快速溶劑萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂花粉中氯霉素

祝子銅，雷美康，彭　芳，李　東，陳玉嬌，章應(yīng)?。ㄡ橹莩鋈刖硻z驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，浙江衢州324002）

快速溶劑萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂花粉中氯霉素

祝子銅，雷美康，彭芳，李東，陳玉嬌，章應(yīng)俊
（衢州出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，浙江衢州324002）

建立了快速溶劑萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測定蜂花粉中氯霉素的分析方法。樣品以乙酸乙酯為萃取溶劑經(jīng)快速溶劑萃取儀（ASE）萃取，硅膠固相萃取柱凈化，采用液質(zhì)聯(lián)用多反應(yīng)監(jiān)測負(fù)離子模式測定，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。方法線性范圍0.5～10 ng/mL，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9936，回收率在88.3%～110.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.3%～8.9%之間，檢出限為0.1 μg/kg。該方法具有效率高、試劑用量少、選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點。

蜂花粉，快速溶劑萃取，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，氯霉素

氯霉素是一種應(yīng)用廣泛的廣譜抗生素，對各類家禽、家畜、水產(chǎn)品及蜜蜂的各種傳染性疾病的控制和治療起重要作用［1］。同時，氯霉素具有嚴(yán)重的毒副作用，且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，殘留于動物源性食品中的氯霉素嚴(yán)重威脅著人類健康。因此，美國、歐盟、日本和我國等國家都將該類藥物列入禁止使用的獸藥名單中，并制定出相關(guān)的最高殘留限量（MRL）［2］。

對于出口蜂花粉，美國、歐盟、日本等國家都要求檢測其中的抗生素，如氯霉素、硝基咪唑類化合物等。目前氯霉素檢測主要集中在蜂蜜、蜂王漿、水產(chǎn)品、化妝品、肉制品等基質(zhì)中［3-8］，前處理主要采用乙酸乙酯、乙腈等有機試劑進行人工提?。?-11］，操作步驟繁瑣，耗時。對于蜂花粉中氯霉素等抗生素檢測文獻報道較少［12-13］。因此，為了解決蜂花粉中氯霉素檢測技術(shù)問題，保證蜂花粉出口順暢，急需建立一套蜂花粉中氯霉素的檢測方法。

快速溶劑萃取法是近年新發(fā)展的一種前處理技術(shù)，在固體樣品中污染物、動物源性食品中獸藥殘留等的提取中有廣泛的應(yīng)用，具有溶劑用量少、提取時間短和樣品提取自動化等優(yōu)點［14-17］。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法采用1.8 μm填料色譜柱，同時采用三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測，具有分析速度快、分離度大、靈敏度高、定性準(zhǔn)確等優(yōu)點。因此，本研究采用快速溶劑萃取法進行萃取，硅膠固相萃取柱進行凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測，同位素內(nèi)標(biāo)法定量分析蜂花粉中氯霉素。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

硅膠固相萃取柱500 mg，6 mL，上海安譜公司；C18固相萃取柱500 mg，6 mL，上海安譜公司；甲醇、乙酸乙酯色譜純，德國默克公司；乙酸乙酯、正己烷分析純，上海國藥；實驗用水超純水；氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品德國Dr公司；氘代氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品德國Dr公司；蜂花粉一部分為企業(yè)送檢樣品，一部分從浙江江山健康蜂業(yè)有限公司購買。

1260-6460液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀美國安捷倫科技有限公司；E-916快速溶劑萃取儀、R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀瑞士BUCHI公司；MS3 Digital漩渦振蕩器德國IKA公司；固相萃取裝置德國CNW公司；N-EVAPTM111氮吹儀美國organomation公司；BARNSTEAD NANOPURE超純水儀美國賽默飛科技中國有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別精密稱取適量的氯霉素（CAP）標(biāo)準(zhǔn)品和氘代氯霉素（CAP-D5）標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容，配制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。該溶液在4℃的冰箱中保存。中間標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇逐級稀釋成1.0 μg/mL中間標(biāo)準(zhǔn)儲備液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：吸取不同體積的中間標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇水溶液（體積比2∶8）稀釋成0.5、1.5、3.0、5.0、10.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中內(nèi)標(biāo)為5.0 ng/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。按照1.2.3和1.2.4建立的液相色譜條件和質(zhì)譜條件進行測定，作待測物與其同位素內(nèi)標(biāo)物峰面積比對濃度比的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線回歸方程。

1.2.2樣品前處理方法準(zhǔn)確稱取蜂花粉樣品2 g（精確至0.01 g）于150 mL燒杯中，加入100 μL濃度為100 ng/mL的氘代氯霉素內(nèi)標(biāo)溶液，加入2 g硅藻土，將樣品與硅藻土混合均勻，將混和好的樣品轉(zhuǎn)移至底部鋪有石英砂的萃取池中，上部再鋪一層石英砂，加蓋擰緊，將萃取池放入快速溶劑萃取儀中進行萃取，萃取液收集于240 mL收集瓶中，將萃取液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，45℃下旋蒸至近干。加入5 mL乙酸乙酯-正己烷（體積比2∶8）溶解殘渣，待凈化。

硅膠固相萃取柱用5 mL乙酸乙酯-正己烷（體積比2∶8）進行活化，將上述溶液轉(zhuǎn)移至萃取柱中，再加入5 mL乙酸乙酯-正己烷（體積比2∶8）洗滌雞心瓶，洗滌液轉(zhuǎn)移至萃取柱中，棄去流出液，用8 mL乙酸乙酯進行洗脫，接收全部洗脫液，45℃下氮氣吹干，加入1 mL甲醇水溶液（體積比2∶8），超聲1 min，渦旋混合1 min，過0.22 μm濾膜，待分析。

快速溶劑萃取儀萃取效率受萃取溶劑、溫度、壓力、循環(huán)次數(shù)等影響，因此，本研究對上述影響因素進行優(yōu)化。在考察萃取溫度時，使用乙酸乙酯作為萃取溶劑、壓力90 bar、循環(huán)次數(shù)3次，實驗選取90、100、110、120℃4個溫度進行單因素實驗。在考察萃取壓力時，將萃取溫度設(shè)定為100℃、使用乙酸乙酯作為萃取溶劑、循環(huán)次數(shù)3次，實驗選取90、100、110、120 bar 4個萃取壓力進行單因素實驗。在萃取試劑為乙酸乙酯，萃取壓力100 bar，萃取溫度100℃，氮吹60 s，溶劑洗滌30 s條件下，分別選取靜態(tài)萃取循環(huán)次數(shù)2次和3次進行實驗。

對樣品凈化條件進行優(yōu)化，取6支50 mL離心管，分別加入10 mL乙酸乙酯-正己烷（體積比2∶8）溶液，加入50 ng氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，將上述溶液轉(zhuǎn)移至已活化的硅膠固相萃取柱中，固相萃取柱用5 mL乙酸乙酯-正己烷（體積比2∶8）進行活化，再加入5 mL乙酸乙酯-正己烷（體積比2∶8）進行淋洗，棄去流出液，分別用5、6、7、8、9、10 mL乙酸乙酯進行洗脫，接收全部洗脫液，45℃下氮氣吹干，加入1 mL甲醇水溶液（體積比2∶8），超聲1 min，渦旋混合1 min，過0.22 μm濾膜，待分析。

1.2.3液相色譜條件色譜柱：Zorbax SB-C18（2.1 mm× 50 mm，1.8 μm）；流動相：A相為超純水；B相為甲醇；柱溫40℃；流速：0.3 mL/min；進樣量10 μL；液相色譜流速及梯度洗脫見表1。

表1　液相色譜流速及梯度洗脫程序Table 1　HPLC flow rate and gradient elution program

1.2.4質(zhì)譜參數(shù)離子源：電噴霧離子化源（ESI），負(fù)離子模式；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：5 L/min；噴霧氣壓力：50 psi；鞘氣溫度：400℃；鞘氣流速：12 L/min；毛細(xì)管電壓：3000 V；多反應(yīng)監(jiān)測掃描（MRM）采集參數(shù)見表2。

2　結(jié)果與分析

2.1提取條件優(yōu)化

2.1.1萃取溶劑選擇經(jīng)過查閱大量文獻，提取氯霉素類抗生素的試劑主要有乙酸乙酯和乙腈［18-20］。但是乙腈的毒性較大，在對樣品進行高溫高壓提取過程中揮發(fā)出的乙腈會對人體產(chǎn)生毒害。而乙酸乙酯毒性相對較小，且在后續(xù)的濃縮過程中易蒸干，經(jīng)過實驗驗證，乙酸乙酯能夠很好地將氯霉素從蜂花粉基質(zhì)中提取出來，因此，本實驗選用乙酸乙酯為萃取溶劑。

2.1.2萃取溫度優(yōu)化溫度是快速溶劑萃取的重要參數(shù)。隨著溫度的升高，溶劑的粘度下降，溶劑浸潤基質(zhì)和溶解目標(biāo)分析物的能力增強。但是隨著溫度的進一步提高，可能會促進部分抗生素的分解［21］，導(dǎo)致回收率降低。經(jīng)實驗優(yōu)化，本實驗選擇100℃作為萃取溫度。

2.1.3萃取壓力優(yōu)化 加壓的目的是使溶劑在高溫下仍然處于液態(tài)［22］。經(jīng)實驗優(yōu)化，當(dāng)萃取壓力120 bar時，由于壓力較高，儀器易發(fā)生警報不能進行萃取。由圖2可知，萃取壓力為100 bar時萃取效率最高，本實驗選擇100 bar作為萃取壓力。

圖1　萃取溫度對氯霉素萃取效率的影響Fig.1　Effect of extraction temperature in ASE on extraction efficiency of chloramphenicol

圖2　萃取壓力對氯霉素效率的影響Fig.2　Effect of extraction pressure in ASE on extraction efficiency of chloramphenicol

2.1.4循環(huán)次數(shù)優(yōu)化靜態(tài)循環(huán)次數(shù)優(yōu)化結(jié)果表明靜態(tài)萃取循環(huán)2次就基本能夠?qū)⒙让顾剌腿⊥耆Ｒ虼?，本實驗選擇使用靜態(tài)萃取循環(huán)次數(shù)為2次。

圖3　萃取循環(huán)次數(shù)對氯霉素萃取效率的影響Fig.3　Effect of extraction cycle index in ASE on extraction efficiency of chloramphenicol

2.2凈化條件優(yōu)化

由于蜂花粉基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的天然色素、黃酮和纖維成分，在液質(zhì)分析中存在嚴(yán)重的基質(zhì)抑制作用。因此，需要通過一定的凈化方法去除干擾物質(zhì)，降低基質(zhì)抑制作用。本研究分別選取硅膠固相萃取柱和C18固相萃取柱進行比較，在凈化過程中發(fā)現(xiàn)C18固相萃取柱很容易被堵塞。而使用硅膠固相萃取柱沒有發(fā)生堵塞現(xiàn)象且凈化效果良好。因此，本研究選用硅膠固相萃取柱進行凈化。圖4為洗脫溶劑體積對氯霉素洗脫效果影響的比較。由圖4可以看出當(dāng)洗脫體積為7和8 mL時，氯霉素的峰面積最大。當(dāng)洗脫體積大于8 mL時，氯霉素峰面積反而減小?？赡苁怯捎谙疵擉w積增大，在后續(xù)氮吹等實驗過程中目標(biāo)物損失較多。因此，本實驗室選擇使用8 mL洗脫液進行洗脫。

圖4　洗脫溶劑體積對洗脫效果影響的比較Fig.4　The comparison of elution effect with different eluting volume

2.3色譜條件優(yōu)化

色譜柱是色譜分析技術(shù)的核心［23］，本研究比較了Agilent Zorbax SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）和Agilent Eclipse XDB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）2款色譜柱。2款色譜柱在實際的樣品檢測中均能將目標(biāo)分析物和基質(zhì)干擾物分離，且目標(biāo)物峰型對稱、尖銳。Agilent Eclipse XDB-C18因其柱子較長產(chǎn)生的反壓比較大，且增加了分析時間，而Zorbax SB-C18具有更低的反壓、更快的分析速度，能夠大大的提高工作效率。因此，本實驗選擇Agilent Zorbax SB-C18作為液相色譜分析柱。

2.4質(zhì)譜參數(shù)建立

本研究采用液相色譜進樣方式在負(fù)離子模式下對待測化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行母離子全掃描，確定準(zhǔn)分子離子峰［M-1］-，再分別以待測化合物的準(zhǔn)分子離子為母離子進行碎裂，進行二級子離子掃描，選擇2個特征子離子，選擇信噪比大、峰形好、干擾小的離子對作為定量離子對。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表2，利用優(yōu)化后的色譜和質(zhì)譜條件對氯霉素進行分析。

表2　氯霉素液質(zhì)測定條件Table 2　The optimized spectrometric parameters for chloramphenicol residue

2.5內(nèi)標(biāo)物選擇

應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析樣品中痕量獸藥殘留時，基質(zhì)效應(yīng)是時常遇到的現(xiàn)象，基質(zhì)效應(yīng)的出現(xiàn)可導(dǎo)致測試結(jié)果重復(fù)性差，定量結(jié)果難以保證［24］。同位素內(nèi)標(biāo)法是目前液質(zhì)聯(lián)用分析中經(jīng)常使用的一種定量技術(shù)，由于同位素內(nèi)標(biāo)物結(jié)構(gòu)與目標(biāo)分析物一致，受基質(zhì)影響程度相同，在質(zhì)譜中的碎裂行為相似［25］。因此，同位素內(nèi)標(biāo)法可有效的降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高定量的準(zhǔn)確性。本文選用氘代氯霉素（CAP-D5）作為內(nèi)標(biāo)物。

2.6方法的線性關(guān)系、檢出限和定量限

在本研究所確定的條件下，以目標(biāo)分析物與其同位素內(nèi)標(biāo)物濃度比值為橫坐標(biāo)x，以目標(biāo)分析物與同位素內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)y，繪制氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線，氯霉素在0.5～10 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。該方法的檢出限和定量限由空白樣品添加回收實驗獲得，以3倍信噪比（RSN）為檢出限、10倍信噪比（RSN）為定量限，氯霉素的檢出限和定量限分別為0.1 μg/kg和0.3 μg/kg。

表3　氯霉素的線性方程及線性范圍Table 3　Linear ranges and regression equations of Chloramphenicol residue

2.7精密度和回收率

為測定本方法的精密度和回收率，實驗選用空白蜂花粉為樣品基質(zhì)，添加不同量的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，進行加標(biāo)回收實驗，加標(biāo)水平為0.3、0.6、1.0 μg/kg，每個添加水平均做6個平行樣，其結(jié)果見表4。由表4可以看出，氯霉素的加標(biāo)回收率在88.3%～110.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.3%～8.9%之間，能夠滿足分析方法的要求。

表4　回收率與精密度實驗結(jié)果（n=6）Table 4　Mean recovery rates and precision for 6 replicate determinations（n=6）

2.8實際樣品分析

將本研究建立的方法編寫成實驗室的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，應(yīng)用于實驗室的檢測工作。按照1.2.2的前處理方法，對送檢和購買的6批次蜂花粉樣品進行檢測，雖然有個別樣品中有氯霉素峰，但是都小于方法檢出限。其中有峰的兩個樣品，結(jié)果分別為0.08 μg/kg和0.05 μg/kg。下一步將繼續(xù)使用該方法檢測企業(yè)委托送檢的樣品，積累更多的數(shù)據(jù)。

3　結(jié)論

本研究建立了蜂花粉中氯霉素殘留檢測的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）分析方法。通過對液相色譜、質(zhì)譜、快速溶劑萃取儀、硅膠固相萃取柱條件進行優(yōu)化。經(jīng)方法學(xué)驗證，方法線性范圍0.5～10 ng/mL，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9936，回收率在88.3%～110.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.3%～8.9%之間，檢出限為0.1 μg/kg。本研究與文獻［12］中的方法相比，在萃取環(huán)節(jié)采用了快速溶劑萃取儀進行萃取，減少了人工操作，自動化水平大大提高。在凈化過程中，文獻［12］使用2種固相萃取柱進行凈化，本研究僅使用1種固相萃取柱進行凈化，大大降低了時間和物力成本。本研究使用同位素內(nèi)標(biāo)法進行定量，方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均能滿足獸藥殘留分析方法的要求。

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Determination of chloramphenicol residue in bee pollen by accelerated solvent extraction-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ZHU Zi-tong，LEI Mei-kang，PENG Fang，LI Dong，CHEN Yu-jiao，ZHANG Ying-jun
（Comprehensive Technology Center of Quzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Quzhou 324002，China）

A method for analysis of chloramphenicol residue in bee pollen was developed.Sample was extracted using accelerated solvent extraction with ethyl acetate as extraction reagent and purified by Silica solid phase. Mass spectrometer was operated in the negative ion mode using select reaction monitoring.Isotope internal standard was used for quantitative analysis.The linearity of the calibration curve was from 0.5 to 10 ng/mL with correlation coefficient was 0.9936.Recovery rates for chloramphenicol in a negative bee pollen sample spiked at three levels were between 88.3%and 110.0%，with RSD range of 5.3%～8.9%.The limit of detection in the method was 0.1 μg/kg.This method proved to be of high efficiency，small amount of reagent，good selectivity and high sensitivity.

bee pollen；accelerated solvent extraction（ASE）；ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）；chloramphenicol（CAP）

TS201.1

A

1002-0306（2015）20-0068-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.005

2015－01－20

祝子銅（1985－），男，碩士，工程師，研究方向：食品及動物源性產(chǎn)品中獸藥殘留檢測，E-mail：zztzzt1124@163.com。