大孔樹脂動態(tài)吸附前后羅非魚下腳料蛋白酶解液的理化特性比較

蔣雄武，楊　萍，張瑞瑞，洪鵬志，周春霞（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524088）

大孔樹脂動態(tài)吸附前后羅非魚下腳料蛋白酶解液的理化特性比較

蔣雄武，楊萍，張瑞瑞，洪鵬志，周春霞
（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524088）

為大孔樹脂改善魚下腳料酶解液的風(fēng)味提供理論依據(jù)。采用大孔樹脂AB-8和DA20-C動態(tài)吸附羅非魚下腳料蛋白酶解液，分析產(chǎn)物的基本成分、分子量分布、氨基酸含量、揮發(fā)性成分及腥苦味變化。結(jié)果表明：經(jīng)大孔樹脂AB-8和DA201-C吸附后的酶解液：腥苦味值都降低；蛋白質(zhì)含量分別減少2.02%和9.05%，灰分和脂肪含量都有所增加；分子量小于1 ku組分分別減少49.1%和53.6%，同時AB-8樹脂使分子量大于8 ku組分減少30.20%，DA201-C使分子量在1～5 ku組分減少70.69%；水解氨基酸和游離氨基酸含量分別減少8.29%、25.39%和15.22%、26.09%；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類分別減少5種和7種，醛類含量由35.94%分別降為31.22%和33.01%，酯類由4.03%降為2.38%和1.99%，含氮類由13.95%降為13.60%和12.07%。大孔樹脂AB-8和DA201-C對羅非魚下腳料蛋白酶解液的理化特性都有較大影響。

大孔樹脂，吸附，羅非魚下腳料，蛋白酶解液，理化特性

羅非魚（Tilapia）一般用于生產(chǎn)凍魚片，生產(chǎn)中伴隨著大量的魚頭、魚皮、魚排以及碎魚肉等加工下腳料產(chǎn)生，其量占整條魚的30%～40%，造成了大量浪費(fèi)，還容易對環(huán)境造成污染［1］。這些下腳料含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸和各種活性物質(zhì)，是一種豐富的資源［2］，因此綜合利用羅非魚下腳料，可以降低成本，提高羅非魚的經(jīng)濟(jì)價值。目前，主要利用酶水解的方法來研究其利用價值［3-4］，水解后主要含有肽、氨基酸以及呈味核苷酸等，雖然具有很好的營養(yǎng)價值，但魚蛋白酶解產(chǎn)物普遍存在苦味和腥味，大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用中仍然存在很多的問題，風(fēng)味便是其中的一個主要問題，尋找有效的方法來改善蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的風(fēng)味很有必要。曾有報(bào)道活性炭吸附［4］、逐級超濾處理［5］、硅藻土和珍珠巖［6］等方法對羅非魚下腳料解產(chǎn)物的風(fēng)味改良效果。大孔吸附樹脂在化學(xué)試劑分離提純和吸附氨基酸研究等方面有廣泛應(yīng)用［7-8］，而且易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。本文探討AB-8和DA201-C兩種樹脂動態(tài)吸附對羅非魚下腳料蛋白酶解液理化特性的影響，皆為大孔樹脂在水產(chǎn)蛋白質(zhì)酶解液的利用提供基礎(chǔ)，為水產(chǎn)蛋白質(zhì)酶解液的風(fēng)味改良提供新的途徑。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

羅非魚下腳料（包括魚頭、魚骨、內(nèi)臟等） 由湛江恒興水產(chǎn)科技有限公司提供；中性蛋白酶（2× 105U/g）、風(fēng)味酶（1.5×104U/g）南寧龐博生物工程有限公司；DA201-C樹脂江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)有限公司；AB-8樹脂南開大學(xué)化工廠；分子量標(biāo)準(zhǔn)品為磷酸異構(gòu)酶triosephosphate isomerase（26625u）、肌球蛋白myoglobin（16950 u）、α-乳白蛋白αlactalbumin（14437 u）、抑肽酶aprotinin（6512 u）、胰島素Binsulin b chain，oxidized（3496 u）、桿菌肽bacitracin（1423 u） Sigma公司。

N1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、FDU真空冷凍干燥機(jī)東京理化器械株式會社；LC-20A高效液相色譜儀日本島津；835-50型高速氨基酸分析儀日本Hitachi公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1酶解液的制備取一定量解凍后羅非魚下腳料，置于燒杯中，按1∶3（W∶V）比例加水，于恒溫水浴鍋中預(yù)熱，同時加入中性蛋白酶500 U/g和風(fēng)味酶30 U/g，自然pH，溫度55℃，酶解4 h后，100℃滅酶10 min，3000 r/min離心，去掉上層脂肪及下層沉淀，即得酶解液，分裝冷藏，備用。

1.2.2大孔樹脂的預(yù)處理室溫下，用無水乙醇溶液浸泡樹脂24 h，再用去離子水洗去無水乙醇，然后用5%HCl溶液浸泡4 h，去離子水洗至中性，再用2% NaOH溶液浸泡4 h，去離子水洗至中性備用。

1.2.3大孔樹脂動態(tài)吸附量取80 mL預(yù)處理后的大孔吸附樹脂，采用漂浮法篩選樹脂，濕法裝柱（?2.6 cm×60 cm），待液面高于樹脂床表面2 cm時，開始以3 BV/h的流速上樣，將蛋白質(zhì)含量為7.2 mg/mL酶解液連續(xù)加入樹脂柱，待樣品流出后，收集流出液至樹脂吸附飽和。

1.2.4感官評價由8名（男∶女=1∶1）經(jīng)過訓(xùn)練的感官評價員在食品感官實(shí)驗(yàn)室（室溫25℃）內(nèi)進(jìn)行。按照感官評定的要求，每次的樣品數(shù)最多不得超過10個，評定過程中不得相互交流，每次評定樣品要間隔幾分鐘，以蒸餾水作為參照（分值為0）。根據(jù)強(qiáng)度系數(shù)打分，三次分值的平均值即表示酶解液的腥味程度。感官特性強(qiáng)度數(shù)字標(biāo)度為：0-沒有腥（苦）味；1-腥（苦）味略有；2-腥（苦）味較弱；3-腥（苦）味一般；4-腥（苦）味偏重；5-腥（苦）味很重。色澤的評價：直接觀察比較法。

1.2.5基本成分測定水分：直接干燥法（GB/T 5009.3-2010）；灰分：550℃灼燒法（GB 5009.4-2010）；蛋白質(zhì)：半微量凱氏定氮法（GB/T 5009.5-2010）；脂肪：索氏抽提法（GB/T 5009.6-2003）。

1.2.6分子量分布測定采用高效體積排阻色譜（HPSEC）測定酶解液的分子量分布。色譜柱為Protein-PakTM60A 7.8 mm×300 mm Column；流動相為0.05 mol/L Tris-HCl溶液（pH7.2），流速0.7 mL/min，檢測波長214 nm。根據(jù)分子量大小對數(shù)與保留時間得分子量標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程為lgMw=-0.2160t+ 6.3118，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9770。樣品的分子量根據(jù)其保留時間和標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。

1.2.7氨基酸測定樣品經(jīng)6 mol/L HCl水解后，采用高速氨基酸分析儀進(jìn)行17種氨基酸含量測定。另取樣品經(jīng)5 mol/L NaOH水解，同機(jī)測定色氨酸含量。1.2.8揮發(fā)性風(fēng)味成分的測定

1.2.8.1頂空固相微萃取稱取固體樣品0.300 g，加入萃取瓶以超純水溶解完全，將萃取瓶置于樣品盤，萃取頭以頂空方式萃取，溫度70℃，時間40 min，萃取結(jié)束后，插入自動進(jìn)樣口，在250℃條件下解析10 min。

1.2.8.2GC-MS分析色譜條件：VF-WAX ms色譜毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為氦氣，體積流量1.0 mL/min。程序升溫條件：初始柱溫50℃，保持2 min；以4℃/min升溫至200℃，再以10℃/min升溫至250℃，保持4 min。進(jìn)樣模式為不分流，進(jìn)樣口溫度250℃。質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，離子源溫度200℃，接口溫度200℃，分子質(zhì)量（m/z）掃描范圍為35～400，掃描速度為1428。

1.2.8.3數(shù)據(jù)處理將采集到的質(zhì)譜圖通過GC-MS化學(xué)工作站與 NIST08.LIB和Wiley9.lib標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索，再根據(jù)保留時間、質(zhì)譜、人工圖譜解析等參數(shù)來確定揮發(fā)性成分的化學(xué)組成，計(jì)算出各成分的相對含量。

2　結(jié)果與分析

2.1大孔樹脂動態(tài)吸附前后酶解液的感官分析

經(jīng)過AB-8和DA201-C樹脂吸附處理后的羅非魚下腳料酶解液，感官評價結(jié)果見表1。由表1可知，色澤從黃褐色變?yōu)榈?、微黃色，腥味和苦味評分大大降低，其中DA201-C脫腥苦味的效果更好，腥味和苦味分別從4.8和4.5降到了1.5和1.3。說明AB-8和DA201-C樹脂能有效地改善羅非魚下腳料酶解液的腥苦味。

表1　處理前后酶解液的感官評價Table 1　Sensory score of hydrolysis before and after adsorption treatment by macroporous resins

2.2大孔樹脂動態(tài)吸附前后酶解液的基本成分分析

將樹脂動態(tài)吸附前后的羅非魚下腳料酶解液冷凍干燥制成干粉，分析其基本成分。由表2可知，AB-8與DA201-C兩種樹脂吸附處理后，酶解液的蛋白質(zhì)含量分別降低2.02%與9.05%，而灰分和脂肪含量都有所增加。張佳秀等［9］也發(fā)現(xiàn)大孔樹脂對于鹽溶液不具有吸附性?？梢娪捎诘鞍踪|(zhì)含量的降低，同時兩種樹脂對灰分和脂肪沒有吸附作用，因而其含量相對增加。

表2　處理前后酶解液的基本成分分析（干基計(jì)，%）Table 2　The basic ingredients of hydrolysis before and after adsorption treatment by macroporous resins（dry basis，%）

2.3大孔樹脂動態(tài)吸附前后酶解液的分子量分布

羅非魚下腳料酶解液經(jīng)樹脂AB-8和DA201-C處理前后的HPSEC圖見圖1～圖3，分子量分布如表3所示。

圖1　羅非魚下腳料酶解液的HPSEC圖Fig.1　HPSEC chromatogram of enzymatic hydrolysis of tilapia scraps

圖2　大孔樹脂AB-8吸附后的酶解液的HPSEC圖Fig.2　HPSEC chromatogram of enzymatic hydrolysis of tilapia scraps by macroporous resins AB-8

圖3　大孔樹脂DA201-C吸附后的酶解液的HPSEC圖Fig.3　HPSEC chromatogram of enzymatic hydrolysis of tilapia scraps by macroporous resins DA201-C

表3　酶解液吸附處理前后分子量分布Table 3　Molecular weight distribution of the components of hydrolysis before and after adsorption treatment

經(jīng)AB-8和DA201-C兩種樹脂吸附后，酶解液中分子量的分布有很大的變化，分子量小于1 ku的組分所占比例分別減少了49.1%和53.6%，說明樹脂較易吸附分子量小于1 ku的組分，即游離氨基酸和短肽。AB-8樹脂對分子量大于10 ku組分與8～10 ku組分也有吸附作用，比例分別減少了33.89%和27.80%。DA201-C樹脂對1～2 ku組分和2～5 ku組分具有很大的吸附作用，比例分別減少了85.6%與61.5%。研究表明［10］，苦味肽大部分含有2～15個氨基酸殘基，鄧勇等［11］發(fā)現(xiàn)分子量大于5 ku的大豆肽不具有苦味，而500～1000 u之間短肽苦味最強(qiáng)。樹脂吸附后，短肽含量的降低可能與酶解液的腥苦味改善有很大關(guān)系，這與感官評價結(jié)論也是一致的。

2.4大孔樹脂動態(tài)吸附前后酶解液的氨基酸變化

由表4可知，經(jīng)AB-8和DA201-C吸附處理后，酶解液中水解氨基酸總量分別減少了8.29%和25.39%，必需氨基酸總量分別減少9.60%和27.05%；苦味氨基酸的總量分別減少了12.67%和30.12%，占水解氨基酸比例分別減少1.27%與1.68%；鮮味氨基酸和甜味氨基酸總量分別減少了10.0%、28.0%與8.13%、26.19%，但占水解氨基酸比例變化不明顯；吸附損失較多的氨基酸有苯丙氨酸與色氨酸，損失量分別為AB-8的18.99%、27.78%與DA201-C的40.51%、63.89%。這些氨基酸的變化改善了酶解液的整體風(fēng)味。

由表5可知，AB-8和DA201-C吸附后，游離氨基酸總量分別減少了15.22%和26.09%；必需氨基酸總量分別減少14.29%和26.01%；苦味氨基酸總量分別減少了15.49%和28.76%，占游離氨基酸比例分別減少0.16%與1.81%；鮮味氨基酸和甜味氨基酸總量分別減少了21.62%、29.73%與16.01%、20.69%，鮮味氨基酸占游離氨基酸的比例變化不大，且DA201-C樹脂吸附后，其甜味氨基酸占游離氨基酸比例反而增加了1.38%。AB-8樹脂吸附后，損失較多的氨基酸為酪氨酸、天冬氨酸、絲氨酸和谷氨酸，損失量分別為26.32%、25%、20%和20%。DA201-C吸附后，損失較多的氨基酸為苯丙氨酸、天冬氨酸、酪氨酸和蛋氨酸，損失量分別為46.81%、33.33%、31.58%和26.67%，以苦味氨基酸為主，這與感官評價結(jié)論是一致的。趙謀明等［9］研究XDA-200靜態(tài)吸附草魚蛋白酶解液中游離氨基酸時，也發(fā)現(xiàn)樹脂對氨基酸的吸附具有一定選擇性。

表5　樹脂吸附前后游離氨基酸的變化Table 5　The content of free amino acids in components hydrolysis before and after adsorption treatment by macroporous resins

結(jié)合表4和5表可知，AB-8與DA201-C吸附處理前后，游離氨基酸分別損失了0.70 mg/mL和1.20 mg/mL；水解氨基酸分別損失了1.60 mg/mL和4.90 mg/mL，說明樹脂吸附不僅吸附游離氨基酸，也吸附肽，這與液相分析的結(jié)果是一致的。

2.5大孔樹脂動態(tài)吸附前后酶解液的揮發(fā)性成分變化

羅非魚酶解液分別經(jīng)大孔樹脂AB-8和DA201-C吸附處理后，GC-MS分析，其揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流色譜圖見圖4～圖6。

圖4　羅非魚下腳料酶解液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS總離子流圖Fig.4　Total ion current chromatogram of volatile compounds in tilapia enzymatic hydrolyzates

經(jīng)吸附處理前后酶解液的揮發(fā)性物質(zhì)種類及含量的變化見表6?？梢?，酶解液、經(jīng)AB-8及DA201-C吸附處理的酶解液檢測到的風(fēng)味物質(zhì)種類分別為73種，68種和66種。經(jīng)樹脂處理后的酶解液揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中，醛類、酯類和含氮類物質(zhì)所占的比例下降，醛類由35.94%分別降低為31.22%和33.01%，酯類物質(zhì)由4.03%降低為2.38%和1.99%，含氮類由13.95%降低為13.60%和12.07%；酸類和烴類物質(zhì)的相對含量均增加，酸類由12.47%分別增加為23.03%和17.39%；烴類物質(zhì)由9.34%分別增加為10.18%和14.11%。水產(chǎn)品中的魚腥味并不是單一物質(zhì)形成的，而是多種物質(zhì)的協(xié)同作用，這些物質(zhì)主要包括醛類、酮類、酯類、烴類等多種化合物，且這些化合物的相對分子質(zhì)量大多數(shù)在200 u以下，其中醛類、含氮類對水產(chǎn)品的腥味有著重要作用［12］，醛類、含氮類的減少可能是腥味變小的原因。

圖5　AB-8吸附后羅非魚下腳料酶解液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS總離子流圖Fig.5　Total ion current chromatogram of volatile compounds in tilapia by AB-8

圖6　DA201-C吸附后羅非魚下腳料酶解液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS總離子流圖Fig.6　Total ion current chromatogram of volatile compounds in tilapia by DA201-C

表6　羅非魚下腳料酶解液樹脂吸附前后揮發(fā)性成分的種類及比例Table 6　The types and proportions of volatile components before and after adsorption treatment by macroporous resins

3　結(jié)論

經(jīng)過AB-8和DA201-C樹脂吸附處理后的羅非魚下腳料酶解液，腥味和苦味均變淡變小，以DA201-C的效果更明顯；蛋白質(zhì)含量降低，灰分和脂肪含量都增加；樹脂較易吸附分子量小于1 ku的組分，同時AB-8對分子量大于8 ku組分、DA201-C對1～5 ku組分也具有較大的吸附作用；大孔樹脂處理酶解液，使得氨基酸總量都下降，其中苦味氨基酸所占比例下降，鮮甜味氨基酸所占比例不變或稍增加；DA201-C吸附較多的苦味氨基酸；揮發(fā)性物質(zhì)的種類分別減少了5、7種，醛類、酯類和含氮類物質(zhì)所占的比例下降，酸類和烴類物質(zhì)的相對含量均增加。綜合來說，大孔樹脂適合用于羅非魚下腳料酶解液的脫腥脫苦，其吸附的腥苦味氨基酸或肽，可通過洗脫加以回收，一方面得到低腥苦味的酶解液，另一方面可以回收腥苦味氨基酸或肽，為酶解液的開發(fā)利用提供良好的基礎(chǔ)。本研究下一步應(yīng)該將吸附的肽洗脫收集分析其風(fēng)味與氨基酸的組成，為大孔樹脂能脫腥脫苦提供更有力的證明。

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Comparative of physicochemical properties of tilapia scraps enzymatic hydrolyzate treated by dynamic adsorption of macroporous resin

JIANG Xiong-wu，YANG Ping，ZHANG Rui-rui，HONG Peng-zhi，ZHOU Chun-xia
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Safety，Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution，Zhanjiang 524088，China）

To provide a theoretical basis for improving the flavor of fish scraps enzymatic hydrolyzate through macroporous resin.AB-8 and DA201-C macroporous resin dynamic was used to adsorp tilapia scraps hydrolyzate，and the basic ingredients，molecular weight distribution，amino acid content，volatile flavor components and fishy bitterness flavor of the hydrolyzates were analyzed.Results：After absorption treatment by AB-8 and DA201-C macroporous resin，the fishiness and bitterness of enzymatic hydrolysates became litter.The loss rates of protein were 2.02%and 9.05%，respectively，but the relative contents of fat and ash were increased.The components with molecular weight less than 1 ku were decreased by 49.1%and 53.6%，meanwhile，for AB-8 absorption treatment the components with molecular weight more than 8 ku was reduced by 30.20%and for DA201-C absorption treatment the components with molecular weight 1～5 ku was reduced by 70.69%.The relative content of the hydrolysis and free amino acids were decreased by 8.29%，25.39%and 15.22%，26.09%respectively. The disappeared species composition of volatile flavor compounds were 5 and 7，and the relative content of aldehydes，esters，and nitrogenous were reduced after adsorption with aldehydes from 35.94%to 31.22%and 33.01%，esters from 4.03%to 2.38%and 1.99%，nitrogenous from 13.95%to 13.60%and 12.07%.AB-8 and DA201-C absorption treatment could affect physicochemical properties greatly of Tilapia scraps hydrolyzate. Key words：macroporous resin；adsorption；tialapia scraps；enzymatic hydrolysates；physicochemical properties

TS254.1

A

1002-0306（2015）20-0102-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.012

2014－09－10

蔣雄武（1990-），男，在讀碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)品加工工程，E-mail：460803746@qq.com。

楊萍（1964-），女，教授，研究方向：水產(chǎn)品加工與高值化利用，E-mail：50299052@163.com。

863計(jì)劃項(xiàng)目（2013AA102201）；創(chuàng)新強(qiáng)校工程項(xiàng)目（GDOU2013050204，GDOU2014050203）；省部產(chǎn)學(xué)研合作專項(xiàng)（2013B090800021）。