外源一氧化氮對蘋果采后黑斑病的控制

王　迪，李永才，畢　陽，余曉燕，唐　瑛，潘靜宇，王　婷，張溪桐（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070）

外源一氧化氮對蘋果采后黑斑病的控制

王迪，李永才*，畢陽，余曉燕，唐瑛，潘靜宇，王婷，張溪桐
（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070）

在離體條件下研究了NO供體硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）對蘋果黑斑病菌互隔交鏈孢（Alternaria alternata）生長、菌落形態(tài)及其超微結(jié)構(gòu)的影響，并在體內(nèi)條件下研究了其對蘋果黑斑病的治愈作用。結(jié)果表明SNP處理能顯著的抑制A.alternata的孢子萌發(fā)和菌絲生長，存在濃度依賴效應(yīng)，當(dāng)濃度為1 g/100 mL SNP，與對照相比，其對菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制率分別達(dá)到70%和75.9%；掃描電鏡和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)SNP處理的A.alternata菌絲表面粗糙，粗細(xì)不均勻，部分出現(xiàn)塌陷；孢子細(xì)胞受到不同程度的破壞，細(xì)胞膜發(fā)生破裂。同時發(fā)現(xiàn)外源SNP處理對損傷接種的蘋果黑斑病具有治愈作用，其中0.5 g/100 mL SNP處理效果最佳?？梢娡庠碞O作為代替化學(xué)合成藥物的防腐劑在采后病害控制中具有潛在的應(yīng)用前景。

蘋果，黑斑病，一氧化氮，采后病害，互隔交鏈孢

蘋果屬薔薇科水果，富含豐富營養(yǎng)，深受消費者喜愛。蘋果在常溫條件下貯藏期較長，但在貯藏后期易受到真菌侵染而造成腐敗變質(zhì)，其主要病害為由擴展青霉（Penicillium expensum）和互隔交鏈孢（Alternaria alternata）引起青霉病和黑斑病，尤其A.alternata在采前和采后商品化處理中均可侵染果實，貯藏后期在果實表面產(chǎn)生褐色至黑褐色的病斑，并使果肉變腐軟，對貯藏、運輸和銷售造成影響，引起巨大經(jīng)濟損失［1］。目前多用人工合成殺菌劑對病害進(jìn)行控制，盡管合成殺菌劑能有效的控制采后病害，但其會對人體健康與環(huán)境產(chǎn)生危害，并使病原菌產(chǎn)生耐藥性。因此，研究安全、高效、無公害的防腐保鮮技術(shù)已成為必然趨勢［2］。

NO作為一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號分子，在植物體內(nèi)參與許多生理過程，如植物的生長發(fā)育、成熟衰老、脅迫響應(yīng)等［3-5］。一般低含量NO促進(jìn)細(xì)胞生長繁殖，但是高水平的NO可能會抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞衰老和死亡［6］。近年來研究表明NO對病原菌有潛在的抑菌作用，Wills［7］發(fā)現(xiàn)NO通過抑制霉菌生長而延長草莓的采后壽命。Lazar［8］研究報道短期暴露在低含量的NO氣體中能抑制黑曲霉（Aspergillus niger）、桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）、擴展青霉（Penicillium italicium）的生長。同樣，Thomas［9］研究發(fā)現(xiàn)在NO供體化合物存在下馬鈴薯炭疽病菌（Colletrotichumcoccodes）分生孢子的萌發(fā)延緩，添加NO抑制劑后孢子萌發(fā)恢復(fù)并加快。此外NO處理也能誘導(dǎo)果實的抗病性，Manjunatha［10］報道NO供體硝普鈉（SNP）可提高珍珠栗（Pennisetum glaucum）對由栗白發(fā)菌（Sclerospora graminicola）引起的霜霉病的抗性。Lai［11］證實1 mmol/L SNP可增強番茄對由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的霜霉病的抗性。然而，關(guān)于NO對果蔬采后A.alternata的抑制及作用機制研究卻鮮有報道。因此本文通過體內(nèi)和離體實驗，系統(tǒng)的研究了NO供體硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）對互隔交鏈孢的抑菌作用及蘋果黑斑病的控制效果，以期為NO在蘋果采后病害控制中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

供試“長富二號”蘋果于2014年10月購于甘肅省景泰縣條山農(nóng)場，用紙箱包裝后運抵實驗室，于冷庫中2～4℃貯藏待用；葡萄糖、瓊脂粉分析純，均購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；NO供體硝普鈉（SNP）分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CX21FS1C型生物顯微鏡奧林巴斯（廣州）工業(yè)有限公司；S3400N型掃描電子顯微鏡日本日立高新技術(shù)有限公司；H-7650型透射電子顯微鏡日本日立高新技術(shù)有限公司；打孔器8 mm；接種針2 mm。

1.2實驗方法

1.2.1互隔交鏈孢的提取及純化

1.2.1.1互隔交鏈孢（Alternaria alternata）分離參照李永才［12］的方法，由感病蘋果果實病健交界處分離純化得到，接種在PDA培養(yǎng)基于4℃下保藏。為確保其活性，用前反接于果實，再將其分離純化備用。

1.2.1.2互隔交鏈孢孢子懸浮液的制備參照Bi等［13］的方法。取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的互隔交鏈孢，用無菌蒸餾水配制孢子懸浮液，用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整孢子懸浮液最終濃度為1×106個/mL。

1.2.2NO供體SNP對互隔交鏈孢菌絲生長的影響

參照Yao等［14］的方法。將PDA培養(yǎng)基滅菌后，晾至60℃左右，加入濃度分別為0.25、0.5、1 g/100 mL的SNP，不加SNP的培養(yǎng)基作為對照。將0.8 cm的互隔交鏈孢菌餅接種在凝固后的培養(yǎng)基中心，于28℃黑暗條件培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理3次重復(fù)。

1.2.3NO供體SNP對互隔交鏈孢孢子萌發(fā)的影響

打孔器采用酒精燈火焰法滅菌后打取水瓊脂餅，置于無菌載玻片上，向水瓊脂餅上滴加10 μL濃度分別為0.25、0.5、1 g/100 mL的SNP溶液，再在其上加10 μL振蕩均勻的孢子懸浮液，于25℃在光學(xué)顯微鏡下連續(xù)數(shù)小時鏡檢孢子萌發(fā)率，直至對照組完全萌發(fā)，每個處理3次重復(fù)。

1.2.4NO供體SNP對互隔交鏈孢菌落形態(tài)及菌絲超微結(jié)構(gòu)的影響參照高向陽等［15］的方法。將含有1 g/ 100 mL SNP培養(yǎng)基上生長7 d的菌絲塊（0.5 cm×0.5 cm）及對照菌絲塊用2%戊二醛（v/v）固定，于4℃放置2 h；經(jīng)乙醇系列梯度（50%、70%、95%、100%）處理10 min，醋酸異戊酯置換乙醇20 min。脫水樣品進(jìn)行臨界點干燥，真空噴金。在掃描電鏡下觀察制好的樣品并拍照。

將1 g/100 mL SNP培養(yǎng)基上生長7 d的菌絲塊（0.5 cm×0.5 cm）及對照菌絲塊用2%戊二醛（v/v）固定，于4℃放置2 h；經(jīng)乙醇系列梯度（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）處理10 min，后進(jìn)行Epon818樹脂包埋，超薄切片混和染色。在透射電鏡下觀察制好的樣品并拍照。

1.2.5NO供體SNP處理對損傷接種蘋果黑斑病的抑制參照畢陽［16］的方法并修改。取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的互隔交鏈孢，用無菌蒸餾水配制濃度為1× 106個/mL孢子懸浮液。選取無病蟲害，大小一致的蘋果果實，自來水清洗后于2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min，晾干后用75%乙醇擦拭蘋果果實表面消毒。接種針經(jīng)酒精燈火焰滅菌并晾涼，在每個果實赤道部位刺2 mm大小均勻的孔3個，并在孔內(nèi)接種20 μL孢子懸浮液。將接種后的果實于0.25、0.5、1 g/100 mL SNP溶液和無菌水（對照組）中浸泡2 min，晾干后單果PE袋包裝并置于室內(nèi)無菌處，每7 d觀察1次，十字交叉法測量病斑直徑并記錄發(fā)病情況，每個處理重復(fù)3次。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)為3個或3個以上樣本平均值，利用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，用Duncan’s檢驗進(jìn)行差異顯著性分析，p＜0.05時為差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1NO供體SNP對互隔交鏈孢菌絲生長的影響

由圖l可知，不同濃度的SNP對互隔交鏈孢菌落均有顯著地抑制作用（p＜0.05），且隨著處理濃度的增加，其抑菌作用越明顯，其中1 g/100 mL的SNP抑菌效果最好，培養(yǎng)7 d后其病斑直徑僅為31.6 cm，為對照的70%。

圖1　SNP對互隔交鏈孢菌絲生長的影響Fig.1　Effect of SNP on mycelial growth of A.alternata

2.2NO供體SNP對互隔交鏈孢孢子萌發(fā)的影響

結(jié)果見圖2?；ジ艚绘滄哝咦用劝l(fā)率隨培養(yǎng)時間的延長逐漸增加，SNP處理后互隔交鏈孢的孢子萌發(fā)率在各時間段內(nèi)均低于對照，但低濃度SNP（＜0.5 g/100 mL）處理互隔交鏈孢的孢子萌發(fā)抑制效果不明顯，0.25 g/ 100 mL與0.5 g/100 mL SNP處理后孢子萌發(fā)率較對照組降低，但二者無顯著差異（p＞0.05）。6 h時，對照組孢子萌發(fā)率已經(jīng)高達(dá)87.7%，而1 g/100 mL SNP處理組其孢子萌發(fā)率僅為66.5%，較對照組顯著降低（p＜0.05）。

圖2　SNP對互隔交鏈孢孢子萌發(fā)的影響Fig.2　Effect of NO on spore germination of A.alternate

2.3NO供體SNP處理對互隔交鏈孢菌絲形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)的影響

在掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)對照組的菌絲表面光滑，粗細(xì)均勻，沒有出現(xiàn)不規(guī)則分支、塌陷等現(xiàn)象（圖3a），1 g/100 mL的SNP處理過的互隔交鏈孢菌絲表面粗糙，出現(xiàn)不規(guī)則分支，粗細(xì)不均勻，折疊扭曲盤繞，部分出現(xiàn)塌陷變形現(xiàn)象（圖3b）。

通過透射電鏡進(jìn)一步觀察，對照組孢子橫切面及縱切面可以看到細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞器完好且整齊排列，細(xì)胞沒有發(fā)生溶解、破損等現(xiàn)象（圖3c，圖3e），NO處理過的孢子細(xì)胞受到嚴(yán)重破壞，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空腔，細(xì)胞結(jié)構(gòu)凌亂且胞內(nèi)物質(zhì)減少，細(xì)胞發(fā)生破裂、變形、溶解等現(xiàn)象（圖3d，圖3f）。

圖4　NO處理對損傷接種蘋果發(fā)病率的影響Fig.4　The effect of NO on incidence of inoculated apple fruit

2.4NO供體SNP處理對損傷接種蘋果發(fā)病率的影響

用不同濃度NO供體SNP處理損傷接種互隔交鏈孢的蘋果結(jié)果由圖4可見，其控制效果隨濃度增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，其中0.5 g/100 mL的抑菌效果最好，病斑直徑為對照的57%，而1 g/100 mL的SNP其控制效果反而降低，實際處理中蘋果果實表面大面積產(chǎn)生了棕褐色斑點，這可能是由于高濃度SNP產(chǎn)生的藥害，降低了果實組織的防御能力，使病原菌易侵染［17］。

3　討論與結(jié)論

本研究中發(fā)現(xiàn)不同濃度NO對互隔交鏈孢的抑制效果存在濃度依賴效應(yīng)，1 g/100 mL在體外能顯著抑制其的菌絲生長及孢子萌發(fā)（p＜0.05）。這與Wills等［8］關(guān)于NO對黑曲霉（Aspergillus niger）、桃褐腐病菌（Moniliniafructicola）、擴展青霉（Penicillium italicium）、馬鈴薯炭疽病菌（Colletrotichum coccodes）作用的報道結(jié)果一致。近幾年還表明NO在真菌中作為信號分子發(fā)揮作用［18］。其參與了灰葡萄孢（Botrytis cinerea）與其寄主相互作用［11］，并作用于馬鈴薯炭疽病菌（Colletotrichum coccodes）分生孢子形成［9］，并可介導(dǎo)茄病鐮刀菌（Fusarium eumartii）孢子的細(xì)胞凋亡［19］。電鏡觀察表明NO對互隔交鏈孢形態(tài)結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生明顯的破壞作用，由此推測可能是NO進(jìn)入菌體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)而與細(xì)胞器發(fā)揮作用，Carreras［20］的研究也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)論，NO脅迫下的孢子一定時間內(nèi)其ATP含量顯著降低，且細(xì)胞電子傳遞鏈上的部分酶（如線粒體NADH脫氫酶，細(xì)胞色素氧化酶等）活性受到抑制，表明NO通過作用于病原物線粒體，抑制線粒體的呼吸造成能量代謝紊亂，從而導(dǎo)致病原物細(xì)胞凋亡。

0.5 g/100 mL SNP能明顯降低接種前后蘋果果實的病斑直徑，這表明NO供體對病害具有治愈作用。賴童飛［21］研究表明外源NO對擴展青霉的發(fā)育有顯著抑制效果，且濃度越高抑制效果越好。王倩［22］在灰葡萄孢中也得到了相似的結(jié)果。

本實驗研究結(jié)果表明，外源NO可通過直接抑制病原物生長及誘導(dǎo)果實防御性來有效控制蘋果的黑斑病，但由于其作用機理較為復(fù)雜，還需進(jìn)一步從分子水平上闡明外源NO作為信號分子對病原菌的抑制和寄主抗性誘導(dǎo)的調(diào)控機制。

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Control over exogenous NO on black spot of apple

WANG Di，LI Yong-cai*，BI Yang，YU Xiao-yan，TANG Ying，PAN Jing-yu，WANG Ting，ZHANG Xi-tong
（College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

Effect of nitric oxide（NO）donor sodium nitroprusside（SNP）on the growth，colonial morphology and microstructure of Alternaria alternata were studied in vitro，and its curative and preventative effect for apple black spot control were also evaluated.The results showed that SNP could significantly inhibit spore germination and mycelia growth of A.alternata and the effect was in dose dependent manner.The inhibitory ratios of spore germination and mycelia growth reached to 70%，and 75.9%respectively when treated with 1 g/100 mL SNP. Rough surfaces，uniform thickness，distorted cell and ruptured cell membrane were observed after treatment with SNP by scanning electron microscopy（SEM）and transmission electron microscopy（TEM）.Meanwhile，SNP treatment not only could cure the black rot on inoculated apple，but also induce the increase of fruit resistance to prevent disease developmemt，the optimum inhibitory concentration was 0.5 g/100 mL SNP.Results suggested that NO，as a safe preservative alternative to synthesis fungicide，might have potential application for postharvest disease control.

apples；black spot；nitric oxide（NO）；postharvest diseases；Alternaria alternata

TS255.2

A

1002-0306（2015）18-0358-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.064

2015－01－30

王迪（1989-），女，碩士研究生，研究方向：采后果蔬貯藏與保鮮，E-mail：wd237@sina.com。

李永才（1972-），男，博士，副教授，研究方向：采后果蔬貯藏病害控制，E-mail：liyongcai@gsau.edu.cn。

甘肅省高校研究生導(dǎo)師科研項目（1102-01）；甘肅省農(nóng)牧廳生物技術(shù)專項（GNSW-2011-11）。