(dǎo)致細(xì)胞衰老。抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，可以提高細(xì)胞增殖活性，降低細(xì)胞凋亡，延緩細(xì)胞衰老［6-8］。在本實(shí)驗(yàn)及我們既往的研究中發(fā)現(xiàn)，H2O2所致的人皮膚成纖維細(xì)胞衰老模型中，氧化應(yīng)激水平（ROS活性）增高，衰老的人皮膚成纖維細(xì)胞增殖活性較正常人皮膚成纖維細(xì)胞增殖活性明顯降低，且細(xì)胞凋亡率較前明顯上調(diào)；轉(zhuǎn)染β聯(lián)蛋白后，氧化應(yīng)激反應(yīng)受到一定的抑制，ROS以及細(xì)胞凋亡率明顯下調(diào)，細(xì)胞增殖活性明顯提高，且延緩了細(xì)胞衰老表型［4-5］。

表1 各實(shí)驗(yàn)組人皮膚成纖維細(xì)胞活性（±s）

表1 各實(shí)驗(yàn)組人皮膚成纖維細(xì)胞活性（±s）

注：n=3，v=4。a：HSF+空載體+H2O2組與HSF+空載體組比較，P＜0.01；b：HSF+β 聯(lián)蛋白 +H2O2組與 HSF+空載體 +H2O2組比較，P＜0.01

組別 細(xì)胞活性（A值）HSF+空載體 0.792±0.012 HSF+空載體+H2O2 0.462±0.012a HSF+β聯(lián)蛋白+H2O2 0.521±0.015b

Bcl-2蛋白家族調(diào)控著內(nèi)源性的線粒體凋亡通路，是抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，參與細(xì)胞衰老［9］。Bcl-2基因的過(guò)表達(dá)有助于受損細(xì)胞的克隆修復(fù)，防止細(xì)胞程序性死亡，從而維持細(xì)胞永生化［10］。Bax是內(nèi)在凋亡途徑中的一個(gè)關(guān)鍵的促凋亡分子，其插入到線粒體膜觸發(fā)釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而導(dǎo)致細(xì)胞色素 C、caspase 活化和隨后的細(xì)胞凋亡［11］，Bax 蛋白的過(guò)度表達(dá)可加速細(xì)胞凋亡［12］。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，β聯(lián)蛋白通過(guò)對(duì)Akt通路和Bcl-2家族成員的促凋亡蛋白Bax的影響，來(lái)調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的凋亡［13］。另一學(xué)者通過(guò)對(duì)胸腺細(xì)胞中β聯(lián)蛋白和Bax的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，β聯(lián)蛋白抗凋亡的部分原因是因?yàn)檎{(diào)控了 Bax 的表達(dá)［14］。Wang 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào) β 聯(lián)蛋白可以靶向抑制Bax介導(dǎo)的線粒體膜的損傷，以及減輕生理應(yīng)激所致的腎上皮細(xì)胞凋亡。我們的研究與國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究較為一致，結(jié)果表明，在人皮膚細(xì)胞衰老模型中，抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)較對(duì)照組明顯下調(diào)，促凋亡基因Bax的活性較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，可見(jiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)了細(xì)胞衰老和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染β聯(lián)蛋白后，抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)明顯上調(diào)，促凋亡基因Bax的活性明顯被抑制，同時(shí)調(diào)控了衰老相關(guān)表型［5］。推測(cè)，β聯(lián)蛋白可能是通過(guò)上調(diào)凋亡基因Bcl-2的表達(dá)以及抑制促凋亡基因Bax的活性，來(lái)影響衰老的人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡的。然而，β聯(lián)蛋白調(diào)控衰老的人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡確切的細(xì)胞因子，可能的信號(hào)通路以及β聯(lián)蛋白調(diào)控人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡與延緩人皮膚成纖維細(xì)胞衰老間的相互關(guān)系，尚待進(jìn)一步研究。

圖1 HSF細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖。HSF+空載體+H2O2組與HSF+空載體組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01；HSF+β聯(lián)蛋白+H2O2組與HSF+空載體+H2O2組比較，P＜0.01

表2 HSF轉(zhuǎn)染前后Bcl-2、Bax mRNA和蛋白水平（±s）

表2 HSF轉(zhuǎn)染前后Bcl-2、Bax mRNA和蛋白水平（±s）

注：n=3，v=4。a：HSF+空載體+H2O2組與HSF+空載體組比較，P＜0.01；b：HSF+β聯(lián)蛋白+H2O2組與HSF+空載體+H2O2組比較，P＜0.01

組別 Bcl-2/GAPDH mRNA Bax/GAPDH mRNA Bcl-2/GAPDH蛋白 Bax/GAPDH蛋白HSF+空載體 0.507±0.013 0.303±0.005 0.514±0.021 0.320±0.013 HSF+空載體+H2O2 0.333±0.003a 0.451±0.002a 0.336±0.004a 0.460±0.008a HSF+β聯(lián)蛋白+H2O2 0.404±0.006b 0.339±0.012b 0.411±0.005b 0.346±0.013b

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“中國(guó)中藥杯”全國(guó)皮膚鏡攝影賽暨病例征集賽征稿通知

為了促進(jìn)皮膚鏡在我國(guó)的應(yīng)用，提高臨床診斷水平，促進(jìn)中國(guó)皮膚科事業(yè)發(fā)展，中華醫(yī)學(xué)會(huì)皮膚性病學(xué)分會(huì)皮膚病數(shù)字化診斷亞學(xué)組與中國(guó)中藥有限公司共同舉辦以“鏡善鏡美”為主題的“中國(guó)中藥杯”全國(guó)皮膚鏡攝影賽暨病例征集賽。

一、征集內(nèi)容：包含皮膚鏡照片（臨床皮膚病照片、皮膚鏡照片各一張）及配套病例。

二、作品要求：個(gè)人原創(chuàng)作品；內(nèi)容圍繞皮膚科病例的主旨，主題明確，內(nèi)容健康。

三、投稿郵箱和截止時(shí)間：投稿郵箱pifujing@163.com，截止時(shí)間：2015年6月30日。

四、獎(jiǎng)品設(shè)置：一等獎(jiǎng)：1名，便攜式皮膚鏡一臺(tái)（價(jià)值10 000元）；二等獎(jiǎng)：2名，便攜式皮膚鏡一臺(tái)（價(jià)值6 500元）；三等獎(jiǎng)3名，皮膚放大鏡一臺(tái)（價(jià)值2 500元）。所有參賽人員均可獲得紀(jì)念禮品，決賽于2015年7月中華醫(yī)學(xué)會(huì)第二十一次皮膚性病學(xué)術(shù)年會(huì)期間舉行，優(yōu)秀作品可在年會(huì)展出。

詳細(xì)投稿須知及賽程安排可登陸中華醫(yī)學(xué)會(huì)皮膚性病學(xué)分會(huì)網(wǎng)站http://csd.cma.org.cn/查詢(xún)。

北京協(xié)和醫(yī)院皮膚科招收進(jìn)修醫(yī)師通知

北京協(xié)和醫(yī)院皮膚科常年接受全國(guó)各省市三級(jí)以上醫(yī)院皮膚科醫(yī)師進(jìn)修學(xué)習(xí)。條件如下：臨床進(jìn)修醫(yī)師必須具備正規(guī)醫(yī)學(xué)院校本科及以上學(xué)歷（不包括續(xù)本），具備醫(yī)師資格證書(shū)和醫(yī)師執(zhí)業(yè)證書(shū)以及從事3年以上臨床工作;每年招收兩期；報(bào)到時(shí)間為每年的3月和9月，進(jìn)修期限為半年或一年。在北京協(xié)和醫(yī)院官網(wǎng)-醫(yī)學(xué)教育-進(jìn)修國(guó)際合作頁(yè)面下載相關(guān)表格。郵寄紙質(zhì)版進(jìn)修申請(qǐng)表（加蓋醫(yī)院公章）至北京市東城區(qū)帥府園1號(hào)，北京協(xié)和醫(yī)院教育處，郵編100730，聯(lián)系電話010-69156878；信息表發(fā)送至電子郵箱xiehejinxiu@163.com。

Effects of β-catenin on the proliferative activity of and expressions of two apoptosis-related genes Bcl-2 and Bax by human skin fibroblasts induced by hydrogen peroxide

Tian Liming,Xie Hongfu,Li Ji,Yang Ting*,Peng Yuan,Hu Wei.*Affiliated Nanhua Hospital,University of South China,Hengyang 421002,Hunan,China

ObjectiveTo investigate the effect of highly expressed β-catenin on the proliferative activity of and expressions of two apoptosis-related genes Bcl-2 and Bax by human skin fibroblasts induced by hydrogen peroxide（H2O2）.MethodsNormal human skin fibroblasts （HSFs）from child foreskin were divided into three groups:empty vector group transfected with the empty vector pcDNA3.1,H2O2group transfected with the empty vector pcDNA3.1 followed by treatment with H2O2（150 μmol/L）for 2 hours,β-catenin group transfected with pcDNA3.1-β-catenin followed by treatment with H2O2（150 μmol/L）for 2 hours.Subsequently,methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）assay was conducted to estimate proliferative activity of fibroblasts,flow cytometry to detect cell apoptosis,and reverse transcription （RT）-PCR and Western blot were performed to measure the mRNA and protein expressions of Bcl-2 and Bax respectively.The relative expression levels of genes were expressed as the ratios between the targets and GAPDH.ResultsSignificant differences were found between the empty vector group,H2O2group and β-catenin group in cellular proliferative activity（expressed as absorbance value at 570 nm:0.792±0.012 vs.0.462±0.012 vs.0.521±0.015,P＜0.01）and apoptosis rate（3.407%±0.217%vs.24.555% ±1.793%vs.15.360%±0.755%,P＜0.01）.Both mRNA and protein expression levels of Bcl-2 were significantly lower in the H2O2group（0.333±0.003 and 0.336±0.004 respectively）than in the empty vector group（0.507±0.013 and 0.514±0.021,respectively,bothP＜ 0.01）and β-catenin group（0.404±0.006 and 0.411±0.005,respectively,bothP＜0.01）.Increased expression levels of Bax mRNA and protein were observed in the H2O2group compared with the empty vector group and β-catenin group（mRNA:0.451±0.002 vs.0.303±0.005 and 0.339±0.012,protein:0.460±0.008 vs.0.320±0.013 and 0.346±0.013,allP ＜ 0.01）.ConclusionHigh expression of β-catenin can raise proliferative activity of aging HSFs.

Fibroblasts;Cell aging;β-catenin;Apoptosis;Genes,Bcl-2;Genes,Bax

Tian Liming，Email：jolly521@126.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.02.013

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（81101212）；湖南省自然科學(xué)衡陽(yáng)聯(lián)合基金（10JJ9018）；湖北省自然科學(xué)基金（2012FFC083）；中國(guó)皮膚科醫(yī)師協(xié)會(huì)-寶潔基金（2010CDA-P&G04）；中國(guó)皮膚科醫(yī)師協(xié)會(huì)-復(fù)旦張江光動(dòng)力基金（2012CDA-FDZJ01）；武漢市衛(wèi)生局科學(xué)基金（WX12B20）；南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院院內(nèi)科研課題（10nyz01）

421002湖南衡陽(yáng)，南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院［田黎明（現(xiàn)在華中科技大學(xué)附屬武漢市第一醫(yī)院皮膚科，430022武漢）、楊婷、胡威］；中南大學(xué)湘雅醫(yī)院皮膚科（謝紅付、李吉）；湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（彭圓）

田黎明，Email：jolly521@126.com

2014-06-05）

（本文編輯：吳曉初）