表面活性劑協(xié)同超聲波優(yōu)化牯嶺勾兒茶總黃酮提取工藝

俞　浩，毛斌斌，劉漢珍（安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽鳳陽233100）

表面活性劑協(xié)同超聲波優(yōu)化牯嶺勾兒茶總黃酮提取工藝

俞浩，毛斌斌，劉漢珍
（安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽鳳陽233100）

以牯嶺勾兒茶總黃酮得率為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選表面活性劑協(xié)同超聲波提取牯嶺勾兒茶總黃酮的提取工藝。結(jié)果表明，牯嶺勾兒茶總黃酮的最佳提取工藝條件為：液固比35∶1（mL/g），乙醇濃度65%，SDS濃度為3.0 g/L，超聲功率250 W，該條件下總黃酮得率為3.81 mg/g，RSD為1.53%，且提取工藝簡單，重復(fù)性好。

牯嶺勾兒茶總黃酮，表面活性劑，超聲提取，正交設(shè)計法

牯嶺勾兒茶（Berchemia kulingensis Schneid）為鼠李科鼠李屬植物，主產(chǎn)于安徽、四川、廣西等省，其性味微澀、溫，具有祛風(fēng)利濕，通經(jīng)活絡(luò)之功效。安徽滁州一帶習(xí)用牯嶺勾兒茶的葉，夏季采收后加工炒制成茶，習(xí)稱“藤茶”，在當(dāng)?shù)赜兄^為悠久的飲用歷史。民間認(rèn)為，長期飲用“藤茶”具有良好的保健功效。近年研究發(fā)現(xiàn)，勾兒茶屬植物富含氨基酸、多糖、黃酮、苷類等成分，具有保肝、抑菌、止咳平喘等多種藥理作用［1］。本實(shí)驗(yàn)前期觀察了牯嶺勾兒茶多糖對免疫功能的影響和抗氧化作用，結(jié)果表明牯嶺勾兒茶多糖能夠增強(qiáng)老齡小鼠非特異性免疫功能和特異性免疫功能，具有抗過氧化損傷作用［2］。目前，有關(guān)牯嶺勾兒茶黃酮類成分的提取工藝及活性研究尚未見文獻(xiàn)報道。本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計法優(yōu)選表面活性劑協(xié)同超聲提取牯嶺勾兒茶總黃酮的最佳工藝，為牯嶺勾兒茶的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

牯嶺勾兒茶采自安徽省鳳陽縣韭山，經(jīng)安徽科技學(xué)院劉漢珍副教授鑒定為牯嶺勾兒茶（Berchemia kulingensis Schneid）的葉；蘆丁對照品（0080-9905）中國藥品生物制品檢定所；十二烷基硫酸鈉（SDS）無錫市鹿城科技有限公司，分析純；十六烷基三甲基溴化銨（CTMAB） 上海凱爾生物科技有限公司，分析純；吐溫80天津市永大化學(xué)試劑有限公司，分析純；椰油酰胺基丙基甜菜堿（CAB） 上海金山經(jīng)緯化工有限公司，分析純。

UV-5500PC型紫外可見分光光度計上海元析儀器有限公司；SB 25-12 DTDN型超聲波清洗機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-CD型循環(huán)水真空泵鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；FA2104B電子分析天平上海越平科學(xué)儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蘆丁對照品溶液的配制精密稱定蘆丁對照品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，配制成濃度為0.2 mg/mL的蘆丁對照品溶液。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取25 mL容量瓶5支，分別加入蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5 mL，各加蒸餾水至6.0 mL，加1 mL 5%NaNO2溶液，搖勻后放置6 min，加1 mL 10%Al（NO3）3溶液，搖勻后放置6 min，再加10 mL 4%NaOH溶液，最后加蒸餾水定容至刻度，搖勻放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白對照，在510 nm處測定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.071X+0.001，R2=0.9999，蘆丁濃度在8.0～4.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.3牯嶺勾兒茶總黃酮的提取與含量測定取牯嶺勾兒茶，粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，稱取2.0 g，置100 mL具塞磨口三角瓶中，加入一定濃度的乙醇，再加入一定量的表面活性劑，浸泡2 h后，置超聲裝置中，在設(shè)定的超聲功率下超聲一定時間，抽濾，將提取液移入100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容。取一定體積的提取液，加蒸餾水6 mL，其余步驟同“1.2.2”方法，測定提取液中總黃酮含量，計算牯嶺勾兒茶總黃酮得率。牯嶺勾兒茶總黃酮得率（mg/g）=提取液中總黃酮質(zhì)量/牯嶺勾兒茶粉末質(zhì)量。

1.2.4表面活性劑的選擇取100 mL具塞磨口錐形瓶5個，分別加入牯嶺勾兒茶2.0 g，按液固比30∶1（mL/g）分別加入70%乙醇溶液，其中4個錐形瓶分別加入4 g/L的SDS、CTMAB、吐溫80和CAB，第5個錐形瓶中加入相應(yīng)量的蒸餾水作空白對照。浸泡2 h后，置超聲裝置中，超聲功率250 W，超聲時間25 min，取提取液，測定吸光度，得總黃酮得率，計算相對提高率。相對提高率（%）=100×（加表面活性劑總黃酮得率-空白對照總黃酮得率）/空白對照總黃酮得率。

1.2.5單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1乙醇濃度對總黃酮得率的影響設(shè)定超聲頻率40 kHz，按液固比30∶1，分別加入50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%乙醇，超聲功率250 W，超聲時間25 min，考察乙醇濃度對總黃酮得率的影響。

1.2.5.2液固比對總黃酮得率的影響設(shè)定超聲頻率40 kHz，按一定液固比加入65%乙醇，設(shè)定超聲功率250 W，超聲時間25 min，考察液固比為20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1（mL/g）條件下總黃酮得率。

1.2.5.3超聲功率對總黃酮得率的影響設(shè)定超聲頻率40 kHz，按液固比35∶1加入65%乙醇，設(shè)定超聲時間25 min，考察超聲功率為100、150、200、250、300、350、400 W條件下總黃酮得率。

1.2.5.4超聲時間對總黃酮得率的影響設(shè)定超聲頻率40 kHz，按液固比35∶1加入65%乙醇，設(shè)定超聲功率300 W，考察超聲時間為10、15、20、25、30、35、40 min條件下總黃酮得率。

1.2.5.5SDS濃度對總黃酮得率的影響設(shè)定超聲頻率40 kHz，按液固比35∶1加入65%乙醇，分別加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0（g/L）的SDS，超聲功率300 W，超聲時間20 min，考察SDS濃度對總黃酮得率的影響。

1.2.6正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選總黃酮提取工藝參照文獻(xiàn)方法［3-5］，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在考察的5個因素中，選取乙醇濃度、液固比、SDS濃度和超聲功率等4個對總黃酮得率影響較大的因素，以牯嶺勾兒茶總黃酮得率為指標(biāo)，按照正交實(shí)驗(yàn)四因素三水平設(shè)計（見表1），選用L9（34）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，每個實(shí)驗(yàn)號實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。見表1。

表1　正交設(shè)計因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal design

1.3數(shù)據(jù)處理

結(jié)果分析采用SPSS for Windows 17.0軟件general linear models。

2　結(jié)果與分析

2.1表面活性劑的確定

表面活性劑具有雙親結(jié)構(gòu)，其分子的疏水部分能結(jié)合在一起形成膠束，非極性物質(zhì)可以進(jìn)入膠束內(nèi)核或表面活性劑分子之間，從而達(dá)到增溶目的［6-8］。因此，表面活性劑在輔助中藥提取技術(shù)方面應(yīng)用非常廣泛。超聲波利用空化作用、機(jī)械振蕩作用、熱效應(yīng)等原理，使植物細(xì)胞壁瞬間破裂，將細(xì)胞內(nèi)容物釋放與溶出，且超聲波能加速藥材成分的擴(kuò)散，縮短提取時間［9-11］。由表2可知，與未加表面活性劑比較，加入SDS、CTMBA、吐溫80、CAB后，牯嶺勾兒茶總黃酮得率分別提高了65.14%、49.71%、43.42%、48.00%。4種表面活性劑中，陰離子型表面活性劑SDS對總黃酮得率的影響最大，相對提高率為65.14%。因此，確定SDS為實(shí)驗(yàn)因素之一。

表2　不同表面活性劑對總黃酮得率的影響Table 2　Effect of different surfactant on the yield of total flavonoids from berchemia kulingensis schneid

2.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1乙醇濃度對總黃酮得率的影響由圖1可知，乙醇濃度在50%～65%時，總黃酮得率逐步提高，乙醇濃度為65%時總黃酮得率最高，其后隨著乙醇濃度的增加，總黃酮得率逐漸下降?？赡茉蚴请S著乙醇濃度的增加，雜質(zhì)的溶出度也增加，對黃酮的提取造成影響。因此，確定65%乙醇為最佳濃度。

圖1　乙醇濃度對牯嶺勾兒茶總黃酮得率的影響Fig.1　Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids from berchemia kulingensis schneid

圖2　液固比對牯嶺勾兒茶總黃酮得率的影響Fig.2　Effect of liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids from berchemia kulingensis schneid

2.2.2液固比對總黃酮得率的影響由圖2可知，隨著液固比的增加，總黃酮得率逐漸增加，當(dāng)液固比超過35∶1時，隨著液固比的增加，總黃酮得率保持在一個較為平穩(wěn)的水平。原因可能是隨著液固比的增加，提取液粘度降低，超聲空化的阻力降低，有助于黃酮的溶出?？紤]到液固比提高會增加提取成本，且后期濃縮處理負(fù)擔(dān)也會加重。因此，確定35∶1為最佳液固比。

圖3　超聲功率對牯嶺勾兒茶總黃酮得率的影響Fig.3　Effect of ultrasound power on the yield of total flavonoids from berchemia kulingensis schneid

2.2.3超聲功率對總黃酮得率的影響由圖3可知，在一定功率范圍內(nèi)，總黃酮得率隨著超聲功率的增加不斷提高，超聲功率為300 W時，總黃酮得率最高。超過300 W后，隨著超聲功率的增加，總黃酮得率逐步降低，原因可能是功率過高會導(dǎo)致部分黃酮結(jié)構(gòu)破壞。因此，確定300 W為最佳超聲功率。

圖4　超聲時間對牯嶺勾兒茶總黃酮得率的影響Fig.4　Effect of ultrasound time on the yield of total flavonoids from berchemia kulingensis schneid

2.2.4超聲時間對總黃酮得率的影響由圖4可知，超聲時間對總黃酮得率影響不大?？赡茉蚴请S著超聲時間的延長，總黃酮得率增加，但空化效應(yīng)減弱，牯嶺勾兒茶總黃酮的吸附力增強(qiáng)，也可能是超聲時間延長破壞了部分黃酮結(jié)構(gòu)，造成總黃酮得率下降。從總黃酮得率和節(jié)約時間方面考慮，確定超聲時間為20 min。

圖5　SDS濃度對牯嶺勾兒茶總黃酮得率的影響Fig.5　Effect of SDS concentration on the yield of total flavonoids from berchemia kulingensis schneid

2.2.5SDS濃度對總黃酮得率的影響由圖5可知，SDS濃度為1.0～2.5 g/L時總黃酮得率隨濃度的增加而增加，SDS濃度為2.5 g/L時達(dá)最大值，其后逐步降低?？赡茉蚴请S著表面活性劑濃度的增加，形成膠束數(shù)量不斷增加，從而增加黃酮的溶出度，總黃酮得率增加。但當(dāng)表面活性劑的濃度達(dá)到臨界膠束濃度后，形成膠束數(shù)量不再增加，黃酮得率亦不再增加。因此，選取SDS的最佳濃度為2.5 g/L。

2.3正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

由表3、表4可知，4個因素對總黃酮得率均有顯著影響，影響大小順序?yàn)椋篊＞B＞D＞A，最佳提取工藝為A2B2C3D1，即液固比35∶1，乙醇濃度65%，SDS濃度3.0 g/L，超聲功率250 W。

2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取3份牯嶺勾兒茶樣品各2.0 g，采用優(yōu)化工藝條件提取，3份樣品的總黃酮得率分別為3.79、3.82、3.81 mg/g，平均得率為3.81 mg/g，RSD為1.53%，結(jié)果表明該工藝條件穩(wěn)定可行。

表3　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3　Results of orthogonal experiment design

表4　方差分析結(jié)果Table 4　Results of variance analysis

3　結(jié)論

表面活性劑能降低溶劑的表面張力，使溶劑更易滲入藥材細(xì)胞內(nèi)部，利于有效成分?jǐn)U散并溶解于溶劑中，提高中藥化學(xué)成分的提取效率［12-16］。本實(shí)驗(yàn)選擇了4種表面活性劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在相同濃度時，陰離子表面活性劑SDS輔助提取牯嶺勾兒茶總黃酮效果最好。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察了乙醇濃度、液固比、超聲時間、超聲功率及SDS濃度對牯嶺勾兒茶總黃酮得率的影響，并在此基礎(chǔ)上采用正交實(shí)驗(yàn)法對提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳提取工藝條件為：液固比35∶1，乙醇濃度65%，SDS濃度為3.0 g/L，超聲功率250 W。驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用此工藝條件提取3次，總黃酮平均得率為3.81 mg/g，RSD為1.53%，表明該工藝條件重復(fù)性好，為牯嶺勾兒茶的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of surfactant assisted with ultrasonic extraction technology of total flavonoids from Berchemia kulingensis Schneid

YU Hao，MAO Bin-bin，LIU Han-zhen
（College of Food and Drug，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China）

With the index of yield of total flavonoids from Berchemia kulingensis Schneid，orthogonal experiment design was used to optimize the surfactant assisted with ultrasonic extraction technology of total flavonoids from Berchemia kulingensis Schneid in the basis of single factor.The results showed that the optimum extraction conditions of total flavonoids from Berchemia kulingensis Schneid as follows：SDS concentration 3.0 g/L，ethanol concentration 65%，ultrasonic power 250 W，solvent-solid ratio 35∶1，the yield of total flavonoids was 3.81 mg/g，RSD was 1.53%，and this extraction technology was simple and had good reproducibility.

total flavonoids of Berchemia kulingensis Schneid；surfactant；ultrasonic extraction；orthogonal design

TS201.1

B

1002-0306（2015）20-0244-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.043

2015－01－30

俞浩（1975-），男，博士，副教授，主要從事中藥新藥及保健食品的開發(fā)研制方面的研究，E-mail：yhz_1230@163.com。

安徽省高校省級自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（kj2014A051）。