羊棲菜硫酸多糖的超聲輔助提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

董　樂，董笑瀛，王　芳，*，戴聰杰，林志杰，陳洪彬，劉燦陽

（1.泉州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，近海資源生物技術(shù)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建泉州362000；2.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，吉林長春130000）

羊棲菜硫酸多糖的超聲輔助提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

董樂1，董笑瀛2，王芳1，*，戴聰杰1，林志杰1，陳洪彬1，劉燦陽1

（1.泉州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，近海資源生物技術(shù)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建泉州362000；2.吉林大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，吉林長春130000）

為開發(fā)利用羊棲菜資源，對(duì)羊棲菜多糖（Sargassum fusiforme polysaccharides，SFPS）的提取工藝及其抗氧化活性進(jìn)行了研究。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對(duì)超聲波輔助提取SFPS粗品的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)為：超聲時(shí)間13min、提取溫度87℃和液料比46∶1mL·g-1，此時(shí)SFPS粗品提取率為8.23%± 0.01%。粗品中SFPS含量為31.20%±0.74%，硫酸根含量為10.93%±0.24%；SFPS的硫酸基含量41.88%±2.24%，SFPS為硫酸多糖。在一定范圍內(nèi)，SFPS粗品的抗氧化能力與多糖質(zhì)量濃度呈線性正相關(guān)，對(duì)·OH、DPPH·、ABTS+·和O2-·的半數(shù)清除濃度（IC50）值分別為0.7068、0.4814、0.2527、1.2350mg·mL-1。

羊棲菜硫酸多糖，二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，抗氧化活性

羊棲菜〔Sargassum fusiforme（Hary）Setch.〕屬馬尾藻科（Sargassaceae）、羊棲菜屬（H izikia）［1］，在我國廣泛分布于浙江、遼寧、山東、福建等省的沿海，其中以浙江溫州地區(qū)尤為豐富［2］。羊棲菜營養(yǎng)豐富，尤其含有豐富的多糖［3］。各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)表明，羊棲菜多糖（Sargassum fusiforme polysaccharides，SFPS）具有免疫調(diào)節(jié)活性［4］、抗突變［5］、抗腫瘤［6］、抗凝血［7］、抗病毒［8］、降血脂［9］、降血糖［10］等生理活性。目前提取多糖常見方法有熱水浸提、冷水浸提、酶法浸提、超聲波提取和微波提取法［11］。超聲波輔助提取通過其機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)，使介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)頻率和速度增大，介質(zhì)的穿透力增強(qiáng)，加速植物細(xì)胞壁的破裂，提高植物中活性成分的提取效率［12］。羊棲菜的藻體較硬，適合用機(jī)械的方法對(duì)其細(xì)胞壁進(jìn)行破碎來提取多糖。張勝幫等［13］用超聲波輔助法，采用L16（45）正交試驗(yàn)優(yōu)化了提取SFPS的工藝條件。

二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)能以較少的實(shí)驗(yàn)處理建立一個(gè)有效的多項(xiàng)式回歸方程，從而解決最優(yōu)化問題，并尋找實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與各因子間的定量規(guī)律。本實(shí)驗(yàn)采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對(duì)超聲波輔助提取SFPS粗品的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，建立回歸數(shù)學(xué)模型；并以對(duì)·OH、DPPH·、ABTS+·和O2-·的清除率為指標(biāo)，評(píng)價(jià)SFPS粗品的抗氧化活性，為SFPS功能活性的深入研究及其多糖產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

羊棲菜購于浙江溫州洞頭縣匯源海生物開發(fā)有限公司，自然干燥，用清水淋洗瀝干水分后55℃烘干，粉碎后過80目篩密封備用；95%乙醇、無水乙醇、氯仿、正丁醇、木瓜蛋白酶、濃硫酸、苯酚、氯化鈣、標(biāo)準(zhǔn)糖（葡聚糖、葡萄糖、巖藻糖/半乳糖3∶1）、三氯乙酸、氯化鋇、明膠、鹽酸、氯化鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、溴化鉀、過氧化氫國產(chǎn)分析純；DPPH、ABTS、透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量3500ku） 廈門泰京生物科技有限公司；水超純水。

W2-100S旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海申生科技有限公司；HH-4恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司；KQ-600超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TU-1950雙光束紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SHZ-III型循環(huán)水真空泵上海亞榮生化儀器廠；TDL-500B型低速大容量離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；FA2104N型電子分析天平上海菁海儀器有限公司；ZNCL-B智能恒溫磁力攪拌器鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；FW100型高速萬能粉碎機(jī)天津市泰斯特儀器有限公司；PHSJ-4A實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；LGJ-10D冷凍干燥機(jī)北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1羊棲菜干粉水分含量的測定根據(jù)GB 5009.3-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)—食品中水分的測定》第一法［14］測定羊棲菜干粉中的水分含量。

1.2.2SFPS粗品的提取準(zhǔn)確稱取一定重量粉末（WF）→加80%乙醇→80℃、2h脫色脫脂、烘干→稱重（WT）→計(jì)算產(chǎn)物的凈重率（WN）公式如下：

WT=WF×WN

準(zhǔn)確稱取折算為WF=5.00g粉末的上述產(chǎn)物WT，按單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的液料比加水，并于常溫下經(jīng)超聲波輔助提取后，按單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件繼續(xù)提取，離心后取上清液，沉淀按原液料比重新溶解，繼續(xù)提取2h，離心后取上清液。合并2次的上清液進(jìn)行減壓濃縮后，用木瓜蛋白酶結(jié)合Sevag法［15］脫蛋白，重復(fù)2次，收集合并上清液，向其中加入乙醇和CaCl2，使其終濃度分別為20%和0.05mol·L-1，然后置于4℃過夜。室溫下，4000r·min-1，離心10min后，收集的上清液進(jìn)行透析48h。于減壓濃縮的截留液中加入乙醇，使其終濃度為75%，靜置4h，無水乙醇洗滌1次后，置于55℃烘干，即獲得SFPS粗品（WS）。稱重后計(jì)算SFPS粗品提取率，并測定粗品中SFPS含量及硫酸根含量。

SFPS粗品提取率（%）=WS/［WF×（1－水分含量）］

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)準(zhǔn)確稱取羊棲菜粉末5.0000g分別按液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1mL·g-1，提取溫度50、60、70、80、90℃，超聲時(shí)間10、20、30、40、50min進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，其中固定液料比30∶1mL·g-1，溫度80℃，時(shí)間30min，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.4二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合實(shí)驗(yàn)以液料比、提取溫度和超聲時(shí)間為實(shí)驗(yàn)因素，以SFPS粗品提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的分析實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化SFPS粗品提取工藝條件。實(shí)驗(yàn)因素和水平見表1。

表1　二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)的因素水平編碼值表Table 1　Factors and levels of quadratic regression rotatable orthogonal design

1.2.5粗品中SFPS含量的測定采用苯酚－硫酸比色法［16］。

將SFPS粗品配制成200μg·mL-1溶液。取0.5mL定容液（用蒸餾水補(bǔ)足2mL），然后加入1.0mL 6%苯酚及5.0mL濃H2SO4，搖勻冷卻至室溫，放置20min后測溶液的吸光度（A）。每次測定取雙樣。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算SFPS含量。

SFPS含量（%）＝［C×V×D/WS］×100

式中，C—根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出SFPS粗品的濃度（μg·mL-1）；V—SFPS粗品溶液定容的體積（mL）；D稀釋的倍數(shù)；WS—SFPS粗品的質(zhì)量（g）。

1.2.6SFPS的硫酸根含量測定用氯化鋇－明膠比濁法［17］進(jìn)行。

1.2.7SFPS粗品的抗氧化活性測定對(duì)·OH、DPPH·、ABTS+·和O2-·清除率的測定均按文獻(xiàn)進(jìn)行［18-21］。

1.2.8半數(shù)清除（抑制）濃度（IC50）的計(jì)算以SFPS的濃度對(duì)自由基清除率作圖并進(jìn)行線性擬合，并利用計(jì)算機(jī)插值法模擬計(jì)算IC50值。IC50值定義為清除率為50%時(shí)所需SFPS的濃度。

1.2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。用Excel、SPSS 13.0軟件和Design-Expert 8.05軟件系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以p＜0.05判斷為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果與分析

2.1羊棲菜粉末的水分含量

羊棲菜干粉的含水量為6.54%±0.04%（n=3）。

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1液料比對(duì)SFPS粗品提取率的影響結(jié)果如圖1所示，由于SFPS是水溶性多糖，隨液料比增大，SFPS粗品提取率增加。當(dāng)液料比為30∶1mL·g-1時(shí)，SFPS粗品提取率達(dá)到最高，為4.21%，繼續(xù)提高液料比，SFPS粗品提取率反而下降。這可能是因?yàn)槠渌煞值娜芙饬侩S液料比增加而增加，從而改變了提取液的性質(zhì)，或者與SFPS發(fā)生了互作，造成SFPS粗品提取率降低。故選擇液料比為30∶1mL·g-1為宜。

圖1　液料比對(duì)SFPS粗品提取率的影響Fig.1　Effect of the ratio of liquid to solid on the yield of the crude SFPS

2.2.2提取溫度對(duì)SFPS粗品提取率的影響結(jié)果如圖2所示，SFPS粗品提取率隨著提取溫度升高而增加。由于溫度影響SFPS的活性，適宜的提取溫度一般小于100℃，因此本實(shí)驗(yàn)選擇提取溫度為90℃。

圖2　提取溫度對(duì)SFPS粗品提取率的影響Fig.2　Effect of extraction temperature on the yield of the crude SFPS

2.2.3超聲時(shí)間對(duì)SFPS粗品提取率的影響粗品提粗品提結(jié)果如圖3所示。SFPS的提取過程與超聲處理時(shí)間密切相關(guān)。SFPS粗品提取率隨超聲時(shí)間延長而增加，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到30min時(shí)，SFPS粗品提取率達(dá)到最高6.01%。繼續(xù)增加超聲時(shí)間，SFPS粗品提取率反而下降。這可能是由于時(shí)間過長，大分子多糖在超聲波的強(qiáng)剪切作用下發(fā)生斷裂而損失，使提取率下降［17］。故超聲提取的時(shí)間選擇在30min為宜。

圖3　超聲時(shí)間對(duì)SFPS粗品提取率的影響Fig.3　Effect of ultrasonic-irradiation time on the yield of the crude SFPS

2.3SFPS粗品提取的工藝優(yōu)化分析

2.3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與最佳工藝參數(shù)確定SFPS粗品提取的結(jié)果見表2。

表2　二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　Quadratic regression rotatable orthogonal experiment design and the results of these experiments

利用Design-Expert 8.05軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到以SFPS提取率為響應(yīng)值的回歸方程：

由方差分析（見表3）可知，總的回歸關(guān)系極顯著，失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），C.V.＝2.29%，精密度＝17.0231。R2Adj為0.9089，說明建立的模型能夠解釋90.89%響應(yīng)值的變化，能很好地描述SFPS提取過程中提取率隨提取條件的變化規(guī)律。因此，該模型可用于預(yù)測SFPS提取過程中的提取率情況。

表3　二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)的方差分析Table 3　Analysis of variance（ANOVA）for the fitted quadratic polynomial model

由方差分析見表3。結(jié)果表明，提取溫度和超聲時(shí)間的交互作用顯著，但液料比與提取溫度及超聲時(shí)間之間的交互作用不顯著，超聲時(shí)間的一次項(xiàng)也不顯著，因此應(yīng)當(dāng)從回歸方程中剔除。

表4　二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)的二次方差分析Table 4　Quadratic analysis of variance（ANOVA）for the fitted quadratic polynomial model

將X1X2、X1X3和X3從回歸方程中剔除，且將其平方和和自由度并入實(shí)驗(yàn)誤差，進(jìn)行第二次方差分析，結(jié)果見表4。二次方差分析表明，除X1的二次項(xiàng)未達(dá)顯著外，其余各項(xiàng)均達(dá)顯著水平，但X12在0.10水平上顯著，所以應(yīng)將其保留在回歸方程。失擬項(xiàng)不顯著（p＜0.05）。故回歸方程為：

在3個(gè)實(shí)驗(yàn)因素的編碼范圍內(nèi)，運(yùn)用Excel規(guī)劃求解得到SFPS提取的最佳工藝參數(shù)為：液料比為45.8∶1 mL·g-1，提取溫度為87.4℃，超聲時(shí)間13min。考慮到實(shí)際操作的便利，確定優(yōu)化提取工藝參數(shù)為：液料比為46∶1mL·g-1，提取溫度為87℃，超聲時(shí)間13min。在最佳工藝條件下SFPS粗品提取率預(yù)測值為8.54%。

2.3.2最佳工藝參數(shù)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)在最佳工藝條件下SFPS粗品提取率的驗(yàn)證值為8.23%±0.01%（n＝5），與理論預(yù)測值相比，相對(duì)誤差為3.6%（p＜0.05），證明了二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化SFPS的提取工藝參數(shù)的可行性。利用最優(yōu)工藝提取的羊棲菜粗多糖命名為SFPS粗品。

2.4SFPS粗品的SFPS含量

SFPS粗品的SFPS含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液在0～0.5360μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝0.0134x－0.0089，r＝0.9983，n＝6。

圖4　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4　The standard curve of dextrose concentration

圖5　硫酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5　The standard curve of sulfate-radical concentration

SFPS粗品中SFPS含量為31.20%±0.74%（n＝3）。

2.5SFPS粗品的硫酸根含量

SFPS粗品的硫酸根含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。硫酸根在0～67.6056μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝0.0078x－0.0241，r＝0.9950，n＝6。

SFPS粗品的硫酸基含量為10.93%±0.24%（n＝3），SFPS的硫酸基含量41.88%±2.24%（n＝3），因此，SFPS為硫酸多糖。

2.6SFPS粗品的抗氧化活性

由圖6可見，SFPS粗品對(duì)·OH、DPPH·、ABTS+·和 O2-·均有一定的清除能力，對(duì)4種自由基的清除率均隨濃度增大而增強(qiáng)，且SFPS粗品的濃度與抑制自由基的能力均呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。在測定濃度范圍內(nèi)，SFPS粗品對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到一定程度趨于平衡。利用計(jì)算機(jī)插值法模擬結(jié)果表明，SFPS粗品對(duì)·OH、DPPH·、ABTS+·和O2-·的IC50分別為0.7068、0.4814、0.2527、1.2350mg·mL-1，分別低于維生素C對(duì)·OH、DPPH·、ABTS+·和O2-·的IC50，即分別低于0.5911、0.0814、0.0946、0.3912mg·mL-1。

圖6　SFPS粗品的抗氧化活性Fig.6　The antioxidative activity in vitro of the crude SFPS

3　結(jié)論

利用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合優(yōu)化超聲波輔助提取SFPS粗品的回歸數(shù)學(xué)模型為：＝3.36182＋0.04214X1＋0.11558X2－0.07004X3＋0.00093X2X3－0.00046X12－0.00073X22－0.00272X32。此模型在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)能較準(zhǔn)確預(yù)測SFPS粗品提取率。通過此數(shù)學(xué)模型，確定最優(yōu)工藝參數(shù)：液料比46∶1mL·g-1、提取溫度87℃和超聲時(shí)間13min。在該工藝條件下SFPS粗品提取率預(yù)測值為8.54%，驗(yàn)證值為8.23%±0.01%，說明二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)優(yōu)化SFPS粗品的提取工藝參數(shù)是可行的。SFPS粗品中多糖含量為31.20%± 0.74%，硫酸根含量為10.93%±0.24%，SFPS的硫酸根含量為41.88%±2.24%，說明提取的SFPS為硫酸多糖。SFPS粗品對(duì)·OH、DPPH·、ABTS+·和O2-·的IC50分別為0.7068、0.4814、0.2527、1.2350mg·mL-1，抗氧化活性低于維生素C。

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Optimization of extraction and antioxidative activity in vitro of sulfated polysaccharides from Sargassum fusiforme（Hary）Setch.

DONG Le1，DONG Xiao-ying2，WANG Fang1，*，DAI Cong-jie1，LIN Zhi-jie1，CHEN Hong-bin1，LIU Can-yang1
（1.College of Chemistry and Life Science，Quanzhou Normal University，the Higher Educational Key Laboratory for Offshore Resources and Biotechnology of Fujian Province，Quanzhou Normal University，Quanzhou 362000，China；2.Clinical Medical College of Jilin University，Changchun 130000，China）

In order to exploit resources of Sargassum fusiforme（Hary）Setch.，the extraction and antioxidative activity of the polysaccharides from S.fusiforme（SFPS）was investigated respectively.Based on single experiments，with yield of crude SFPS as index，extraction temperature，ultrasonic-irradiation time and ratio of liquid to solid were selected as factors，the extraction technology of the crude SFPS was optimized by quadratic regression rotatable orthogonal combinition design method.The results showed that the optimal extraction conditions were 87℃，46∶1mL·g-1with 13min．The corresponding extraction yield of crude SFPS was 8.23%±0.01%.The sulfate-radical concentration of the crude SFPS was 10.93%±0.24%.The SFPS content of the crude SFPS was 31.20%±0.74%.The sulfate-radical concentration of the SFPS was 41.88%±2.24%.The SFPS were sulfated.There was a linear positive correlation between the antioxidant ability of SFPS and the concentration in certain extent.The half-scavenging concentration IC50values of the crude SFPS against·OH，DPPH·，ABTS+·and O2-·radicals were 0.7068，0.4814，0.2527，1.2350mg·mL-1respectively.

sulfated polysaccharides from Sargassum fusiforme（Hary）Setch.；quadratic regression rotatable orthogonal design；antioxidative activity

TS254

A

1002-0306（2015）12-0265-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.047

2014－9－25

董樂（1966－），男，碩士，副教授，研究方向：食品生物技術(shù)研究。

王芳（1969－），女，博士，教授，研究方向：生物技術(shù)研究。

福建省科技項(xiàng)目計(jì)劃海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（2015N0014）；福建省高校服務(wù)海西建設(shè)重點(diǎn)項(xiàng)目（A101）；福建省生物學(xué)省級(jí)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（zdxk）；泉州市“海納百川”高端人才聚集計(jì)劃高端海洋人才引進(jìn)資助項(xiàng)目；泉州市科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2011Z16，2013Z126）；國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目（201310399009，201410399029）。