萵苣中兩種致瀉性大腸桿菌的富集及DNA提取方法的優(yōu)化

董　妍，胡文忠，何煜波，姜愛麗，馮　可，白　雪（.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連604；.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連6600；.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連604）

萵苣中兩種致瀉性大腸桿菌的富集及DNA提取方法的優(yōu)化

董妍1，胡文忠2，*，何煜波2，姜愛麗2，馮可3，白雪2
（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034；2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600；3.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116024）

本研究對人工接種腸出血性大腸桿菌O157∶H7和腸侵襲性大腸桿菌的萵苣樣品中菌體的富集和DNA提取方法進(jìn)行了優(yōu)化。研究中比較了不同過濾膜組合對菌體的富集效果，篩選了萵苣樣品中細(xì)菌DNA提取的最適方法，建立了多重PCR方法檢測人工污染萵苣樣品。結(jié)果表明，采用尼龍膜15 μm+混合膜0.22 μm的組合富集細(xì)菌、試劑盒法提取樣品中細(xì)菌DNA，多重PCR檢測的檢出限降低10倍，檢測時間節(jié)省1.5 h。本研究可快速、簡便、靈敏的應(yīng)用于萵苣檢測中，具有很高的實(shí)際應(yīng)用價值。

鮮活農(nóng)產(chǎn)品，致瀉大腸桿菌，富集，DNA提取

近年來，致瀉性大腸桿菌污染新鮮萵苣的事件常有發(fā)生，針對萵苣中致瀉性大腸桿菌進(jìn)行快速檢測對保障食品安全是十分必要的。在目前的研究中，檢測不同血清型的致瀉性大腸桿菌常用傳統(tǒng)方法費(fèi)時、費(fèi)力，越來越不能滿足人們對食品安全的要求，而多重PCR技術(shù)因具有高效、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，成為快速檢測食源性致病菌方面的研究熱點(diǎn)之一［1-2］。萵苣中所含致瀉性大腸桿菌的數(shù)量往往較少，食品基質(zhì)也會影響致病菌DNA的提取［3］，因此在進(jìn)行多重PCR檢測前對菌體的富集和DNA提取方法進(jìn)行優(yōu)化，能夠有效降低對檢測結(jié)果的干擾。翁思聰?shù)龋?］應(yīng)用復(fù)合型増菌培養(yǎng)基使細(xì)菌共增長。郝玉芹等［5］應(yīng)用FTA濾膜提取細(xì)菌DNA。白莉等［6］應(yīng)用免疫磁珠富集肉制品中的致病菌，均為快速檢測食品中致病菌提供了參考。在目前的研究中，針對肉類或乳類中致病菌的富集和DNA提取的研究較廣泛，多重PCR技術(shù)也多應(yīng)用于這兩類食品的檢測中，而萵苣等蔬菜中此類研究較少。因此，研究從萵苣中快速獲得大量高質(zhì)量的細(xì)菌DNA，以滿足檢測效率、檢出限的要求，具有重要的實(shí)際意義［7-8］。

本研究通過將不同材質(zhì)和孔徑的過濾膜進(jìn)行組合，對人工接種腸出血性大腸桿菌O157∶H7（Enterohemorrhagic E.coli，EHEC）和腸侵襲性大腸桿菌（Enteroinvasive E.coli，EIEC）的新鮮萵苣中兩種致瀉性大腸桿菌進(jìn)行洗脫富集，結(jié)合不同種DNA提取方法的優(yōu)化結(jié)果，應(yīng)用于多重PCR檢測中以提高檢測效率和降低檢出限，并對EHEC O157∶H7及EIEC的相關(guān)毒力基因以及兩種菌共同的基因設(shè)計了三對特異性引物，以期為靈敏、準(zhǔn)確、快速的檢測新鮮萵苣中兩種致瀉性大腸桿菌提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

腸出血性大腸桿菌O157∶H7 CICC 21530、腸侵襲性大腸桿菌CICC 10661、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（Enterotoxigenic E.coli，ETEC）CICC 10414、腸致病性大腸桿菌（Enteropathogenic E.coli，EPEC）CICC 10372、大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）CMCC 44102、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC 14028、乙型副傷寒沙門氏菌（Salmonella paratyphi B）CMCC 50094、三株單核細(xì)胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19111、ATCC 19112、ATCC 19115、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538、副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）CICC 10435均由大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院食品安全實(shí)驗室提供；LB培養(yǎng)基青島海博生物技術(shù)有限公司；多重PCR反應(yīng)相關(guān)試劑及細(xì)菌DNA提取試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司；Triton X-100等其他試劑國產(chǎn)分析純試劑；過濾膜、砂芯過濾器國產(chǎn)實(shí)驗材料；過濾膜材質(zhì)及孔徑見表1；新鮮萵苣購自大連開發(fā)區(qū)新瑪特超市。

BioSpectrum 310凝膠成像系統(tǒng)美國UVP公司；Thermo Arktic PCR儀、酶標(biāo)儀Thermo Fisher Scientific公司。

表1　過濾膜的材質(zhì)和孔徑Table 1　The material and pore size of filtration membranes

1.2實(shí)驗方法

1.2.1引物的設(shè)計與合成針對EHEC O157∶H7的毒力基因O-antigen［9］、EIEC的毒力基因ipaH［10］和所有大腸桿菌共同的基因uidA［11］，根據(jù)GenBank中公布的相關(guān)序列，應(yīng)用軟件Primer Premier 5.0和Oligo 6.0設(shè)計3對特異性引物（表2），由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表2　多重PCR引物序列Table 2　Sequence specific primers of multiplex PCR

1.2.2樣品處理及増菌培養(yǎng)將新鮮萵苣用無菌水洗凈后在75%的酒精中浸泡10 min，取出待酒精揮發(fā)完全。每份樣品稱取25 g，加入到225 mL已添加了0.3 g/100 mL的甘露醇和1.0%的乳糖的LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，取濃度均為10 CFU/mL的EHEC O157∶H7和EIEC的菌懸液各1 mL，分別加入到各自的培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)［7］。培養(yǎng)時間約為12 h，取出后均質(zhì)，并設(shè)置空白對照實(shí)驗。取適量均質(zhì)液用無菌生理鹽水按10倍梯度稀釋至10-6倍進(jìn)行菌落計數(shù)，其他的均質(zhì)液備用。

1.2.3過濾膜組合的選擇每次取約107CFU/mL的均質(zhì)液50 mL，先將均質(zhì)液通過大孔徑膜，以截留樣品均質(zhì)后殘留的固體等大體積物質(zhì)，再取濾下的含菌體的培養(yǎng)液通過小孔徑膜，使菌體脫離培養(yǎng)液而富集在膜表面上，通過菌落計數(shù)對不同材質(zhì)和孔徑的過濾膜進(jìn)行優(yōu)化。過濾膜的組合方式分別有以下幾種：聚丙烯膜10 μm+混合膜0.22 μm、聚丙烯膜20 μm+混合膜0.22 μm、聚丙烯膜40 μm+混合膜0.22 μm、聚丙烯膜10 μm+混合膜0.45 μm、聚丙烯膜20 μm+混合膜0.45 μm、聚丙烯膜40 μm+混合膜0.45 μm、尼龍膜15 μm+混合膜0.22 μm、尼龍膜40 μm+混合膜0.22 μm、尼龍膜60 μm+混合膜0.22 μm、尼龍膜15 μm+混合膜0.45 μm、尼龍膜40 μm+混合膜0.45 μm、尼龍膜60 μm+混合膜0.45 μm。將富集后的小孔徑過濾膜放入5 mL無菌生理鹽水中，使用渦旋混合器2400 r/min振蕩2 min，然后用玻璃棒刮擦表面1 min［12］，得到菌體的富集液。將不同過濾膜組合的富集液10倍梯度稀釋后進(jìn)行菌落計數(shù)，比較富集效果選出最佳過濾膜組合。

1.2.4基因組DNA的提取

1.2.4.1水煮法參照文獻(xiàn)［13］并作改進(jìn)：取1 mL均質(zhì)液及其梯度稀釋液分別離心12000 r/min離心2 min，棄上清，加入400 μL無菌水吹打混勻，12000 r/min離心1 min，棄上清，加入300 μL無菌水吹打混勻，煮沸10 min后迅速放在冰上10 min，12000 r/min離心5 min，取上清為模板。

1.2.4.2堿液加熱裂解法參照文獻(xiàn)［14］：取1 mL均質(zhì)液及其梯度稀釋液分別12000 r/min離心10 min，棄上清，加入20 mmol/L的NaOH溶液100 μL，混勻后煮沸10 min，迅速置于4℃中30 min，12000 r/min離心10 min，取上清為模板。

1.2.4.3Triton X-100直接裂解法參照文獻(xiàn)［15］并作改進(jìn)：取1 mL均質(zhì)液及其梯度稀釋液分別12000 r/min離心2 min，棄上清，加入100 μL 1%Triton X-100，吹打混勻，置于室溫下10 min，5000 r/min離心1 min，取上清為模板。

1.2.4.4Triton X-100煮沸裂解法參照文獻(xiàn)［15］并作改進(jìn)：取1 mL均質(zhì)液及其梯度稀釋液分別加入到100 μL的1%Triton X-100中，渦旋振蕩1 min混勻后煮沸10 min，迅速放在冰上10 min，5000 r/min離心1 min，取上清為模板。

1.2.4.5試劑盒法取1 mL均質(zhì)液及其梯度稀釋液分別按照寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

1.2.5DNA提取方法的選擇先應(yīng)用EHEC O157∶H7和EIEC純菌菌株建立多重PCR反應(yīng)，并驗證引物特異性。然后對不同提取方法提取的基因組DNA分別進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，以比較應(yīng)用于多重PCR反應(yīng)中不同提取方法的檢出限，綜合DNA純度來確定最佳DNA提取方法。同時取不同提取方法提取的模板DNA 2 μL，經(jīng)酶標(biāo)儀測定其在230、260、280 nm波長下的光吸收值，以超純水為空白，每個樣品重復(fù)三次，取三次結(jié)果的平均值，比較不同提取方法提取的DNA純度。

對反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化后，最終多重PCR反應(yīng)體系確定為：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2 μL，DNA模板各1 μL，O-antigen基因引物（4 μmol/L）各1 μL，ipaH基因引物各1 μL，uidA基因引物各1.25 μL，rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，加RNase-Free Water至25 μL。對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化后，最終多重PCR反應(yīng)條件確定為：94℃預(yù)變性4 min，94℃30 s、53℃30 s、72℃40 s，34個循環(huán)，72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，95 V電泳1 h，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

1.2.6人工污染新鮮萵苣的檢測應(yīng)用最佳過濾膜組合對兩種濃度均為7.8×107CFU/mL的致瀉性大腸桿菌均質(zhì)液及其10倍梯度稀釋液分別進(jìn)行洗脫富集，使得菌體濃度范圍為7.8×107～7.8×101CFU/mL（以10倍為梯度）的樣品分別經(jīng)富集處理后得到各自的洗脫液，然后應(yīng)用試劑盒法提取上述洗脫液中細(xì)菌DNA，所提取的DNA用于多重PCR方法，檢測檢出限并與未經(jīng)富集樣品的檢出限對比，分析富集效果。

1.2.7實(shí)驗數(shù)據(jù)處理與分析實(shí)驗數(shù)據(jù)結(jié)果采用Excel2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果與分析

2.1過濾膜組合的選擇

先應(yīng)用兩種不同材質(zhì)、五種孔徑大小的大孔徑過濾膜過濾含7.8×107CFU/mL致瀉性大腸桿菌的樣品均質(zhì)液，再將含菌體的培養(yǎng)液分別通過兩種不同孔徑大小的小孔徑過濾膜，通過菌落計數(shù)比較各種組合的富集效果（表3），結(jié)果顯示尼龍材質(zhì)的過濾膜的洗脫效果優(yōu)于聚丙烯材質(zhì)的過濾膜，孔徑大小為15、40、60 μm的尼龍過濾膜洗脫細(xì)菌的能力大致相同，孔徑大小為0.22 μm的過濾膜富集細(xì)菌的能力優(yōu)于孔徑大小為0.45 μm的過濾膜，考慮到大孔徑過濾膜的孔徑大小關(guān)系到其截留能力，過大的孔徑不利于截留樣品中殘留的大體積固體，因此選擇孔徑大小為15 μm的尼龍過濾膜與孔徑大小為0.22 μm的混合過濾膜組合對兩種致瀉性大腸桿菌進(jìn)行洗脫富集。

表3　不同過濾膜組合對細(xì)菌的富集效果Table 3　The concentration effect of bacteria by different combinations of membrane filtration

2.2DNA提取方法的選擇

2.2.1五種DNA提取方法所得DNA純度比較對應(yīng)用五種提取方法提取的基因組DNA經(jīng)酶標(biāo)儀測量其在230、260、280 nm波長下的光吸收值，計算出的OD260/OD230比值和OD260/OD280比值結(jié)果見表4。由表4結(jié)果可以看出用水煮法、Triton X-100直接裂解法、Triton X-100煮沸裂解法提取DNA的OD260/OD280比值均低于1.8，說明提取的DNA中可能含有較多的蛋白質(zhì)、酚類等雜質(zhì)；堿液加熱裂解法和試劑盒法提取的DNA的OD260/OD280比值在1.8～2.0的范圍內(nèi)，說明提取的DNA中含較少的蛋白質(zhì)、酚類等雜質(zhì)，純度較好。在五種提取方法中，只有用試劑盒法提取的DNA的OD260/OD230比值高于2.0，說明提取的DNA中去鹽較充分，其他的四種方法去鹽均不充分。因此，應(yīng)用試劑盒法提取樣品中致瀉性大腸桿菌基因組DNA的純度最好，其次為堿液加熱裂解法，水煮法和Triton X-100煮沸裂解法提取DNA的純度基本一致，Triton X-100直接裂解法提取DNA的純度最差。

表4　不同提取方法提取細(xì)菌DNA純度的比較Table 4　Comparison of different extraction method to extract the DNA purity of bacterias

圖1　多重PCR反應(yīng)的建立Fig.1　Establishment of multiplex PCR

2.2.2五種DNA提取方法所得DNA多重PCR檢出限比較對兩種致瀉性大腸桿菌進(jìn)行多重PCR反應(yīng)建立的結(jié)果見圖1，特異性驗證結(jié)果見圖2。在多重PCR反應(yīng)中，由三條目的條帶檢測兩種致瀉性大腸桿菌，在反應(yīng)中由O-antigen基因和uidA基因的引物共同鑒定EHEC O157∶H7，在178 bp和446 bp處出現(xiàn)兩條特異性目的條帶，由ipaH基因和uidA基因的引物共同鑒定EIEC，在303 bp和446 bp處出現(xiàn)兩條特異性目的條帶，將兩種致瀉大腸桿菌組合后對三種目的基因進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，在178、303、446 bp處出現(xiàn)三條特異性目的條帶，目的條帶與預(yù)期大小符合，條帶清晰且無非特異性擴(kuò)增。

圖2　多重PCR反應(yīng)特異性驗證結(jié)果Fig.2　The specificity of multiple PCR

應(yīng)用五種DNA提取方法對含7.8×107CFU/mL致瀉性大腸桿菌的樣品均質(zhì)液及其10倍梯度稀釋液進(jìn)行基因組DNA的提取，并分別進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，各種提取方法的檢出限檢測結(jié)果見圖3。水煮法提取DNA電泳檢測的檢出限為7.8×106CFU/mL，堿液加熱裂解法提取DNA電泳檢測的檢出限為7.8×105CFU/mL，Triton X-100直接裂解法提取DNA電泳檢測的檢出限為7.8×106CFU/mL，Triton X-100煮沸裂解法提取DNA電泳檢測的檢出限為7.8×105CFU/mL，試劑盒法提取DNA電泳檢測的檢出限為7.8×104CFU/mL。由不同方法提取的基因組DNA，在多重PCR反應(yīng)中均可以擴(kuò)增出目的條帶，目的條帶與預(yù)期大小符合，其中應(yīng)用試劑盒法提取樣品中致瀉性大腸桿菌基因組DNA的含量最多，其次為堿液加熱裂解法和Triton X-100煮沸裂解法，含量最少的是水煮法和Triton X-100直接裂解法。綜合五種不同的基因組DNA提取方法提取DNA的純度及提取量，選擇試劑盒法對人工接種新鮮萵苣中的EHEC O157∶H7和EIEC進(jìn)行基因組DNA提取。

圖3　不同DNA提取方法應(yīng)用于多重PCR方法檢出限的比較Fig.3　Comparison of the detection limit of multiplex PCR by different DNA extraction methods

2.3人工污染新鮮萵苣的檢測

首先應(yīng)用尼龍膜15 μm+混合膜0.22 μm的過濾膜組合，對含有7.8×107CFU/mL EHEC O157∶H7的樣品均質(zhì)液及其10倍梯度稀釋液進(jìn)行菌體的富集，再應(yīng)用試劑盒法對各濃度梯度的富集液提取基因組DNA，同樣方法處理含有7.8×107CFU/mL EIEC的樣品均質(zhì)液及其10倍梯度稀釋液，用所提取的DNA進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，檢出限結(jié)果見圖4，結(jié)果顯示含原始濃度為7.8×107～7.8×103CFU/mL的菌體樣品均質(zhì)液經(jīng)尼龍15 μm+混合膜0.22 μm的過濾膜組合富集后用試劑盒法提取DNA，可在多重PCR反應(yīng)中被檢測出。應(yīng)用優(yōu)化后方法處理人工接種新鮮萵苣，多重PCR反應(yīng)可檢測出原始濃度最低為7.8×103CFU/mL的兩種致瀉性大腸桿菌。而未經(jīng)菌體富集的人工接種新鮮萵苣樣品檢出限為7.8×104CFU/mL。用優(yōu)化后方法組合處理人工接種新鮮萵苣的檢出限降低了10倍，在接種量為10 CFU的條件下，檢測時間比未經(jīng)菌體富集的快1.5 h。

圖4　應(yīng)用優(yōu)化后方法檢測人工接種新鮮萵苣的檢出限結(jié)果Fig.4　The detection limit of artificial lettuce infected with two pathogens by the optimized method

3　討論

本研究應(yīng)用多重PCR檢測方法對人工接種EHEC O157∶H7和EIEC的新鮮萵苣進(jìn)行了檢測，本研究選取編碼EHEC O157∶H7O抗原的O-antigen基因、編碼EIEC侵襲性質(zhì)?？乖膇paH基因和編碼兩種致瀉性大腸桿菌產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶的uidA基因為目的基因，設(shè)計三條特異性引物檢測兩種致瀉性大腸桿菌，即每種菌由兩條特異性引物共同鑒定，避免了假陽性的產(chǎn)生或與其他血清型的致瀉性大腸桿菌產(chǎn)生交叉反應(yīng)，保證了檢測方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示所建立的多重PCR反應(yīng)具有良好的特異性。吳家林等［16］設(shè)計了4對特異性引物應(yīng)用多重PCR方法檢測EHEC O157∶H7，避免了交叉反應(yīng)。曲澤慧等［17］建立的檢測產(chǎn)腸毒素大腸桿菌雙重PCR檢測方法，具有檢出率高的優(yōu)點(diǎn)。

本研究中采用大孔徑過濾膜與小孔徑富集膜組合的方法對人工接種EHEC O157∶H7和EIEC的新鮮萵苣中兩種致瀉性大腸桿菌進(jìn)行洗脫富集，結(jié)合試劑盒法提取萵苣樣品中的細(xì)菌DNA，能夠有效降低萵苣樣品中兩種致瀉性大腸桿菌的檢出限，節(jié)省了檢測時間，減少了培養(yǎng)基、食品基質(zhì)等對多重PCR反應(yīng)有抑制作用的物質(zhì)，并且膜過濾方法還具有快速、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。胡朝友等［12］應(yīng)用小孔徑過濾膜富集飲用水中的大腸桿菌，應(yīng)用于TaqMan探針實(shí)時熒光PCR檢測中，檢出限達(dá)到1 CFU/mL，低于本研究中的檢出限，這可能是由于此文獻(xiàn)與本研究的檢測方法、樣品種類、DNA提取方法、細(xì)菌模板DNA和引物之間抑制作用等因素不同，造成了靈敏度上的差異。本研究檢測人工接種EHEC O157∶H7和EIEC的新鮮萵苣的檢出限為7.8×103CFU/mL，此結(jié)果低于舒暢［3］和王慧等［18］應(yīng)用多重PCR方法檢測人工污染食品中多種致病菌的檢出限，與賀晨［19］和王艷君等［20］的結(jié)果接近，這種靈敏度上的差異也可能是由于樣品種類、細(xì)菌富集方法、DNA提取方法、多重PCR反應(yīng)體系與條件等因素不同造成的［19］。

4　結(jié)論

本研究通過對人工接種新鮮萵苣中兩種致瀉性大腸桿菌的富集及DNA提取方法優(yōu)化的研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用尼龍過濾膜15 μm+混合膜0.22 μm的過濾膜組合對菌體進(jìn)行富集，采用試劑盒法提取基因組DNA，結(jié)合多重PCR方法檢測人工接種EHEC O157∶H7和EIEC的新鮮萵苣，檢出限為7.8×103CFU/mL，與未經(jīng)菌體富集的樣品相比，檢出限降低了10倍，檢測時間減少了1.5 h。此方法可快速、特異、靈敏的檢測出兩種致瀉性大腸桿菌，可應(yīng)用于新鮮萵苣中EHEC O157∶H7和EIEC的快速檢測。

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Optimized methods for concentration and DNA extraction of two kinds of diarrheagenic Escherichia coli in fresh agricultural products

DONG Yan1，HU Wen-zhong2，*，HE Yu-bo2，JIANG Ai-li2，F(xiàn)ENG Ke3，BAI Xue2
（1.College of Food Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China；2.College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China；3.College of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian 116024，China）

To optimize the methods for concentration and DNA extraction of two pathogens in artificial lettuce infected with Enterohemorrhagic E.coli and Enteroinvasive E.coli.This study compared the concentration effect of different kinds of filtration membranes，and selected the best method of DNA extraction to extract the two athogens in lettuce sample.The multiplex PCR was used to detect the artificial lettuce infected with two pathogens.The results showed that the nylon membrane which had the pore size of 15 μm combined with mixed membrane which had the pore size of 0.22 μm was the best enrichment method.And the best DNA extraction method was slected by using the kit of bacterial genomic DNA extraction.The detection limit of lettuce samples by using multiplex PCR was decreased 10 times.The detection time was saved 1.5 h.The multiplex PCR combined with the optimized method was sensitive，fast and easy.This study had a high practical value.

fresh agricultural products；diarrheagenic Escherichia coli；bacteria concentration；DNA extraction

TS201.3

B

1002-0306（2015）20-0260-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.046

2015－02－02

董妍（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品安全，E-mail：dong_yan@126.com。

胡文忠（1959-），男，教授，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：hwz@dlnu.edu.cn。

國家科技支撐計劃項目（2012BAD38B05）；國家自然科學(xué)基金項目（31172009）；大連市科技計劃項目（2012E13SF106）；大連市金州新區(qū)科技計劃項目（2012-A1-049）。