單親滅活保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株融合子的選育

王慕華，潘佩平，趙玉明，2，蘇檳楠，蔡穎慧，李海濤，2（.山西省生物研究所，山西太原030006；2.山西維爾生物乳制品有限公司，山西太原030006）

單親滅活保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株融合子的選育

王慕華1，潘佩平1，趙玉明1，2，蘇檳楠1，蔡穎慧1，李海濤1，2
（1.山西省生物研究所，山西太原030006；2.山西維爾生物乳制品有限公司，山西太原030006）

為獲得具有抗噬菌體功能且發(fā)酵性能優(yōu)良的乳酸菌酸奶生產(chǎn)菌株，將生產(chǎn)用保加利亞乳桿菌制備原生質(zhì)體后高溫滅活，滅活后的原生質(zhì)體與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的原生質(zhì)體通過PEG6000誘導(dǎo)進(jìn)行融合，并對融合子性能進(jìn)行研究。結(jié)果從20株融合子中挑選出3株具有噬菌體抗性且發(fā)酵性能優(yōu)良的乳酸菌融合子。融合條件為：以PEG6000（濃度為400 g/L，添加0.01 mol/L CaCl2、0.02 mol/L MgCl2）為促融劑，40℃融合2 min。此條件下，融合率可達(dá)1.85×10-6。獲得的融合子在凝乳、產(chǎn)酸、產(chǎn)粘性物質(zhì)、產(chǎn)香氣成分及抗噬菌體方面性能優(yōu)越，適合于酸奶生產(chǎn)。

單親滅活，保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株，原生質(zhì)體融合，融合子選育

被譽(yù)為“美味食品”的酸奶因具有減緩人體乳糖不耐受性、減輕便秘、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降低血清膽固醇等功能而廣受關(guān)注，需求量不斷增大［1］。隨著需求的增加，乳制品企業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大，生產(chǎn)菌株性能不穩(wěn)定、常受噬菌體污染等問題也就日益凸顯出來［2-3］。在發(fā)酵工業(yè)中，抗噬菌體乳酸菌的選育對于提高發(fā)酵效率，改善產(chǎn)品風(fēng)味等起著非常重要的作用［4］。在發(fā)達(dá)國家，評價(jià)或篩選發(fā)酵劑優(yōu)良菌株的重要標(biāo)準(zhǔn)就是抗噬菌體特性［5］，目前我國在抗性乳酸菌的研究方面還停留在菌株的初步選育階段，在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用很少，其生物學(xué)特性及發(fā)酵穩(wěn)定性有待于進(jìn)一步研究。

酸奶發(fā)酵通常采用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為主要發(fā)酵菌株。傳統(tǒng)上，研究者普遍認(rèn)為嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌存在互惠共生關(guān)系［6］。這兩種菌在牛奶中混合發(fā)酵會提高產(chǎn)酸速度，減弱后酸化程度，促進(jìn)風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生，產(chǎn)生更多的胞外多糖［7-8］。但近年來也有研究表明，某些嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌株之間也存在拮抗抑制作用［9］，混合發(fā)酵時(shí)比例不合適、條件控制不當(dāng)就會直接影響到酸奶的生產(chǎn)時(shí)間與質(zhì)量。因而研究嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌菌株之間的共生關(guān)系，進(jìn)行抗噬菌體菌株的選育，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良性狀發(fā)酵菌株與抗噬菌體菌株的融合，可為工業(yè)化生產(chǎn)篩選出性狀優(yōu)良且質(zhì)量穩(wěn)定的酸奶生產(chǎn)菌株。與傳統(tǒng)誘變或基因工程菌相比，原生質(zhì)體融合可集中雙親優(yōu)良性狀且遺傳穩(wěn)定、安全可靠［10］。常用的合胞體雜種鑒定的方法有：菌體形態(tài)、大小等方面的形態(tài)特征分析；染色體核型、DNA含量、分子雜交等方面的遺傳物質(zhì)分析；同功酶譜、酶活性測定等方面的生理特性分析等［11］。本實(shí)驗(yàn)通過將已有的嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株與具有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的保加利亞乳桿菌進(jìn)行融合，以期篩選出適合酸奶生產(chǎn)的乳酸菌生產(chǎn)菌株。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株（Streptococcus thermophilus，S.t）由本所選育、保藏；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，L.b）酸奶生產(chǎn)廠家提供，本所保藏；噬菌體3種噬菌斑形態(tài)不同的噬菌體混合液，由本所分離、保藏［12］；牛奶山西維爾生物乳制品有限公司提供，食品級；溶菌酶（22800 U/mg）BBI 購于生工生物工程（上海）有限公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

PHS-3C雷磁pH計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；NDJ-1型旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)上海天平儀器廠；SLJ-Ⅰ型離心機(jī)沈陽理化儀器廠；WS2-84-64手提式高壓蒸汽消毒器上海醫(yī)用核子儀器廠；722PC可見分光光度計(jì)上海佑科儀器儀表有限公司；WS2-134-75電熱恒溫培養(yǎng)箱連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠；FA1004電子天平上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；XMTD-4000電熱恒溫水浴鍋北京市永光明醫(yī)療儀器廠；JT-型超凈工作臺常州第二航海儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1試劑及培養(yǎng)基配制高滲溶液（原生質(zhì)體穩(wěn)定液）：10 mmol/L Tris-HCl中加入0.5 mol/L蔗糖和0.02 mol/L MgCl2，用4 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至6.5。

聚乙二醇（PEG6000）：高滲溶液配制為400 g/L，并向其中加入0.01 mol/L CaCl2、0.02 mol/L MgCl2。

溶菌酶液：高滲溶液配制為10 mg/mL的酶原液，現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾除菌。

MRS培養(yǎng)基［13］：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸餾水1000 mL，pH6.2～6.4，固體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂，用于保加利亞乳桿菌的培養(yǎng)。

M17培養(yǎng)基［13］：植物蛋白胨5.0 g，聚蛋白胨5.0 g，酵母提取物5.0 g，牛肉浸膏2.5 g，抗壞血酸0.5 g，β-甘油磷酸二鈉19.0 g，1.0 mol/L MgSO4·7H2O 1.0 mL，蒸餾水1000 mL，pH6.8，固體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂，用于嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的培養(yǎng)。

原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基［14］：MRS、M17再生培養(yǎng)基為在其原有配方的基礎(chǔ)上添加0.5 mol/L蔗糖，0.02 mol/L MgCl2。

脫脂乳培養(yǎng)基：牛乳脫脂后115℃滅菌15 min，冷卻后置于冰箱冷藏備用，用于菌種的活化和菌株發(fā)酵性能的研究。

1.2.2指標(biāo)檢測

1.2.2.1噬菌體效價(jià)測定采用雙層瓊脂平板法［15］。

1.2.2.2酸奶酸度測定按GB/T 5409-85中滴定酸度的測定方法。

1.2.2.3pH測定采用酸度計(jì)于室溫測定。

1.2.2.4粘度測定采用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)，取牛乳發(fā)酵后4℃冷藏12 h的樣品進(jìn)行測定。

1.2.2.5乙醛含量測定乙醛在酸性條件下與亞硫酸氫鈉發(fā)生加成反應(yīng)生成乙醛亞硫酸氫鈉，其剩余的亞硫酸氫鈉被碘氧化。在堿性條件下，乙醛亞硫酸氫鈉與碘定量反應(yīng)，根據(jù)當(dāng)量關(guān)系計(jì)算乙醛含量［16］。

1.2.2.6發(fā)酵活力測定酸度測定法：向滅菌脫脂乳中加3%發(fā)酵劑（菌體牛乳培養(yǎng)物），在適宜溫度下（42℃）培養(yǎng)3.5 h，滴定其酸度。以乳酸酸度值來表示發(fā)酵活力，具體測定步驟如下：稱取10 g（精確到0.001 g）已混勻的試樣，置于150 mL錐形瓶中，加20 mL新煮沸冷卻至室溫的水，混勻，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液電位滴定至pH8.3為終點(diǎn)；或于溶解混勻后的試樣中加入2.0 mL酚酞指示液，混勻后用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色，并在30 s內(nèi)不褪色，記錄消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液毫升數(shù)，代入下面公式中進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果以兩次平行實(shí)驗(yàn)的平均值表示。

式中：X—試樣的酸度，°T；c—?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，mol/L；V—滴定時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；m—試樣的質(zhì)量，g；0.1—酸度理論定義氫氧化鈉的摩爾濃度，mol/L；0.009—相當(dāng)于乳酸（90%）的量。

1.2.3保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的培養(yǎng)將菌株從保存管中取出，以3%的接種量接種于脫脂乳培養(yǎng)基中，嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株42℃培養(yǎng)4～6 h，保加利亞乳桿菌40℃培養(yǎng)10～12 h，連續(xù)活化2代。菌種活化后，嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株接入M17液體培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)10 h；保加利亞乳桿菌接入MRS液體培養(yǎng)基中，40℃培養(yǎng)12 h。

1.2.4保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的原生質(zhì)體制備保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株培養(yǎng)到對數(shù)期后，收集菌體。30 mL高滲溶液洗滌2次后，15 mL高滲溶液懸浮，以溶菌酶作為去壁酶系進(jìn)行原生質(zhì)體的制備，酶解后再用15 mL高滲溶液懸浮得原生質(zhì)體液。原生質(zhì)體制備條件如表1。

表1　保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株原生質(zhì)體制備條件Table 1　Protoplast preparation conditions of Lactobacillus bulgaricus and the bacteriophage-resistant mutants of Streptococcus thermophilus

1.2.5保加利亞乳桿菌的原生質(zhì)體滅活保加利亞乳桿菌原生質(zhì)體液于60℃水浴中恒溫滅活50 min，取滅活前與滅活后的原生質(zhì)體液適當(dāng)稀釋后涂MRS再生培養(yǎng)基平皿，40℃培養(yǎng)3～5 d后計(jì)數(shù)。

式中：A1為滅活前長出的菌落數(shù)；A2為滅活后長出的菌落數(shù)。

1.2.6保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的原生質(zhì)體融合滅活的保加利亞乳桿菌原生質(zhì)體液與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株原生質(zhì)體液等量混合，取樣分別涂M17、M17再生平皿，混合后放置5 min，2500 r/min離心10 min，收集原生質(zhì)體，于沉淀中加入0.2 mL高滲溶液充分懸浮，再加入1.8 mL PEG6000溶液，混勻后分別于30、35、40、45℃處理1、2、5、10 min，2500 r/min離心10 min后懸浮于2 mL高滲溶液中，將懸浮液適當(dāng)稀釋后涂MRS再生平皿。M17平皿42℃，培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)；M17、MRS再生平皿42℃，培養(yǎng)3～5 d后計(jì)數(shù)。

式中：D為融合子數(shù)，即融合后在MRS再生培養(yǎng)基上長出的菌落數(shù)；E為融合前在M17再生培養(yǎng)基上長出的菌落數(shù)；F為融合前在M17培養(yǎng)基上長出的菌落數(shù)。

1.2.7融合子的抗噬菌體性能檢測

1.2.7.1融合子的噬菌體抗性檢測采用雙層瓊脂平板法進(jìn)行檢測［12］：噬菌體增殖液（濃度為109PFU/mL）稀釋到10-4，取稀釋液0.1 mL和融合子的MRS培養(yǎng)液0.3 mL于20 mL滅菌小三角瓶中，再加入50℃左右的上層培養(yǎng)基，混勻后倒雙層平板，42℃培養(yǎng)48 h后觀察有無噬菌斑出現(xiàn)。

1.2.7.2融合子的抗噬菌體穩(wěn)定性檢測融合子抗噬菌體能力的穩(wěn)定性通過傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證［12］：將獲得的融合子以3%接種量在牛乳培養(yǎng)基中傳代15代，取第5、10、15代以雙層瓊脂平板法檢測有無噬菌斑出現(xiàn)；將融合子以3%接種量與噬菌體增殖液（109PFU/mL）在牛乳培養(yǎng)基中共同傳代15代，觀察牛乳的凝固情況。

1.2.7.3融合子的溶源性檢測將篩選出來的融合子以3%接種量接種到MRS培養(yǎng)基中，1 h后加入0.4 ng/mL的絲裂霉素（mmc）誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)，16 h后向菌液中加幾滴氯仿劇烈振蕩、3500 r/min離心15 min，取上清液做雙層平板檢查，觀察有無噬菌斑出現(xiàn)［12］。

1.2.8融合子發(fā)酵性能的初步篩選測定將所獲得的遺傳穩(wěn)定的融合子分別以3%的接種量接入150 mL滅菌牛乳中，42℃培養(yǎng)，每隔2 h測定其活菌數(shù)及pH。發(fā)酵結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)融合子的凝乳時(shí)間、粘度、乙醛含量及滴定酸度，并測定融合子的發(fā)酵活力。

1.2.9融合子在高噬菌體環(huán)境下的發(fā)酵性能測定將初步鑒定生長、發(fā)酵性能優(yōu)越的融合子與敏感菌株以3%的接種量接入150 mL滅菌牛乳中，向其中加入最佳感染復(fù)數(shù)（0.01）的噬菌體，每2 h測定其活菌數(shù)及pH，待發(fā)酵結(jié)束后，測定粘度、乙醛含量、凝乳時(shí)間并滴定酸度，結(jié)合感官評價(jià)挑選優(yōu)良抗性菌株。感官評價(jià)方法為：10位食品研究人員品嘗，并描述產(chǎn)品的口感、滋氣味、乳清析出、組織狀態(tài)等感官性狀；氣味在封蓋打開后馬上檢測，乳清析出通過觀察凝乳表面評定，組織狀態(tài)用勺子在凝乳中輕輕攪拌均勻后觀察；根據(jù)描述撰寫感官風(fēng)味評價(jià)。

1.2.10融合子Rh6的富集培養(yǎng)培養(yǎng)選用MRS培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程中以Na2HPO4-檸檬酸（pH6.5）為緩沖液，42℃靜置培養(yǎng)，每隔2 h晃動并取樣測定其活菌數(shù)及pH。

1.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有測定數(shù)據(jù)，采用Office Excel 2003（美國微軟公司）整理、繪圖，采用SPSS19.0軟件（美國IBM）統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2　結(jié)果與討論

2.1保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的培養(yǎng)及原生質(zhì)體制備

嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株培養(yǎng)10 h進(jìn)入對數(shù)生長期，保加利亞乳桿菌培養(yǎng)12 h進(jìn)入對數(shù)生長期，菌體量均可達(dá)109CFU/mL。按表1的原生質(zhì)體制備條件，保加利亞乳桿菌的原生質(zhì)體形成率為91.5%± 2.62%，嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的原生質(zhì)體形成率為99.15%±0.23%。

2.2保加利亞乳桿菌的原生質(zhì)體滅活

保加利亞乳桿菌原生質(zhì)體液于60℃水浴中恒溫滅活50 min，滅活率為98.64%±1.33%。

2.3滅活保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株原生質(zhì)體融合條件的確定

滅活保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，在高滲溶液中由PEG6000促融，融合溫度及融合時(shí)間對融合率的影響如圖1所示。

圖1　融合溫度和融合時(shí)間對原生質(zhì)體融合率的影響Fig.1　Effect of temperature and time on protoplast fusion rate

由圖1可知，原生質(zhì)體融合時(shí)，時(shí)間不宜太長，這可能與融合時(shí)PEG6000會對原生質(zhì)體造成一定的損傷有關(guān)［17］。最佳融合條件為：40℃，融合2 min，此條件下，融合率為1.85×10-6。

2.4融合子的檢出及融合子的菌體形態(tài)

保加利亞乳桿菌可以在MRS、M17培養(yǎng)基上生長，而本實(shí)驗(yàn)用到的嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株在MRS培養(yǎng)基上非厭氧培養(yǎng)時(shí)不生長，融合前保加利亞乳桿菌原生質(zhì)體幾乎全部滅活，因而可以認(rèn)為融合后在MRS再生平皿上普通培養(yǎng)時(shí)生長的菌落即為融合子。將融合后再生于原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上的20株菌的菌落標(biāo)記并接入牛乳培養(yǎng)基中保存。通過凝乳時(shí)間檢測挑選出3株凝乳較快的融合子，分別命名為Rh1、Rh6、Rh9，其中以Rh6凝乳最快，其菌體形態(tài)如圖2所示，融合子Rh6呈橢圓形近似短桿，而出發(fā)菌株保加利亞乳桿菌為長桿狀，嗜熱鏈球菌為圓形。

圖2　融合前后菌體形態(tài)（×1000）Fig.2　Micrographs of Lactobacillus bulgaricus（A），the bacteriophage-resistant mutants of Streptococcus thermophilus（B）and their fusants（C）（×1000）

2.5融合子的抗噬菌體性能檢測

對篩選到的3株性能優(yōu)良的融合子進(jìn)行抗噬菌體能力檢測，采用雙層瓊脂平板法42℃培養(yǎng)48 h后觀察均無噬菌斑出現(xiàn)，說明3株融合子對噬菌體具有抗性。進(jìn)行溶源性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3株融合子所對應(yīng)的雙層平板上都沒有噬菌斑出現(xiàn)，說明此3株融合子為非溶源菌。進(jìn)行傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為在第5、10、15代時(shí)都沒有噬菌斑出現(xiàn)，且融合子以3%接種量與噬菌體增殖液（109PFU/mL）在牛乳培養(yǎng)基中共同傳代，到第15代時(shí)仍可實(shí)現(xiàn)牛乳的正常凝固。說明融合子的抗噬菌體能力在遺傳上是穩(wěn)定的。

篩選到的融合子非厭氧培養(yǎng)時(shí)可以在MRS培養(yǎng)基上生長且具有噬菌體抗性，菌體形態(tài)有別于出發(fā)菌株保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌抗噬菌體菌株，因此雖未作遺傳物質(zhì)方面的深入研究，但從融合子的生長特征、形狀大小等表觀特征看，確為區(qū)別于雙親的融合子。

2.6融合子發(fā)酵性能初步測定

對具有遺傳穩(wěn)定性的3株融合子進(jìn)行發(fā)酵性能初步測定。每隔2 h在無菌的環(huán)境下取發(fā)酵樣本，測定融合子的活菌數(shù)及pH，結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖3　融合子發(fā)酵過程活菌數(shù)Fig.3　The number of fusant in the fermentation process

圖4　融合子發(fā)酵過程pHFig.4　The pH in the fermentation process

由圖3可見，Rh6生長較快，Rh1、Rh9相對較緩慢。由圖4可知，Rh6的產(chǎn)酸能力較好。因此，初步判斷Rh6較適宜發(fā)酵生產(chǎn)。

發(fā)酵結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)融合子的凝乳時(shí)間、粘度、乙醛含量及滴定酸度，并測定融合子的發(fā)酵活力，結(jié)果如表2所示。

表2　融合子發(fā)酵結(jié)果（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Table 2　The fermentation results of fusants（mean±SD）

由表2可知，Rh6的各項(xiàng)性能比較優(yōu)越，綜合以上融合子的特性及發(fā)酵能力，初步篩選出Rh6做進(jìn)一步的研究，它的抗性穩(wěn)定，生長能力、產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，凝乳時(shí)間較短，粘度及乙醛含量較高，比較適合發(fā)酵生產(chǎn)。

2.7融合子在高濃度噬菌體條件下的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

對融合子Rh6及通常酸奶發(fā)酵時(shí)使用的保加利亞乳桿菌L.b與嗜熱鏈球菌S.t的混合發(fā)酵劑進(jìn)一步在高濃度噬菌體條件下（噬菌體濃度為109PFU/mL）進(jìn)行牛乳發(fā)酵，測定各項(xiàng)指標(biāo)。

2.7.1活菌數(shù)及pH結(jié)果每隔2 h取樣涂平板測定活菌數(shù)及pH，結(jié)果如圖5所示。

圖5　高濃度噬菌體條件下活菌數(shù)及pHFig.5　The number of fusant and pH under high concentrations of phage

由圖3及圖5可知，Rh6在高濃度噬菌體發(fā)酵過程中，生長速度較無噬菌體時(shí)有所減慢，菌體量有所減少，但變化不是很大，4～6 h菌體量可達(dá)109CFU/mL，達(dá)到酸奶發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)；而保加利亞乳桿菌L.b與嗜熱鏈球菌S.t的混合發(fā)酵劑為噬菌體的敏感菌株，在噬菌體存在的情況下明顯生長緩慢，產(chǎn)酸能力下降，無法滿足酸奶發(fā)酵的需要。

2.7.2發(fā)酵凝乳時(shí)間、滴定酸度、乙醛含量、粘度及感官風(fēng)味評價(jià)結(jié)果菌株在高濃度噬菌體存在的條件下的發(fā)酵凝乳時(shí)間、滴定酸度、乙醛含量、粘度結(jié)果見表3，風(fēng)味感官評價(jià)見表4。

表3　高濃度噬菌體條件下的菌株發(fā)酵情況（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Table 3　The fermentation results of fusants and susceptible strain under high concentrations of phage（mean±SD）

表4　高濃度噬菌體發(fā)酵后酸奶的感官風(fēng)味評價(jià)Table 4　Sensory flavor evaluation of yoghourt under high concentrations of phage

由表3、表4可知，保加利亞乳桿菌L.b與嗜熱鏈球菌S.t的混合發(fā)酵劑在高濃度噬菌體條件下發(fā)酵的酸奶粘度大幅降低，凝乳時(shí)間變長，異常凝乳中檢測發(fā)現(xiàn)有雜菌污染；Rh6整體發(fā)酵性能較好，粘度有所下降、凝乳時(shí)間有所延長，但變化不是很大，高濃度噬菌體的存在對酸奶發(fā)酵基本沒有影響。

2.8融合子Rh6的富集培養(yǎng)

對篩選到的融合子Rh6進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果如圖6。

圖6　融合子富集培養(yǎng)時(shí)的活菌數(shù)及pHFig.6　The number of bacteria and pH of fusants enrichment culture

由圖6可知，培養(yǎng)過程中通過緩沖鹽調(diào)控pH，融合子的活菌數(shù)可達(dá)1010CFU/mL，富集培養(yǎng)活菌數(shù)達(dá)到了制備酸奶發(fā)酵劑的要求［18］，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。

3　結(jié)論

通過單親滅活、原生質(zhì)體融合篩選到一株具有優(yōu)良酸奶發(fā)酵特性及抗噬菌體功能的乳酸菌融合子。經(jīng)培養(yǎng)條件優(yōu)化，富集培養(yǎng)時(shí)菌體濃度可達(dá)1010CFU/mL，適合酸奶發(fā)酵工業(yè)。

通過對選育到的融合子的發(fā)酵特性研究表明：融合子性能優(yōu)良且可實(shí)現(xiàn)酸奶生產(chǎn)單菌株發(fā)酵。融合子單獨(dú)進(jìn)行酸奶發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)酸、產(chǎn)粘性物質(zhì)、產(chǎn)香氣成分等特性均可達(dá)到保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌混合發(fā)酵的標(biāo)準(zhǔn)；在噬菌體存在的情況下，對噬菌體敏感的混合發(fā)酵劑無法完成酸奶發(fā)酵，而融合子雖然在菌體生長量方面有所下降（菌體生長量下降原因還不明確），但對酸奶發(fā)酵影響不大，完全可以完成酸奶發(fā)酵。

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Breedingoffusantbetweensingleinactivated Lactobacillusbulgaricus and bacteriophage-resistant mutant of Streptococcus thermophilus

WANG Mu-hua1，PAN Pei-ping1，ZHAO Yu-ming1，2，SU Bin-nan1，CAI Ying-hui1，LI Hai-tao1，2
（1.Shanxi Institute of Biology，Taiyuan 030006，China；2.Shanxi Veal Biological Dairy Products Co.Ltd.，Taiyuan 030006，China）

To obtain yogurt production strains with functions of phage resistant and good fermentation performance，protoplast fusion between single inactivated Lactobacillus bulgaricus and bacteriophage-resistant mutant of Streptococcus thermophilus was performed by the induction of PEG6000 and the performances of fusant were studied.Finally，three lactic acid bacteria fusants with functions of phage resistant and good fermentation performance were selected from 20 fusants that were obtained through fusion.The fusion rate reached 1.85× 10-6after 2 min of infusion at 40℃in the PEG6000.The performances of the fusant were superior at producing acid，solidifying milk，producing good smell and resisting phage，so it was applicable to yoghurt production.

single inactivation；Lactobacillus bulgaricus；bacteriophage-resistant mutant of Streptococcus thermophilus；protoplast fusion；fusant breeding

TS201.2

A

1002-0306（2015）20-0229-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.040

2015－01－20

王慕華（1975-），女，碩士，副研究員，研究方向：工業(yè)微生物、乳品發(fā)酵，E-mail：wang_muhua@126.com。

山西省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（20120311030）。