Netherton綜合征一例SPINK5基因突變研究

許桂文 尹菁華 汪慧君 周云 張潔 陳官芝 林志淼 楊勇 湯占利

·論著·

Netherton綜合征一例SPINK5基因突變研究

許桂文 尹菁華 汪慧君 周云 張潔 陳官芝 林志淼 楊勇 湯占利

目的 檢測Netherton綜合征患者SPINK5基因的突變情況。方法 收集患者臨床資料，提取患者及其相關親屬外周血DNA，用PCR擴增SPINK5基因編碼區(qū)的全部外顯子及其側翼序列并測序。結果直接測序發(fā)現(xiàn)患者SPINK5基因的第13號外顯子中的第1111位堿基發(fā)生C→T雜合突變（c.1111C＞T），導致其編碼第371位氨基酸變?yōu)榻K止密碼子（p.R371X）；第32號外顯子中的第3121位堿基發(fā)生C→T雜合突變（c.3121C＞T），導致其編碼第1041位氨基酸發(fā)生錯義突變（p.R1041C），其健康父母為相應突變的雜合攜帶者，200例健康對照未見該突變。結論 SPINK5基因的p.R371X及p.R1041C復合雜合突變可能是引起該患者臨床表現(xiàn)的病因之一。

Netherton綜合征；基因，SPINK5；突變

Netherton綜合征（Netherton syndrome,NS,OMIM 256500）由Netherton于1958年首先命名，是一種嚴重的常染色體隱性遺傳性皮膚病，發(fā)病無性別及種族差異［1］。NS的臨床特征包括，迂回狀魚鱗病、套疊性脆發(fā)征（竹節(jié)狀發(fā)）及特應性體質［2］。NS的致病基因為編碼Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制因子（LEKTI）的SPINK5基因，該基因編碼的蛋白LEKTI作為一系列生物學通路的調節(jié)因子參與皮膚表皮分化、皮膚滲透屏障功能、炎癥及變態(tài)反應［3］。我們在臨床上收集到1例Netherton綜合征患者，檢測其SPINK5基因的突變情況。

資料與方法

一、病歷資料

患者男，24歲。出生40余天，頸、胸、腹部皮膚出現(xiàn)彌漫性紅斑、水皰，伴有瘙癢、少汗。水皰干燥后邊緣出現(xiàn)白色鱗屑。每年夏季加重，冬季好轉。隨年齡增長水皰減輕，但全身紅斑脫屑逐漸加重，伴反復的皮膚潮紅、劇烈瘙癢及少汗，且10個趾甲有逐漸增厚傾向，指甲無受累?；颊咦杂最^發(fā)和眉毛粗糙、干枯、易斷。曾在當?shù)蒯t(yī)院就診數(shù)次，涂抹外用藥（名稱不詳）后癥狀無明顯改善?；颊邔Ｎr和螃蟹過敏，否認哮喘或者過敏性鼻炎病史。否認父母近親結婚，家族中無類似疾病史（圖1）。體檢：頸、胸、腹、四肢、手足部位皮膚可見彌漫性、不規(guī)則形紅斑，周邊覆有白色圈領狀脫屑；10個趾甲不規(guī)則增厚；頭發(fā)略稀少，眉毛外側明顯稀疏，伴毛發(fā)粗糙、干燥（圖2～5）。

二、方法

1.DNA的提?。喝』颊摺⒒颊吒改负徒憬阋约?00例健康人（受試者來源于北京大學第一醫(yī)院皮膚科遺傳組DNA標本數(shù)據(jù)庫，所有標本均來自于健康人群，并且已簽署知情同意書）。外周血5 ml，2%乙二胺四乙酸抗凝，以低滲溶血以及酚－氯仿抽提法提取DNA。

2.PCR引物設計：根據(jù)SPINK5基因序列（來源于網站www.ensembl.org/index.html），利用Primer 3在線版（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0）設計32對特異性引物擴增患者SPINK5基因編碼區(qū)33個外顯子及其側翼序列，引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。

3.PCR反應體系及條件：PCR反應體系25μl，含基因組 DNA50ng，dNTP0.4mmol/L，MgCl22.0mmol/L，上下游引物各10 μmol/L，Taq DNA聚合酶2.5 U。反應條件：95℃預變性5 min后進行以下10個循環(huán)：94℃變性30 s，62℃退火30 s（每個循環(huán)后退火溫度降低0.5℃），72℃延伸45 s；接著進行35個循環(huán)：94℃變性 30 s，57℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，共45個循環(huán)，最后72℃延伸9 min，DNA擴增在Eppendorf Mastercycler Gradient PCR擴增儀（德國艾本德股份公司）上進行。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。所有PCR產物純化后送至北京天一輝遠生物科技有限公司測序。

結 果

以患者的基因組DNA為模板，所有32對引物在各自的條件下分別擴增出各自的產物，包括所有外顯子的編碼序列以及兩端至少60bp的側翼序列。所有擴增產物純化后測序結果與Ensembl網站所公布的序列進行對照，發(fā)現(xiàn)患者SPINK5基因13號外顯子中的第1111位核苷酸（從cDNA編碼起始位點ATG算起）發(fā)生C→T雜合突變（c.1111C＞T），導致其編碼第371位氨基酸發(fā)生無義突變（p.R371X），突變來自于父親。第32號外顯子中的第3121位核苷酸發(fā)生C→T雜合突變（c.3121C＞T），導致其編碼第1041位氨基酸發(fā)生錯義突變（p.R1041C），突變來自于母親，姐姐為c.3121C＞T突變攜帶者（圖6，7）所有突變均由反向測序得到驗證。200例健康人中未發(fā)現(xiàn)這兩種突變。光鏡下毛發(fā)呈“竹節(jié)樣”改變，在竹節(jié)處有套疊（圖5）。真菌鏡檢趾甲示真菌陽性。

圖1 患者家系圖

圖2 患者頭發(fā)粗糙，不易梳理，眉毛稀疏，部分脫落

圖3 小腿內側皮膚呈現(xiàn)典型的雙邊狀脫屑

圖4 手指背側皮膚出現(xiàn)大小不同、形狀不規(guī)則的紅斑，周邊覆有白色圈狀脫屑

圖5 光鏡下頭發(fā)呈“竹節(jié)樣”改變

圖6 Netherton綜合征患者SPINK5基因測序結果 患者第13號外顯子發(fā)生c.1111C＞T雜合突變（突變來自于父親）

圖7 第32號第32號外顯子發(fā)生c.3121C＞T雜合突變（突變來自于母親）

討 論

NS出生時一般表現(xiàn)為典型的先天性紅皮病，較重病例可表現(xiàn)為典型的迂回狀魚鱗病?；颊哳^發(fā)稀少、生長緩慢、細而尖且易斷，常于1歲后光鏡下表現(xiàn)為特征性的套疊性脆發(fā)征或竹節(jié)狀頭發(fā)。成年后病變范圍可局限化，但波動較大，可出現(xiàn)濕疹樣皮損，伴瘙癢，腘窩、肘窩出現(xiàn)苔蘚樣變。

NS的致病基因SPINK5基因包含33個外顯子，編碼的LEKTI蛋白分布于所有的復層上皮和Hassal胸腺小體內［4-6］。LEKTI含有 15 個 Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制結構域（D1-D15）［4］，可以抑制Kazal型絲氨酸蛋白酶，或參與體內蛋白水解級聯(lián)反應，被水解為小片段后行使其抑制功能。NS患者表皮內顆粒層和毛囊內根鞘的LEKTI表達水平下降，表皮內LEKTI的減少可導致緩激肽釋放酶5（KLK5）活性增強［7］。KLK5 可以通過 PAR-2 依賴性和PAR-2非依賴性途徑引發(fā)皮膚炎癥和過敏反應。KLK5活性增強在PAR-2依賴性途徑中可通過激活NF-κB信號通路，導致IgE增加，引發(fā)過敏反應，也可直接導致腫瘤壞死因子α、IL-8、I-CAM1等產生，可促進皮膚炎癥并加劇皮膚損傷。在PAR-2非依賴性途徑中，KLK5活性增強可促進 KLK7、KLK14及表皮蛋白酶ELA2的活性，這些蛋白酶在角質層脫落、表皮分化、中間絲相關蛋白加工及脂質代謝過程中起著作用［8］，其異?；顒佑绊懫つw內環(huán)境穩(wěn)定，導致皮膚屏障功能受損，引發(fā)臨床表現(xiàn)。

迄今為止，文獻已報道70余種SPINK5基因的不同突變，大部分為小片段替換、插入或缺失而導致的無義突變或移碼突變［7］。NS患者中大部分的無義突變導致終止密碼子的提前出現(xiàn)，介導其mRNA降解，使LEKTI蛋白完全無法表達。此外，也有學者報道一些剪切位點發(fā)生突變，而仍有部分LEKTI可以表達，則出現(xiàn)較輕的臨床表型［9-11］。本例患者SPINK5基因的突變?yōu)榈?3號外顯子中的第1111位堿基發(fā)生C→T雜合突變（c.1111C＞T），使其編碼第371位氨基酸發(fā)生無義突變（p.R371X），故可導致其編碼的LEKTI蛋白不能表達。第32號外顯子中的第3121位堿基發(fā)生C→T雜合突變（c.3121C＞T），使其編碼第1041位氨基酸發(fā)生錯義突變（p.R1041C），可導致LEKTI蛋白功能減低。該患者SPINK5基因的復合雜合突變可導致其編碼的LEKTI蛋白不能表達或功能減低，引起KLK5活性增強，從而引發(fā)皮炎和過敏反應，出現(xiàn)一系列臨床表現(xiàn)。p.R371X的突變位點已被國外文獻報道［12］，而p.R1041C屬新發(fā)突變。目前，對于NS尚缺乏治療方法，治療手段主要以營養(yǎng)支持治療和對癥治療為主，以預防脫水、生長遲緩及嚴重并發(fā)癥的出現(xiàn)。有文獻報道，少數(shù)嚴重NS患者注射免疫球蛋白和抗腫瘤壞死因子α單克隆抗體治療取得了明顯的療效［13-14］，但療效尚待進一步評價。

［1］Pruszkowski A,Bodemer C,Fraitag S,et al.Neonatal and infantile erythrodermas:a retrospective study of 51 patients ［J］.Arch Dermatol,2000,136（7）:875-880.

［2］石得仁,甘恒芳,紅霞.Netherton綜合征一例報告［J］.中華皮膚科雜志,1982,15（4）:251-252.

［3］Ovaere P,Lippens S,Vandenabeele P,et al.The emerging roles of serine protease cascades in the epidermis［J］.Trends Biochem Sci,2009,34（9）:453-463.

［4］M?gert HJ,St?ndker L,Kreutzmann P,et al.LEKTI,a novel 15-domain type of human serine proteinase inhibitor［J］.J Biol Chem,1999,274（31）:21499-21502.

［5］Chavanas S,Bodemer C,Rochat A,et al.Mutations in SPINK5,encoding a serine protease inhibitor,cause Netherton syndrome［J］.Nat Genet,2000,25（2）:141-142.

［6］Bitoun E,Micheloni A,Lamant L,et al.LEKTI proteolytic processing in human primary keratinocytes,tissue distribution and defective expression in Netherton syndrome［J］.Hum Mol Genet,2003,12（19）:2417-2430.

［7］Hovnanian A.Netherton syndrome:skin inflammation and allergy by loss of protease inhibition ［J］.Cell Tissue Res,2013,351（2）:289-300.

［8］Fortugno P,Bresciani A,Paolini C,et al.Proteolytic activation cascade of the Netherton syndrome-defective protein,LEKTI,in the epidermis:implications for skin homeostasis［J］.J Invest Dermatol,2011,131（11）:2223-2232.

［9］DescarguesP,DeraisonC,ProstC,etal.Corneodesmosomalcadherins are preferentialtargets ofstratum corneum trypsin- and chymotrypsin-like hyperactivity in Netherton syndrome［J］.J Invest Dermatol,2006,126（7）:1622-1632.

［10］Hachem JP,Wagberg F,Schmuth M,et al.Serine protease activity and residual LEKTI expression determine phenotype in Netherton syndrome［J］.J Invest Dermatol,2006,126（7）:1609-1621.

［11］Komatsu N,Saijoh K,Jayakumar A,et al.Correlation between SPINK5 gene mutations and clinical manifestations in Netherton syndrome patients［J］.J Invest Dermatol,2008,128（5）:1148-1159.

［12］Bitoun E,Chavanas S,Irvine AD,et al.Netherton syndrome:disease expression and spectrum of SPINK5 mutations in 21 families［J］.J Invest Dermatol,2002,118（2）:352-361.

［13］Renner ED,Hartl D,Rylaarsdam S,et al.Comèl-Netherton syndrome defined as primary immunodeficiency［J］.J Allergy Clin Immunol,2009,124（3）:536-543.

［14］Fontao L,Laffitte E,Briot A,et al.Infliximab infusions for Netherton syndrome:sustained clinical improvement correlates with a reduction of thymic stromal lymphopoietin levels in the skin［J］.J Invest Dermatol,2011,131（9）:1947-1950.

Mutation analysis of the SPINK5 gene in a patient with Netherton syndrome

Xu Guiwen*,Yin Jinghua,Wang Huijun,Zhou Yun,Zhang Jie,Chen Guanzhi,Lin Zhimiao,Yang Yong,Tang Zhanli.*Department of Dermatology,Peking University First Hospital,Beijing 100034,China

ObjectiveTo detect mutations in the SPINK5 gene in a patient with Netherton syndrome.MethodsClinical data were collected from a male patient with Netherton syndrome.Peripheral blood samples were obtained from the patient,his relatives and 200 healthy human controls.DNA was extracted from these samples,and PCR was performed to amplify all the exons and their flanking sequences in the coding region of the SPINK5 gene followed by DNA sequencing.ResultsDirect sequencing revealed a heterozygous nonsense mutation（c.1111C ＞ T）in exon 13 of the SPINK5 gene,which leads to the formation of a premature termination codon at amino acid position 371（p.R371X）,as well as a heterozygous mutation （c.3121C ＞ T）in exon 32 of the SPINK5 gene,which leads to a missense mutation at amino acid position 1041 （p.R1041C）,in the patient.His healthy parents were heterozygous carriers of the two mutations,whereas neither of the two mutations was found in the unrelated healthy controls.ConclusionThe composite heterozygous mutations p.R371X and p.R1041C in the SPINK5 gene may be partially responsible for the clinical manifestation of Netherton syndrome in this patient.

Netherton syndrome;Genes SPINK5;Mutation

Tang Zhanli,Email:tzldyx2012@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.02.008

山東省自然科學基金（ZR2013HM015）；青島市科技發(fā)展計劃（13-1-4-146-jch）

100034北京大學第一醫(yī)院皮膚科（許桂文、尹菁華、汪慧君、林志淼、楊勇）；山東大學齊魯醫(yī)院皮膚科（張潔、湯占利）；南昌大學第一附屬醫(yī)院皮膚科（周云）；青島大學附屬醫(yī)院皮膚科（陳官芝）

湯占利，Email:tzldyx2012@163.com

2014-05-21）

（本文編輯：吳曉初）