響應(yīng)面法優(yōu)化黃鯽蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德反應(yīng)的條件

阮關(guān)強(qiáng)，沈燕，韋榮編，宋茹

(浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316022)

抗菌肽(Antibacterial peptide)通常又被稱為抗微生物肽或肽抗生素，是一種廣泛存在于自然界中的具有抗菌、抗病毒，甚至抗腫瘤活性的多肽類。自第1個(gè)抗菌肽從惜古比天蠶蛹中被分離以來，研究者陸續(xù)從動(dòng)植物中分離、純化到不同種類的抗菌肽［1-2］。采用酶解法制備的黃鯽蛋白抗菌液(HAHp)不僅具有較強(qiáng)的抑菌性，而且還具有抗腫瘤和抗氧化生物活性［3-7］。但是，HAHp有一定的魚腥味和苦味，對(duì)其今后廣泛應(yīng)用不利。前期研究發(fā)現(xiàn)美拉德修飾反應(yīng)不僅能夠提高黃鯽蛋白抗菌液的抑菌性，而且能夠有效改善該抗菌液的風(fēng)味性。筆者采用響應(yīng)面分析法對(duì)黃鯽蛋白抗菌液和葡萄糖的美拉德反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化處以期獲得對(duì)水產(chǎn)品常見致病菌副溶血弧菌具有強(qiáng)抑菌作用的黃鯽蛋白抗菌液美拉德反應(yīng)物，從而為黃鯽蛋白抗菌液在水產(chǎn)品中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黃鯽。黃鯽購于舟山水產(chǎn)市場(chǎng)。

1.1.2 指示菌。副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)，為浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.1.3 主要儀器及試劑。

1.1.3.1 主要儀器。恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上?；厶﹥x器制造有限公司);臺(tái)式PHS-3C精密pH計(jì)(上海虹益儀器儀表有限公司);立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);雙列四孔恒溫水浴鍋(上海慧泰儀器制造有限公司)。

1.1.3.2 主要試劑。營(yíng)養(yǎng)瓊脂，購于杭州天和微生物試劑有限公司;胃蛋白酶，購于中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司;其他試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 抑菌圈法。將副溶血性弧菌用肉湯液體培養(yǎng)基活化至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取100 μl副溶血弧菌菌懸液加入滅菌培養(yǎng)皿中，然后加入45～50℃左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15 ml，混勻，待營(yíng)養(yǎng)瓊脂凝固后，用滅菌打孔器(內(nèi)徑8 mm)打孔，然后每孔加入經(jīng)0.45 μm濾膜過濾除菌的樣品液25 μl。將培養(yǎng)皿放置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，觀察抑菌圈是否形成，并測(cè)量抑菌圈直徑。每個(gè)樣品平行測(cè)定2次，抑菌圈大小用平均值表示。

1.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化。在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇葡萄糖添加量、反應(yīng)初始pH、加熱時(shí)間和加熱溫度進(jìn)行優(yōu)化進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)(因素和水平設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)見表2)，采用最小二乘方法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，得到以下二次方方程:

其中y為響應(yīng)值;α0為常數(shù)項(xiàng);αj、αjj和 αij分別為一次項(xiàng)、平方和交互作用的回歸系數(shù);βi和βj為變量水平。采用Design Expert Software軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，優(yōu)化最佳的美拉德反應(yīng)條件，然后在優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，以判斷優(yōu)化反應(yīng)條件是否合理。

2 結(jié)果與分析

2.1 Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果 Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果見表2。將表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸方程擬合，得到響應(yīng)值與各因素間的二次回歸方程為:Y=23.02+0.52X1+1.04X2+0.53X3-0.21X4+0.18X1X2+0.40X1X3-0.20X1X4-0.48X2X3+0.42X2X4+0.05X3X4+0.37X12+0.82X22+1.07X32+1.05X42。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素及水平

表2 Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

方差分析結(jié)果表明，模型P值小于0.000 1，說明模型極顯著;失擬項(xiàng)的P值大于0.05，說明失擬項(xiàng)不顯著，且模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.902 2，表示該模型條件能夠很好地反映實(shí)際值。當(dāng)P值小于0.05時(shí)，因素對(duì)響應(yīng)值影響顯著。由此可見，葡萄糖添加量、反應(yīng)初始pH和加熱時(shí)間對(duì)黃鯽蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德產(chǎn)物的抑菌活性線性影響顯著。雖然各因素間的交互作用對(duì)美拉德產(chǎn)物的抑菌活性影響不顯著，但是通過因素間交互作用分析有助于揭示各因素間變化對(duì)美拉德產(chǎn)物抑菌活性的影響。因此，筆者進(jìn)一步分析了因素間的交互作用對(duì)美拉德產(chǎn)物的抑菌活性的影響趨勢(shì)。

從圖1可以看出，在一定葡萄糖添加量下，反應(yīng)初始pH的加大有利于黃鯽蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德反應(yīng)物的抑菌性增強(qiáng)，而當(dāng)反應(yīng)初始pH一定時(shí)，黃鯽蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德反應(yīng)物的抑菌圈直徑隨著葡萄糖添加量的加大而增加，說明葡萄糖添加量和反應(yīng)初始pH對(duì)產(chǎn)物抑菌活性的增加有線性影響。從圖2可以看出，當(dāng)葡萄糖添加量一定時(shí)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抑菌性先隨著加熱時(shí)間的增加而減少，此后隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸地增強(qiáng)。從圖3可以看出，無論在葡萄糖高添加量(如3%)還是低添加量(如0.8%)時(shí)，黃鯽蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德產(chǎn)物的抑菌活性均隨著加熱溫度的升高先減小后增加，說明加熱時(shí)間和加熱溫度對(duì)鯽蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德產(chǎn)物的抑菌性影響在特定加熱時(shí)間和加熱溫度范圍內(nèi)具有一定線性影響。圖4～6中各因素間交互作用也出現(xiàn)類似情況。黃鯽蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德產(chǎn)物的抑菌性在兩因素交互區(qū)間會(huì)出現(xiàn)最低值，說明黃鯽蛋白抗菌液與葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)過程中，在特定條件下不利于產(chǎn)物抑菌活性的增加，可能與黃鯽蛋白抗菌液中抑菌活性物質(zhì)發(fā)生改變或轉(zhuǎn)化有關(guān)，因此在反應(yīng)過程中要避開這些反應(yīng)條件，如葡萄糖添加量1.0%、反應(yīng)初始pH6.5、加熱時(shí)間50 min和加熱溫度100℃等。

2.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用Design Expert Software軟件對(duì)得到的擬合方程進(jìn)行分析，最終確定黃鯽蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德反應(yīng)的最佳條件為:葡萄糖添加量3%，反應(yīng)初始pH為9.0，加熱時(shí)間為100 min，加熱溫度為120℃。在此條件下得到的美拉德產(chǎn)物對(duì)指示菌副溶血弧菌的抑菌圈直徑理論值達(dá)到28.6 mm，在優(yōu)化反應(yīng)條件下進(jìn)行了3組平行試驗(yàn)，得到的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)副溶血弧菌的抑菌圈平均直徑為28.1 mm，與理論值非常接近，表明試驗(yàn)確定的優(yōu)化條件是合理的。

3 小結(jié)

響應(yīng)面分析試驗(yàn)有效優(yōu)化了黃鯽蛋白抗菌液-葡萄糖美拉德反應(yīng)條件，以美拉德產(chǎn)物對(duì)副溶血弧菌的抑菌性為響應(yīng)值，確定最佳美拉德反應(yīng)條件為:葡萄糖添加量3%，反應(yīng)初始pH為9.0，加熱時(shí)間為100 min，加熱溫度為120℃。

［1］BOMAN H G，HULTMARK D.STERINER H.Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity［J］.Nature，1981，292:246-248.

［2］BOLSCHER J G M，VAN DER KRAAN M I A，NAZMI K，et al.A one-enzyme strategy to release an antimicrobial peptide from the LFampindomain of bovine lactoferrin［J］.Peptides，2006，27:1-9.

［3］SONG R，WEI R，ZHANG Z，et al.Antioxidant and antiproliferative activities of heated sterilized pepsin hydrolysate derived from hgalf-fin anchovy(Setipinna taty)［J］.Marine Drugs，2011，9(6):1142-1156.

［4］SONG R，WEI R B，LUO H Y，et al.Isolation and characterization of antibacterial peptide fraction from the pepsin hydrolysate of half-fin anchovy(Setipinna Taty)［J］.Molecules，2012，17(3):2980-2991.

［5］SONG R，WEI R B，ZHANG B，et al.Optimization of the antibacterial activity of half-fin anchovy(Setipinna taty)hydrolysates［J］.Food and Bioprocess Technology，2012，5:1979-1989.

［6］SONG R，WEI R B，LUO H Y，et al.Isolation and identification of an antiproliferative peptide derived from heated products of peptic hydrolysates of half-fin anchovy(Setipinna taty)［J］.Journal of Functional Foods，2014，10:104-111.

［7］SONG R，WEI R B，RUAN G Q，et aI.solation and identification of antioxidative peptides from peptic hydrolysates of half-fin anchovy(Setipinna taty)［J］.LWT-Food Science and Technology，2015，60(1):221-229.