氟芬那酸丁酯抑制紫外線誘導(dǎo)皮膚急性光毒性作用的研究

郭建美 仲少敏 陶榮 苗曉琳 吳艷

·論著·

氟芬那酸丁酯抑制紫外線誘導(dǎo)皮膚急性光毒性作用的研究

郭建美 仲少敏 陶榮 苗曉琳 吳艷

目的 探討非甾體類(lèi)抗炎藥氟芬那酸丁酯（BT）對(duì)紫外線誘導(dǎo)皮膚急性光毒性反應(yīng)的抑制作用及可能的作用機(jī)制。方法 SKH-1無(wú)毛小鼠背部隨機(jī)編號(hào)分為6組，僅照光組、BT+照光組、照光+BT組、基質(zhì)+照光組、照光+基質(zhì)組、空白組。在處理后24 h收集各組皮膚標(biāo)本，HE染色，用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)caspase 3、p53、COX-2、PGER1、IL-1β、IL-6的表達(dá)量以及免疫熒光檢測(cè)caspase 3的表達(dá)量。結(jié)果 照光后24 h，與僅照光組相比，涂抹BT軟膏組皮膚水腫程度減輕，凋亡細(xì)胞的數(shù)目減少。實(shí)時(shí)PCR顯示：與空白組相比，僅照光組caspase 3、p53、COX-2、PGER1、IL-1β、IL-6均有升高（P ＜ 0.05）；BT 軟膏 + 照光組與僅照光組比較，caspase 3、p53、COX-2、PGER1、L-1β、IL-6表達(dá)明顯下調(diào)（P ＜ 0.05），照光 +BT 軟膏組僅 caspase 3、p53的表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）。免疫熒光檢測(cè)：僅照光組與空白組相比caspase 3表達(dá)明顯上調(diào)；與僅照光組比較，BT軟膏+照光組和照光+BT軟膏組caspase 3表達(dá)顯著下降。結(jié)論 BT可以部分抑制紫外線對(duì)于SKH-1無(wú)毛小鼠皮膚造成的急性光毒作用。

氟芬那酸；紫外線；光毒性皮炎；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

紫外線（UV）照射可以引發(fā)一系列的皮膚損害，表現(xiàn)為日曬傷、色素加深、曬黑、免疫抑制、以及光敏性皮膚病等［1］。我們前期［2］的試驗(yàn)表明，外用非甾體抗炎藥氟芬那酸丁酯（商品名布特，簡(jiǎn)稱(chēng)BT）有較好的預(yù)防紫外線誘導(dǎo)皮膚光毒性反應(yīng)的作用，尤其是在光照前給藥效果最好，作用優(yōu)于外用糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物和其他的外用非甾體抗炎藥。因此，我們對(duì)無(wú)毛小鼠外用BT探討其可能的光保護(hù)機(jī)制，以期為光線性皮膚病治療提供新的思路。

資料和方法

一、資料

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8只SKH-1雄性無(wú)毛小鼠購(gòu)自上海市公共衛(wèi)生臨床中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部（合格證號(hào)3100120502），6～8周齡，質(zhì)量30 g左右。飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)，20～24℃，給予普通飼料和水飼養(yǎng)。

2．實(shí)驗(yàn)藥物：5%氟芬那酸丁酯軟膏和氟芬那酸丁酯基質(zhì)均來(lái)自沈陽(yáng)同聯(lián)醫(yī)藥有限公司。

3.儀器：紫外線光療儀（SS-IB型，發(fā)射311 nm窄譜UVB）購(gòu)于德國(guó)Waldmann公司，Mastercycler gradient PCR儀購(gòu)于美國(guó)Eppendorf公司，實(shí)時(shí)CR儀購(gòu)于美國(guó)ABI公司，激光共聚焦顯微鏡購(gòu)于德國(guó)Leica公司。

4.試劑：總RNA提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)Bio-Tek公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Sybr Green Mix購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司，兔抗鼠caspase 3抗體購(gòu)于美國(guó)Biovision公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔抗體購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

5.引物序列：根據(jù)基因庫(kù)得到各基因的mRNA序列應(yīng)用Primer Express3.0軟件設(shè)計(jì)所檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)的引物（表1），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

二、方法

1.實(shí)驗(yàn)分組：將每只鼠的后背分為6個(gè)區(qū)域，隨機(jī)編號(hào)給予下列處理?？瞻捉M：不做任何處理，觀察24 h。僅照光組：UVB照射后觀察24 h；BT+照光組：先涂抹BT，UVB照射后觀察24 h；照光+BT：先在該區(qū)域進(jìn)行UVB照射，然后涂抹BT，觀察24 h；基質(zhì)+照光組：先涂抹BT基質(zhì),UVB照射后觀察24 h；照光+基質(zhì)組：先在該區(qū)域進(jìn)行UVB照射，然后涂抹BT基質(zhì)，觀察24 h。

2.給藥方式：BT軟膏和基質(zhì)劑量為2 mg/cm2。涂藥后30 min進(jìn)行UVB照射或UVB照射后30 min涂藥。因有基質(zhì)組作為對(duì)照，不用擦去藥物。

3.照射量：查閱文獻(xiàn) ［3］SKH-1無(wú)毛小鼠的MED值為UVB 160 mJ/cm2；紫外線光療儀距離小鼠被測(cè)皮膚保持為23 cm，劑量1 440 mJ/cm2（9 MED）。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。多組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列

結(jié) 果

一、UVB照射后各組小鼠皮膚的大體表現(xiàn)

UVB照射小鼠皮膚后24 h，肉眼觀察各組表現(xiàn)，見(jiàn)圖1。與空白組（C）相比，其余5組均表現(xiàn)出不同程度的水腫，未見(jiàn)明顯紅斑。而B(niǎo)T+照光組（A）和照光+BT組（B）水腫程度顯著比其余3組輕。

二、UVB照射后各組小鼠皮膚的HE表現(xiàn)

UVB照射后24 h，各組小鼠皮膚進(jìn)行HE染色，見(jiàn)圖2。與空白組（2A）相比，僅照光組（2B）可見(jiàn)多個(gè)凋亡細(xì)胞（箭頭，表現(xiàn)為嗜酸性胞質(zhì)，核固縮）其余各組少見(jiàn)凋亡細(xì)胞。僅照光組（2B）和基質(zhì)組（2E，2F）表皮細(xì)胞有不同程度的水腫。

三、皮膚組織的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)

1.caspase 3的mRNA相對(duì)表達(dá)量：與空白組（1.04±0.42）相比，僅照光組 caspase 3（1.97±0.32）表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；BT+照光組（0.89±0.28）、照光+BT組（1.14±0.4）分別與僅照光組相比，caspase 3表達(dá)顯著下降（P＜0.05）。

圖1 UVB照射后24 h各組小鼠皮膚的表現(xiàn) A：氟芬那酸丁酯（BT）+照光組：水腫反應(yīng)不明顯；B：照光+BT組：水腫反應(yīng)不明顯；C：空白組：無(wú)水腫反應(yīng)；D：基質(zhì)+照光組：明顯水腫反應(yīng)；E：照光+基質(zhì)組：明顯水腫反應(yīng)；F：僅照光組：明顯水腫反應(yīng)

圖2 UVB照射后各組小鼠皮膚表現(xiàn)（HE×400） 2A：空白組：表皮細(xì)胞無(wú)水腫，未見(jiàn)凋亡細(xì)胞；2B：僅照光組：表皮細(xì)胞明顯水腫，見(jiàn)多個(gè)凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為嗜酸性胞質(zhì)，核固縮（箭頭）；2C：氟芬那酸丁酯（BT）+照光組：表皮細(xì)胞無(wú)明顯水腫，未見(jiàn)凋亡細(xì)胞；2D：照光+BT組：表皮細(xì)胞無(wú)明顯水腫，未見(jiàn)凋亡細(xì)胞；2E：基質(zhì)+照光組：表皮細(xì)胞明顯水腫，凋亡細(xì)胞少見(jiàn)；2F：照光+基質(zhì)組：表皮細(xì)胞明顯水腫，凋亡細(xì)胞少見(jiàn)

2.p53mRNA相對(duì)表達(dá)量：與空白組（1.08±0.35）相比，僅照光組 p53（1.49±0.19）表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；BT+照光組（0.70±0.29）、照光 +BT組（0.90±0.43）分別與僅照光組相比，表達(dá)顯著下降（P＜0.05）。

3.COX-2、PGER1、IL-1β 和 IL-6 的mRNA相對(duì)表達(dá)量：與空白組相比，僅照光組COX-2、PGER1、IL-1β 和 IL-6 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；BT+照光組與僅照光組相比，表達(dá)明顯下降（P＜0.05）；照光+BT組與僅照光組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

四、皮膚活檢組織直接免疫熒光檢測(cè)

表皮內(nèi)caspase 3含量由直接免疫熒光進(jìn)行檢測(cè)。見(jiàn)圖3。與空白組相比，僅照光組表皮熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，說(shuō)明caspase 3表達(dá)明顯升高；與僅照光組相比，BT+照光組和照光+BT組表皮熒光強(qiáng)度明顯減弱，說(shuō)明caspase 3表達(dá)量有明顯下降。

討 論

UVB照射皮膚后的光毒性反應(yīng)，即皮膚日曬傷，表現(xiàn)為灼熱、疼痛、水腫和紅斑。UVB照射SKH-1無(wú)毛小鼠后雖然不會(huì)產(chǎn)生和人類(lèi)皮膚那樣明顯的紅斑反應(yīng)，但會(huì)表現(xiàn)為皮膚明顯水腫。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在接受紫外線照射前30 min涂抹BT時(shí)，可以明顯抑制UVB的這種急性光毒作用，該結(jié)果與我們前期［2］的試驗(yàn)結(jié)果一致，證明外用BT具有光保護(hù)作用。

表2 各組炎癥因子mRNA的表達(dá)情況（±s）

表2 各組炎癥因子mRNA的表達(dá)情況（±s）

注：n=8。與僅照光組比較，a：P ＜ 0.05；b：P ＞ 0.05

組別 僅照光組 空白組 布特+照光組 照光+布特組COX-2 mRNA 8.01±3.11 1.18±0.74a 1.05±0.37a 4.14±2.10b PGER1 mRNA 5.58±2.20 1.60±1.20a 1.62±1.20a 2.80±1.30b IL-1β mRNA 2.70±1.32 1.25±1.07a 1.40±0.91a 2.53±1.30b IL-6 mRNA 7.49±3.23 0.82±0.40a 1.27±0.61a 5.76±2.30b

圖3 各組caspase 3免疫熒光的表達(dá)情況 3A：空白組：表皮熒光信號(hào)強(qiáng)度弱，caspase 3表達(dá)量低；3B：僅照光組：表皮熒光信號(hào)強(qiáng)度強(qiáng)，caspase 3表達(dá)量高；3C：氟芬那酸丁酯（BT）+照光組：與僅照光組相比，表皮熒光信號(hào)強(qiáng)度較弱，caspase 3表達(dá)量明顯下降；3D：照光+BT組：與僅照光組相比，表皮熒光信號(hào)強(qiáng)度較弱，caspase 3表達(dá)量有明顯下降

UVB照射皮膚后主要發(fā)生凋亡和炎癥［4］，這些反應(yīng)是UVB導(dǎo)致光毒性反應(yīng)的主要機(jī)制。UVB可以直接損害細(xì)胞DNA，產(chǎn)生環(huán)丁烷嘧啶二聚體［5］，當(dāng)p53監(jiān)測(cè)到這種不良信號(hào)會(huì)啟動(dòng)核苷酸切除進(jìn)行修復(fù)［6］，如果修復(fù)失敗，則會(huì)啟動(dòng)caspase 3通路誘導(dǎo)這些細(xì)胞的凋亡，以保證因紫外線照射而產(chǎn)生的突變和損傷不被復(fù)制。本研究發(fā)現(xiàn)，不論在接受紫外線照射前后，涂抹BT都可以減少UVB引起的角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡，伴有p53和caspase 3等參與凋亡的基因表達(dá)下調(diào)。這一作用與文獻(xiàn)報(bào)道一致［7］，與黃芩苷的光保護(hù)作用機(jī)制也很相似［8］。紫外線照射皮膚后，角質(zhì)形成細(xì)胞會(huì)分泌大量細(xì)胞因子、化學(xué)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子等,可以引起細(xì)胞因子微環(huán)境的暫時(shí)性變化［9］。受損的角質(zhì)形成細(xì)胞不僅自身分泌前炎癥因子IL-1β，還會(huì)刺激鄰近的角質(zhì)形成細(xì)胞的分泌，擴(kuò)大反應(yīng)。IL-1β可以強(qiáng)效地刺激角質(zhì)形成細(xì)胞釋放前炎癥因子IL-6。IL-6不僅可以啟動(dòng)急性期炎癥反應(yīng)，還可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞向皮膚的趨化作用［10］。另外，環(huán)氧合酶2活化導(dǎo)致前列腺素2合成增加，前列腺素2是導(dǎo)致日曬傷特征性水腫和紅斑反應(yīng)的關(guān)鍵物質(zhì)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，UVB照射后環(huán)氧合酶2、前列腺素2的受體PGER1表達(dá)顯著升高；炎癥因子IL-1β和IL-6都明顯上調(diào)。而先涂抹BT軟膏30 min后再接受紫外線照射的小鼠，環(huán)氧合酶2和前列腺素2的表達(dá)量明顯下降，IL-1β和IL-6亦顯著下調(diào)。說(shuō)明BT軟膏可以通過(guò)抑制環(huán)氧合酶2，減少前列腺素2的釋放，還可減少炎癥因子IL-1β和IL-6的生成，從而抑制紫外線所誘導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)。該結(jié)果與Rodriguez-Burford等［11］研究結(jié)果一致。本研究和之前的［2］試驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，BT在紫外線照射前30 min使用光保護(hù)效果最好，而照射后再涂藥效果明顯減弱。

聲明 沈陽(yáng)同聯(lián)醫(yī)藥有限公司提供相應(yīng)藥品

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2015年復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科舉辦國(guó)家級(jí)繼續(xù)教育項(xiàng)目學(xué)習(xí)班通知

①真菌病研究新進(jìn)展：4月6-10日，Ⅰ類(lèi)學(xué)分10分。展示常見(jiàn)和少見(jiàn)真菌病的臨床圖片、診斷、治療和實(shí)驗(yàn)室檢查的新進(jìn)展；②性病艾滋病臨床診治進(jìn)展：4月20-24日，Ⅰ類(lèi)學(xué)分10分。為獲得性病艾滋病領(lǐng)域的新理論、新知識(shí)、新技術(shù)、新方法提供機(jī)會(huì)；③現(xiàn)代激光醫(yī)學(xué)技術(shù)在皮膚科應(yīng)用：5月4-8日，Ⅰ類(lèi)學(xué)分10分。主講激光基礎(chǔ)、激光治療色素性、血管性皮膚?。还庾幽勰w、除皺、準(zhǔn)分子激光、光動(dòng)力學(xué)療法；激光治療淺表腫瘤、脫毛、副作用的防治等；④皮膚病與性病學(xué)進(jìn)展：5月5-9日Ⅰ類(lèi)學(xué)分10分。主講各類(lèi)皮膚病的新理論、新技術(shù)、新療法，并組織疑難病例討論；⑤皮膚組織病理新進(jìn)展：5月11-17日，Ⅰ類(lèi)學(xué)分10分。講解皮膚組織結(jié)構(gòu)、組織發(fā)生及基本病變，各種常見(jiàn)皮膚病及皮膚腫瘤、皮膚淋巴瘤等疾病的組織病理改變，并包括有關(guān)疾病的新進(jìn)展、新內(nèi)容。結(jié)合上課內(nèi)容安排電腦彩色投影儀及多頭顯微鏡讀片、示教；⑥色素異常性皮膚?。?月25-29日Ⅰ類(lèi)學(xué)分10分。主講白癜風(fēng)、黃褐斑的診治以及光老化的診斷和治療；⑦皮膚外科暨毛發(fā)移植的新進(jìn)展：9月9-12日，Ⅰ類(lèi)學(xué)分10分。講解皮膚外科相關(guān)理念、皮膚良惡性腫瘤的治療、Mohs顯微描記手術(shù)的基本理論和基本技術(shù)、瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制及治療、黑素瘤的分期與治療、整形技術(shù)在皮膚外科的應(yīng)用、微整形注射美容的應(yīng)用、影像學(xué)在皮膚外科中的應(yīng)用、毛發(fā)移植的進(jìn)展、植發(fā)中心的運(yùn)作、毛發(fā)移植圍手術(shù)期護(hù)理等。以上各班學(xué)費(fèi)500～1200元不等，詳見(jiàn)正式通知。報(bào)名方式：上海市烏魯木齊中路12號(hào)，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科於卿璐收，郵編200040，聯(lián)系方式：13916291957或Email：185179591@qq.com。

Inhibitory effect of butyl flufenamate on ultraviolet-induced acute skin phototoxicity

Guo Jianmei,Zhong Shaomin,Tao Rong,Miao Xiaolin,Wu Yan.Department of Dermatology,Peking University First Hospital,Beijing 100034,China

ObjectiveTo evaluate the inhibitory effect of butyl flufenamate（BT）on ultraviolet（UV）-induced acute skin phototoxic reaction,and to investigate its possible mechanisms.MethodsEight SKH-1 hairless mice were included in this study.The back of each SKH-1 hairless mouse was divided into six regions,which were then randomly classified into six groups:blank group receiving no treatment,UV group receiving UV radiation only,BT+UV group and vehicle+UV group topically treated with BT ointment and vehicle respectively followed by UV radiation,UV+BT group and UV+vehicle group topically treated with BT ointment and vehicle respectively after UV radiation.Skin samples were obtained from these mice at 24 hours after treatment.Subsequently,hematoxylin-eosin（HE）staining was performed,real-time PCR was carried out to detect mRNA expressions of caspase-3,p53,COX-2,PGER1,interleukin（IL）-1β,IL-6,and an immunofluorescence assay was conducted to observe the expression of caspase-3.Statistical analysis was carried out by repeated-measures analysis of variance（ANOVA）.ResultsCompared with the UV group,both BT+UV group and UV+BT group showed a decrease in the degree of skin edema and number of apoptotic cells at 24 hours after UV radiation.Real-time PCR showed that the mRNA expressions of caspase-3,p53,COX-2,PGER1,IL-1β and IL-6 were significantly higher in the UV group than in the blank group （allP＜0.05）,but significantly lower in the BT+UV group than in the UV group （allP＜0.05）,and only the expressions of caspase-3 and p53 mRNAs were significantly decreased in the UV+BT group compared with the UV group （bothP＜0.05）.The immunofluorescence assay revealed that the expression of caspase-3 increased in the UV group compared with the blank group,but decreased in both BT+UV group and UV+BT group compared with the UV group.ConclusionBT could partially inhibit UV-induced acute skin phototoxicity in SKH-1 hairless mice.

Flufenamic acid;Ultraviolet rays;Dermatitis,phototoxic;Animal experimentation

Wu Yan,Email:adelewu@medmail.com.cn

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.02.011

100034北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科

吳艷，Email：adelewu@medmail.com.cn

2014-03-30）

（本文編輯：吳曉初）