DHA合成途徑中關鍵酶基因在畢赤酵母中的表達研究

李松巖， 徐搖光， 張曉東*

1.首都師范大學生命科學院，北京 100037;

2.北京市農(nóng)林科學院北京農(nóng)業(yè)生物技術研究中心，北京 100097

二十二碳六烯酸(DHA)是一種ω3系列的多不飽和脂肪酸，對人體健康有著十分重要的作用。DHA是神經(jīng)系統(tǒng)細胞生長及維持的一種重要元素，是大腦和視網(wǎng)膜的重要組成成分，對胎兒及嬰兒的智力和視力發(fā)育至關重要，因此又被稱為“腦黃金”［1］。DHA同時也是一種全世界比較稀缺的資源。它在人體內(nèi)參與磷脂的合成，是構成人體組織細胞的成分，對增強記憶力、保護視力有顯著作用，對嬰幼兒及青少年的生長發(fā)育有重要作用，同時有減弱炎癥，調(diào)節(jié)免疫，改善老年癡呆、精神分裂癥、抗過敏和衰老等多種功能，對降低血脂和防治心腦血管疾病也有作用［2，3］。

畢赤酵母表達系統(tǒng)是近年來建立起來的一種真核表達系統(tǒng)，已成功地表達了大量的分泌蛋白［4］，它既具有原核表達系統(tǒng)繁殖快、操作簡單的優(yōu)點，同時又具有原核表達系統(tǒng)所沒有的優(yōu)勢:如能對表達的目的蛋白進行正確加工、折疊及適度糖基化，分泌表達的雜蛋白少、易于分離純化等，因此越來越廣泛地用于分泌蛋白的表達。本實驗克隆了來源于深海藻類基因組的5個DHA合成相關基因，并通過密碼子優(yōu)化，為了驗證優(yōu)化后序列是否能在真核細胞中正確表達，利用畢赤酵母表達這些蛋白，以克服用E.coli表達可能遇到的表達量低、難以純化的問題，從而進一步驗證其功能。本研究為后續(xù)DHA合成關鍵酶基因在禾谷類高等植物的高效穩(wěn)定表達奠定了可靠的基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌菌株(E.coli)DH5α、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastors)GS115(His－Mut+)菌株和分泌型表達載體pPIC9K，均由本實驗室保存;帶有目的基因的質(zhì)粒由人工合成。

1.2 酶與試劑

Taq DNA聚合酶、PET-30A載體、T4 DNA連接酶、脫氧核苷三磷酸(dNTP)、去磷酸化酶、DNA Marker購自TaKaRa公司;限制性內(nèi)切酶EcoRI、XhoI、NotI購于NEB公司;DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購于上海捷瑞生物公司;彩色預染蛋白質(zhì)分子量標準購于北京康潤生物公司;基因與PCR引物合成、重組子的測序由北京博邁德生物公司完成;tryptone、yeast extract、酵母氮基(含硫酸銨/無氨基酸yeast nitrogen base)、D-生物素、D-山梨醇 (D-sorbitol)、SDS、TEMED、N，N-甲叉雙丙烯酰等試劑購于北京鼎國生物公司，預染蛋白Marker購于New England Biolabs公司。

培養(yǎng)基:大腸桿菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基;酵母培養(yǎng)基為 YPD、RDB、BMGY、BMMY 培養(yǎng)基，配方參照Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。

1.3 方法

1.3.1 合成DHA途徑中相關酶基因的克隆 高等作物自身不能合成DHA，但大多可以合成亞麻酸，由亞麻酸到DHA需要5種酶，分別是Δ4脫飽和酶(D4)、Δ5脫飽和酶(D5)、Δ6脫飽和酶(D6)、C18延長酶(E18)和 C20延伸酶(E20)(圖 1)。根據(jù)已發(fā)表的文章或?qū)＠?～12］，通過比較這些基因的生物來源及酶活性等，最后選擇來自Eutreptiellacf gymnastica的Δ4脫飽和酶基因、來自Peridinium sp.CCMP626的Δ5脫飽和酶基因、來自Phaeodactylum tricornutum的Δ6脫飽和酶基因、來自Traustochytrium aureum的C18延長酶基因和來自Euglena gracilis的C20延長酶基因作為基礎，將這些基因序列通過GeneDesigner軟件進行密碼子優(yōu)化，由上海捷瑞生物工程有限公司進行人工合成，并在 http://www.genscript.com/cgi-bin/tools/rare_codon_analysis上進行CAI分析，使之在玉米中高效表達。優(yōu)化后的核苷酸序列進行人工合成，最后獲得攜帶有目的基因的重組質(zhì)粒pGH-D4/D5/D6E18/E20。

圖1 DHA在藻類生物中的合成示意圖 Fig.1 Diagrammatic sketch of DHA synthesis in microalgae.

1.3.2 重組表達質(zhì)粒載體的構建 本實驗所需要的載體構建方案如圖2所示:以攜帶有目的基因的重組質(zhì)粒pGH-D4/D5/D6/E18/E20為模板，用表1所示引物進行PCR擴增，去除終止密碼子，同時引入EcoRI和XhoI兩個酶切位點，產(chǎn)物連接T載體并測序正確后，用EcoRI和XhoI酶切，然后與pET-30a載體(XhoI位點后有His-Tag)相連，構建成pET-D4/D5/D6/E18/E20;再以HisR(表1)為反向引物(引物中加入 NotI位點)，正向引物(D4F/D5F/D6F/E18F/E20F)不變進行擴增，得到D4his/D5his/D6his/E18his/E20his等片段;最后再通過EcoRI和NotI兩個酶切位點構建到pPIC9K載體上。將這些質(zhì)粒命名為pPIC9K-D4his、 pPIC9K-D5his、 pPIC9K-D6his、pPIC9K-E18his和 pPIC9K-E20his。

PCR反應所用試劑為 KOD-Plus-Neo酶(ToYoBo公司)，PCR體系參照說明書。擴增反應的條件為:95℃預變性1 min;95℃變性10 s，58～62℃退火 10 s，72℃ 延伸 1 min，30 個循環(huán);72℃延伸10 min。實驗中所有引物均由上海生工生物有限公司合成。

圖2 pPIC9K-D4his/D5his/D6his/E18his/E20his載體構建示意圖 Fig.2 Construction of pPIC9K-D4his/D5his/D6his/E18his/E20his vectors.

1.3.3 重組表達質(zhì)粒載體的線性化及電擊轉(zhuǎn)化 將獲得的重組載體質(zhì)粒 pPIC9K-D4his、pPIC9K-D5his、pPIC9K-D6his、pPIC9K-E18his 和pPIC9K-E20his，分別用限制性內(nèi)切酶SacI進行酶切線性化，37℃保溫1 h，回收已被線性化的質(zhì)粒，隨后電擊轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母(畢赤酵母感受態(tài)準備、電擊轉(zhuǎn)化均參照Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊)。取80 μL新鮮制備的感受態(tài)酵母細胞與5 μg線性化的重組質(zhì)?；旌希靹蚝筠D(zhuǎn)移至0.2 cm預冷的電擊杯中，冰浴5 min，電擊轉(zhuǎn)化(電擊條件:2 000 V，25 μF，200Ω)，電擊完畢后，加入1 mL預冷的山梨醇溶液，將菌體混勻，轉(zhuǎn)至新的EP管中;將菌體懸液涂布于RDB平板上，每200～600 μL涂布一塊平板;將平板置于30℃培養(yǎng)，直至單個菌落出現(xiàn)。

1.3.4 篩選穩(wěn)定表達的畢赤酵母重組質(zhì)粒 將除了模板之外的其他PCR反應液的組分準備好，并分裝。由于受體菌酵母GS115為組氨酸缺陷型(his)，pPIC9k載體攜帶HIS4基因，所以只有線 性 化 pPIC9K-D4his、pPIC9K-D5his、pPIC9KD6his、pPIC9K-E18his和 pPIC9K-E20his片段整合到酵母基因組中才能在RDB平板上生長，因此在RDB平板上生長迅速的為陽性轉(zhuǎn)化子。在組氨酸缺陷型培養(yǎng)基上進行篩選，平板上的菌落長到肉眼可見時(約12 h);用滅菌的牙簽挑取菌落，在PCR管中涮一下，PCR擴增，電泳檢測。

表1 DHA相關基因引物序列 Table 1 Primers of genes involved in DHA synthesis pathway.

1.3.5 重組畢赤酵母的培養(yǎng)與誘導表達 挑選一單菌落，接種于裝有50 mL BMGY培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于 28℃、230 r/min培養(yǎng)至OD600=2～6(約 24 h)，4℃、4 000 r/min 離心5 min，收集菌體重懸于10 mL BMMY培養(yǎng)基，加入甲醇至終濃度0.5%，用雙層紗布封口，放置于28℃、230 r/min的搖床上繼續(xù)生長，每24 h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為0.5%。分別在誘導后的2 d、3 d、4 d和5 d取樣2 mL，置于EP管中，9 100 r/min、4℃離心 5 min，收集上清用于分析表達水平及確定誘導后收集細胞的最佳時間。

1.3.6 表達產(chǎn)物的濃縮處理SDS-PAGE及蛋白定量 三氯乙酸(TCA)沉淀法將表達上清液濃縮10倍:10 mL表達上清液中加入1 mL 100%三氯乙酸，振蕩混勻，放入4℃冰箱沉淀2～3 h，12 000 g離心15 min，去上清，再用10%三氯乙酸洗滌沉淀2～3遍，最大轉(zhuǎn)速離心，倒掉洗滌液，晾干沉淀，經(jīng)分離膠濃度11%，濃縮膠濃度5%，用考馬斯亮藍R-250染色，在電泳過程中，濃縮膠中恒流10 mA，分離膠中恒流 20 mA，樣品上樣量為20 mg/μL，預染蛋白 Marker上樣量為 5 μL，根據(jù)電泳結果，利用微孔酶標儀對目的蛋白定量。

2 結果與分析

2.1 目的基因的克隆和重組表達載體構建

按照圖1所示以pPIC9K為基礎載體構建在畢赤酵母中表達的載體，目的基因的克隆和最終載體的鑒定如圖3所示。經(jīng)過測序鑒定，顯示結果與預期相符。

圖3 酵母表達載體pPIC9K-D4his/D5his/D6his/E18his/E20his的構建 Fig.3 Construction of pPIC9K-D4his/D5his/D6his/E18his/E20his vectors expressed in Pichia pastoris.

2.2 重組表達載體質(zhì)粒的線性化及篩選

重組質(zhì)粒pPIC9K-D4his、pPIC9K-D5his、pPIC9K-D6his、pPIC9K-E18his 和 pPIC9K-E20his經(jīng)SacI線性化后，通過電激轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤酵母GS115中，在RDB平板上篩選轉(zhuǎn)化子。挑取上述甲醇利用型(Mut+)酵母轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR鑒定，結果見圖4。

2.3 重組酵母菌蛋白的誘導表達及上清液SDSPAGE檢測鑒定

收集部分經(jīng)甲醇誘導的pPIC9K-D4his誘導蛋白上清，經(jīng)SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)在約75 kDa下方出現(xiàn)明顯的新生蛋白帶，由于以酶切連接轉(zhuǎn)化方式整合到畢赤酵母染色體上的目的基因上游含有甲醇誘導型啟動子AOX1，在培養(yǎng)基中只存在甲醇為碳源的情況下，能被誘導高效表達。而轉(zhuǎn)化空載體pPIC9K(CK－)的酵母菌經(jīng)誘導獲得的上清液在相應位置未見蛋白帶，可斷定此處的蛋白帶為pPIC9K-D4his重組酵母菌的特征帶(圖5A)，其他位置的蛋白帶應該為雜蛋白。

圖4 PCR檢測畢赤酵母重組子 Fig.4 PCR identification of yeast recombinants.

同上類似，收集部分經(jīng)甲醇誘導的pPIC9KD5his、pPIC9K-D6his、pPIC9K-E18his 和 pPIC9KE20his誘導蛋白上清，經(jīng)SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)分別在約70 kDa和35 kDa下方出現(xiàn)明顯新生蛋白帶(圖5B～E)，這些條帶大小與預測的該目的蛋白的分子質(zhì)量大小一致。

由上圖5B可以看出，當培養(yǎng)至120 h時，酵母菌開始裂解死亡，同時游離出的蛋白酶可降解目的蛋白，在泳道3中彌散的蛋白條帶明顯增多，因此選擇的最佳誘導時間為96 h。

由圖5D可見，在72 h、96 h培養(yǎng)上清液中，在 25.0～35.0 kDa 之間，大約 30 kDa 的位置有蛋白帶，而在對照組中未出現(xiàn)該條帶，可判斷此處表達蛋白帶為E18his蛋白。雖然在72 h培養(yǎng)上清液中仍然存在30 kDa左右的條帶，但考慮到該條帶不如96 h的條帶顏色深，因此選擇的最佳誘導時間為96 h。

2.4 重組酵母菌蛋白誘導上清液Western Blot檢測鑒定

通過上一步SDS-PAGE的初步驗證，經(jīng)甲醇誘導的 pPIC9K-D4his、pPIC9K-D5his、pPIC9KD6his、pPIC9K-E18his和 pPIC9K-E20his誘導蛋白上清均有目的條帶出現(xiàn)，其中pPIC9K-D6his的目的條帶效果強于另外幾個樣品的目的條帶效果。因此對pPIC9K-D6his樣品的不同誘導時間收集到的表達上清進行Western Blot檢測。圖6顯示，除空載體對照外，pPIC9K-D6his的3 d、4 d樣品在64 kDa處均有明顯的雜交帶，這一條帶大小與預測的該分泌蛋白的分子質(zhì)量大小一致。同時，隨著誘導時間的增加，分泌蛋白的表達量有所升高。

圖5 轉(zhuǎn)化載體酵母表達蛋白的SDS-PAGE檢測 Fig.5 SDS-PAGE analysis of proteins from transgenic yeasts with vectors.

圖6 D6his重組酵母分泌蛋白的Western Blot分析 Fig.6 Western Blot analysis of recombinant protein with D6his protein.

3 討論

本研究采用的畢赤酵母表達系統(tǒng)是利用甲醇作為唯一碳源和能源，能穩(wěn)定表達外源蛋白的一種較為理想的真核蛋白表達系統(tǒng)，使用該表達系統(tǒng)，具有實驗結果穩(wěn)定、可靠、表達蛋白水平高，且不易被污染等特點［13］。本實驗所用的巴斯德畢赤酵母GS115菌株作為一種新型外源基因表達系統(tǒng)，該表達系統(tǒng)受由甲醇調(diào)控的AOXl基因強啟動子啟動，能對外源蛋白進行加工、折疊、翻譯后修飾，并將其分泌到培養(yǎng)基中，分泌的外源蛋白不會過度糖基化，畢赤酵母自身產(chǎn)生的分泌蛋白很少，使外源蛋白的分離純化較為簡便，正因為有這些優(yōu)點，該表達系統(tǒng)已被廣泛應用。

由已有報道得知，畢赤酵母表達外源蛋白的適宜溫度為28～30℃，在此溫度范圍畢赤酵母細胞生長速度最快，理論上外源蛋白的表達量與菌體密度呈正相關［14］。一些文獻資料記載，畢赤酵母在較低溫度下有利于外源蛋白的表達，可能是外源蛋白在較高溫度下的穩(wěn)定性下降，不利于蛋白質(zhì)折疊，也可能是死細胞釋放更多的蛋白酶降解外源蛋白［15］。畢赤酵母pH生長范圍一般在3.0～7.0，pH 通過影響蛋白酶活性，改變蛋白酶對外源蛋白的降解作用，來影響外源蛋白的表達量和活性［16］。畢赤酵母利用甲醇表達外源蛋白時需要消耗大量的氧氣，溶氧不足會抑制菌體繁殖和外源蛋白的表達，保證其通氣量充足［17］。甲醇是酵母表達的誘導物和唯一碳源，在甲醇誘導期間，由于甲醇的消耗和揮發(fā)，應及時向培養(yǎng)基中連續(xù)補加甲醇。但是甲醇濃度太高會對畢赤酵母細胞產(chǎn)生毒害，濃度太低則誘導表達的外源蛋白太少，一般甲醇的添加量為培養(yǎng)基體積的0.5%～1.0%為宜［18］。甲醇誘導時間也會影響外源基因的表達量，誘導時間太短則表達的外源蛋白量少，誘導時間太長外源蛋白容易被蛋白酶降解，外源蛋白的表達量少，因此要選擇最合適的誘導時間。通過對篩選出的陽性菌株進行誘導培養(yǎng)基、pH、培養(yǎng)時間和甲醇濃度等條件的優(yōu)化，以得到三角瓶內(nèi)誘導的最佳表達產(chǎn)物，為之后的表達產(chǎn)物活性分析奠定條件［19～22］。

本實驗在設計上根據(jù)酵母系統(tǒng)中分泌型表達載體pPIC9K的多克隆位點，設計了與其相應的一對引物，并在其上游引物部分引入EcoRI位點，下游引物部分引入NotI位點，將合成DHA途徑中的相關酶基因克隆至載體pPIC9K中，經(jīng)測序分析正確，用限制性內(nèi)切酶SacI酶切質(zhì)粒DNA線性化，電擊轉(zhuǎn)化法酵母宿主菌GS115，篩選到陽性的轉(zhuǎn)化子，進一步鑒定得到甲醇利用型(Mut+)轉(zhuǎn)化子，提取酵母菌轉(zhuǎn)化子DNA用PCR法鑒定，結果證明目的基因已經(jīng)穩(wěn)定地整合到畢赤酵母GS115染色體基因組中，收集部分經(jīng)甲醇誘導的蛋白上清，經(jīng)SDS-PAGE及Western Blot檢測，這些條帶大小與預測的目的蛋白的分子質(zhì)量大小一致，最佳誘導時間為96 h。

在此研究基礎上，我們擬將這些來自海洋微藻的DHA合成相關基因，包括Δ4、Δ5、Δ6脫飽和酶基因和C18、C20延伸酶基因分別轉(zhuǎn)入玉米基因組中，再通過雜交等遺傳育種方式最終獲得可合成DHA的轉(zhuǎn)基因玉米，改良玉米油的品質(zhì)，提升玉米油的保健功能價值，擴大玉米油在食品加工與保健食品等方面的應用。

［1］鄭秋甫.Omega-3多不飽和脂肪酸的研究進展［J］.中華保健醫(yī)學雜志，2011，13(5):357－360.

［2］Pereira S L，Vandana P，Tripathi C K M，et al..Identification of two novel microalgal enzymes involved in the conversion of the omega3-fatty acid，eicosapentaenoic acid，into docosahexaenoic acid［J］.Biochem.J.，2004，384(2):357－366.

［3］Qiu X，Hong H，MacKenzie S L.Identification of a Delta 4 fatty acid desaturase from Thraustochytrium sp.involved in the biosynthesis of docosahexanoic acid by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae and Brassica juncea［J］.J.Biol.Chem.，2001，276(34):31561－31566.

［4］李曉莉.玉米油，新一代的“長壽油”［J］.家庭醫(yī)藥，2012，2:83.

［5］Lu H，Li M，Ma H，et al..Identification and characterization of a novel delta6-fatty acid desaturase gene from Rhizopus nigricans［J］.Mol.Biol.Rep.，2009，36(8):2291－2297.

［6］Wan X，Zhang Y B，Wang P，et al.Molecular cloning and expression analysis of a delta 6-fatty acid desaturase gene from Rhizopus stolonifer strain YF6 which can accumulate high levels of gamma-linolenic acid［J］.J.Microbiol.，2011，49(1):151－154.

［7］Bowler C， Allan A E ， BadgerJH ， et al..The Phaeodactylum genome reveals the evolutionary history of diatom genomes［J］.Nature，2008，456(7219):239－244.

［8］Cho H P，Nakamura M，Clarke S D.Cloning，expression，and fatty acid regulation of the human delta-5 desaturase［J］.J.Biol.Chem.，1999，274(52):37335－37339.

［9］Leonard A E，Bruce K，Emil G B，et al.cDNA cloning and characterization of human Delta5-desaturase involved in the biosynthesis of arachidonic acid［J］.Biochem.J.，2000，347(3):719－724.

［10］ Zolfaghari R，Cifelli C J，Banta M D，et al..Fatty acid delta(5)-desaturase mRNA is regulated by dietary vitamin A and exogenous retinoic acid in liver of adult rats［J］.Arch.Biochem.Biophys.，2001，391(1):8－15.

［11］ Hong H，Datla N，MacKenzie S L，et al..Isolation and characterization of a delta5 FA desaturase from Pythium irregulare by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae and oilseed crops［J］.Lipids，2002，37(9):863－868.

［12］ Saito T，Morio T，Ochiai H.A second functional delta5 fatty acid desaturase in the cellular slime mould Dictyostelium discoideum［J］.Eur.J.Biochem.，2000，267(6):1813－1818.

［13］ Shen B，William B A，Zheng P Z ，et al..Expression of Zm-LEC1 and ZmWRI1 increases seed oil production in maize［J］.Plant Physiol.，2010，153(3):980－987.

［14］郝希成，汪麗萍，張蕊.玉米油脂肪酸成分標準物質(zhì)的研制［J］.糧食儲藏，2011，40(1):41－44.

［15］ Yang X，Guo Y Q ，Yan J B，et al.Major and minor QTL and epistasis contribute to fatty acid compositions and oil concentration in high-oil maize［J］.Theor.Appl.Genet.，2010，120(3):665－678.

［16］ Domergue F，Jens L，Ulrich Z，et al..Cloning and functional characterization of Phaeodactylum tricornutum front-end desaturases involved in eicosapentaenoic acid biosynthesis［J］.Eur.J.Biochem.，2002，269(16):4105－4113.

［17］ Girke T，Hermann S，Ulrich Z，et al..Identification of a novel delta 6-acyl-group desaturase by targeted gene disruption in Physcomitrella patens［J］.Plant J.，1998，15(1):39－48.

［18］ Kajikawa M，Yamato K T，Kohzu Y，et al..Isolation and characterization of delta(6)-desaturase，an ELO-like enzyme and delta(5)-desaturase from the liverwort Marchantia polymorpha and production of arachidonic and eicosapentaenoic acids in the methylotrophic yeast Pichia pastoris［J］.Plant Mol.Biol.，2004，54(3):335－352.

［19］ Meyer A，Petra C，Claudia O，et al..Biosynthesis of docosahexaenoic acid in Euglena gracilis:biochemical and molecular evidence for the involvement of a Delta4-fatty acyl group desat-urase［J］.Biochemistry，2003，42(32):9779－9788.

［20］ Rogers M B，Hilley J D，Dickens N J，et al..Chromosome and gene copy number variation allow major structural change between species and strains of Leishmania ［J］.Genome Res.，2011，21(12):2129－2142.

［21］ Tonon T，Harvey D，Larson T R，et al..Identification of a very long chain polyunsaturated fatty acid Delta4-desaturase from the microalga Pavlova lutheri［J］.FEBS Lett.，2003，553(3):440－444.

［22］ Li Y，Monroig O，Zhang L，et al..Vertebrate fatty acyl desaturase with Delta4 activity［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2010，107(39):16840－16845.