煎餅發(fā)酵面糊中酵母菌的鑒定及保護(hù)劑配方的優(yōu)化

唐明禮，王　勃，劉　賀，何余堂，惠麗娟，馬　濤（渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，渤海大學(xué)糧油科學(xué)與技術(shù)研究所，遼寧錦州121013）

煎餅發(fā)酵面糊中酵母菌的鑒定及保護(hù)劑配方的優(yōu)化

唐明禮，王勃，劉賀，何余堂，惠麗娟，馬濤*
（渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，渤海大學(xué)糧油科學(xué)與技術(shù)研究所，遼寧錦州121013）

從煎餅發(fā)酵面糊中分離篩選出具有當(dāng)?shù)靥厣白匀话l(fā)酵煎餅風(fēng)味的酵母菌菌株。其中Y8生長(zhǎng)迅速且耐酸性強(qiáng)，采用VITEC-2 compact微生物鑒定儀對(duì)其進(jìn)行鑒定，并對(duì)其制備凍干菌發(fā)酵劑的保護(hù)劑進(jìn)行篩選和優(yōu)化。結(jié)果表明，煎餅發(fā)酵面糊中酵母菌為釀酒酵母菌，保護(hù)劑優(yōu)化配方：甘油4.0%、海藻糖1.3%、脫脂乳12.7%，在此優(yōu)化條件下，釀酒酵母菌的存活率可達(dá)82%，為傳統(tǒng)食品的連續(xù)化、工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

酵母菌，鑒定，保護(hù)劑，配方優(yōu)化

煎餅是我國(guó)傳統(tǒng)食品之一，深受國(guó)人喜愛(ài)。制作過(guò)程中沿用自然發(fā)酵面糊進(jìn)行生產(chǎn)，造成產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，難于實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化工業(yè)生產(chǎn)。

直投式發(fā)酵劑是對(duì)優(yōu)勢(shì)菌種進(jìn)行高密度培養(yǎng)，然后進(jìn)行真空冷凍干燥制成的高活性菌體產(chǎn)品，具有菌種保質(zhì)期長(zhǎng)、活性高、接種量少、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于面包、泡菜、發(fā)酵奶制品等食品工業(yè)中［1-3］。凍干過(guò)程可導(dǎo)致冰晶的形成、細(xì)胞膜通透性的改變、敏感蛋白的變性與失活等，從而導(dǎo)致微生物的死亡。通過(guò)添加多糖、羥基化合物、蛋白質(zhì)、聚合物等保護(hù)劑能夠降低結(jié)晶率、提高最大凍結(jié)濃縮液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，提高凍干菌的存活率［4-7］。國(guó)內(nèi)采用VITEC-2 compact微生物鑒定儀對(duì)菌種的鑒定及酵母菌冷凍干燥保護(hù)劑方面的研究鮮有報(bào)道，王華等［8］對(duì)熱帶假絲酵母進(jìn)行了保護(hù)劑配方的優(yōu)化研究，在最佳條件下，熱帶假絲酵母的存活率可達(dá)82.7%。

酵母菌凍干發(fā)酵劑具有含菌量高、活力強(qiáng)、體積小等優(yōu)點(diǎn)，可減少煎餅等傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品的食用安全性，有利于煎餅的工業(yè)化及連續(xù)化生產(chǎn)。目前，關(guān)于酵母菌的凍干保護(hù)劑發(fā)面的研究以及VITEC-2 compact微生物鑒定儀對(duì)菌種鑒定方面的研究比較少。

本文對(duì)煎餅發(fā)酵面糊中的酵母菌進(jìn)行鑒定，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化保護(hù)劑配方，以期為煎餅產(chǎn)品工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

酵母菌由實(shí)驗(yàn)室分離保藏；海藻糖、甘氨酸、聚乙二醇分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甘油食品級(jí)，連云港友進(jìn)食品添加劑技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；脫脂乳食品級(jí)，黑龍江完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司；乳糖分析純，天津市化學(xué)試劑工廠；葡萄糖分析純，天津市天利化學(xué)試劑有限公司；蔗糖食品級(jí)，龍舟南華糖業(yè)有限公司；硫酸錳分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；YEPD培養(yǎng)基北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；YST鑒定卡片法國(guó)梅里埃。

VITEC-2 compact微生物鑒定儀法國(guó)梅里埃；FreeZone臺(tái)式真空冷凍干燥機(jī)上海珂淮儀器有限公司；Biofuge Stratos高速冷凍離心機(jī)美國(guó)THERMO；GMSX-280型手提式壓力蒸汽滅菌器北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；SW-CJ-2FD型無(wú)菌操作臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市鑫鑫實(shí)驗(yàn)儀器廠；AR224CN型電子天平奧豪斯儀器（上海）有限公司制造；MDF-382E（CN）型超低溫冰箱日本三洋。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌株的生長(zhǎng)曲線將分離的菌株以2%（v/v）的接種量接種于250 mL的液體培養(yǎng)基中，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 h取出培養(yǎng)液，以未接種的培養(yǎng)基為空白對(duì)照。分別在波長(zhǎng)660 nm處測(cè)量吸光值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌液吸光度為縱坐標(biāo)，觀察菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.2.2菌株的耐pH實(shí)驗(yàn)將酵母菌接入YEPD液體培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基的pH分別調(diào)為2.5、3、3.5、4和4.5。按2%接種量接入活化好的酵母菌，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌液吸光度為縱坐標(biāo)，觀察酵母菌的生長(zhǎng)曲線?？疾旄骶陮?duì)pH的耐受性。

1.2.3VITEC-2 compact微生物鑒定儀對(duì)酵母菌的鑒定酵母菌菌種在4℃的條件進(jìn)行保藏，測(cè)試前將YEPD固體培養(yǎng)基上的單菌落懸浮于0.45%的滅菌生理鹽水中，并用濁度儀確定濁度為1.8～2.2，將YST卡片插入此菌懸浮液中進(jìn)行鑒定。YST卡片首先進(jìn)入填充倉(cāng)進(jìn)行填充，使菌懸液進(jìn)入卡片試劑中，填充完成將卡片放入切片分裝倉(cāng)，儀器進(jìn)行自動(dòng)切片、封裝，將卡打入孵育倉(cāng)，此后儀器每15 min自動(dòng)讀卡檢測(cè)一次，檢測(cè)完畢后將自動(dòng)打印報(bào)告單。

1.2.4工藝流程斜面菌株→活化→擴(kuò)大培養(yǎng)→離心濃縮→制備菌懸液→活菌計(jì)數(shù)→加入保護(hù)劑→預(yù)凍→真空冷凍干燥→產(chǎn)品→活菌計(jì)數(shù)。

1.2.5單一保護(hù)劑的制備與選擇將保護(hù)劑按照表1中相應(yīng)的濃度進(jìn)行配制，在121℃、15 min的條件下滅菌備用。以生理鹽水為對(duì)照，測(cè)定凍干前后活菌數(shù)，計(jì)算存活率。

表1　保護(hù)劑的種類與用量Table 1　The type and amount of protective agent

1.2.6菌體的培養(yǎng)與收集將斜面上的菌株接種至含有YEPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃靜置培養(yǎng)12 h，將10 mL菌液加入到100 mL YEPD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)培，使培養(yǎng)液的含菌量達(dá)到108CFU/mL。將培養(yǎng)液以8000 r/min、4℃的條件下離心10 min，棄去上清液，以一定量的無(wú)菌生理鹽水清洗菌泥。

1.2.7真空冷凍干燥在無(wú)菌的條件下，菌液與保護(hù)劑的比例為1∶1條件混合，保護(hù)劑與酵母菌懸液平衡時(shí)間為30 min，-70℃預(yù)凍2 h，之后進(jìn)行真空冷凍干燥。冷凍干燥的參數(shù)：220 Pa、-50℃。

1.2.8凍干前后活菌數(shù)的計(jì)算將酵母菌離心后的懸浮液和凍干后的菌粉梯度稀釋，平板計(jì)數(shù)法記錄菌落數(shù)［9］。

1.2.9存活率的計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果以存活率表示，分析真空冷凍干燥對(duì)酵母菌的影響［10-11］。

式中，N：真空冷凍干燥后酵母菌的數(shù)量；N0：真空冷凍干燥前酵母菌的數(shù)量。

1.2.10響應(yīng)面分析在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)之上，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，以甘油、海藻糖、脫脂乳為考察變量，分別以X1、X2、X3表示，以存活率Y為響應(yīng)值，因子編碼及各自變量水平見(jiàn)表2。

表2　實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table 2　Code and level of factors chosen for the trials

1.3數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，p＜0.05認(rèn)為具有顯著差異。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株的生長(zhǎng)曲線

圖1　酵母菌的生長(zhǎng)曲線Fig.1　Growth curve of yeast

從煎餅發(fā)酵面糊中分離篩選11種酵母菌，分別對(duì)其編號(hào)為Y1～Y11。圖1為煎餅發(fā)酵面糊中典型酵母菌的生長(zhǎng)曲線，0～2 h內(nèi)5株酵母菌生長(zhǎng)較緩慢，菌體需要一定時(shí)間來(lái)自身的生理機(jī)能以適應(yīng)新環(huán)境，此階段為緩慢期；在2～14 h內(nèi)所有菌株適應(yīng)新環(huán)境后，細(xì)胞開(kāi)始旺盛生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速率達(dá)到最大值，菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD值持續(xù)上升，Y8的OD值較大，生長(zhǎng)迅速，最大可達(dá)2.12。

表3　VITEC-2 compact微生物鑒定儀對(duì)酵母菌的鑒定Table 3　VITEC-2 compact microbial identification system for identification of yeasts

2.2菌株的耐pH實(shí)驗(yàn)

對(duì)于煎餅發(fā)酵劑的選擇不能僅立足于功能特性，要具備適應(yīng)不同環(huán)境的能力。由于煎餅面糊是由酵母菌和乳酸菌共同發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌會(huì)使面糊的pH降低，所以對(duì)酵母菌進(jìn)行耐酸性篩選。圖2為pH對(duì)酵母菌的影響，隨pH增加，酵母菌生長(zhǎng)迅速，較低pH時(shí)，所有酵母菌生長(zhǎng)受到抑制，Y8菌株表現(xiàn)出良好的耐受性，故選取Y8作為直投式發(fā)酵劑菌株，用于煎餅的連續(xù)化生產(chǎn)。

圖2　pH對(duì)酵母菌的影響Fig.2　The effect of pH on yeast

2.3VITEC-2 compact微生物鑒定儀對(duì)煎餅發(fā)酵面糊中酵母菌的鑒定

表3為VITEC-2 compact微生物鑒定儀對(duì)酵母菌的鑒定結(jié)果。使用濁度儀將酵母菌的菌懸液濁度調(diào)為1.96，經(jīng)過(guò)18.25 h的鑒定，鑒定結(jié)果為釀酒酵母菌，可能性百分比為97%。

2.4單一保護(hù)劑對(duì)釀酒酵母菌凍干存活率的影響

若將酵母菌直接進(jìn)行冷凍干燥，將近93%的菌體直接死亡，因此應(yīng)選擇能提高菌種冷凍干燥過(guò)程存活率的冷凍保護(hù)劑。單一保護(hù)劑對(duì)釀酒酵母菌的保護(hù)作用見(jiàn)表4，在沒(méi)有添加保護(hù)劑時(shí)，釀酒酵母菌的存活率只有7.2%，添加保護(hù)劑后，釀酒酵母菌的存活率均有不同程度的增加，說(shuō)明保護(hù)劑對(duì)釀酒酵母菌具有一定的保護(hù)作用。

甘油對(duì)酵母菌的保護(hù)作用最佳，最大存活率的可達(dá)64%，甘油通過(guò)與結(jié)合水發(fā)生水化作用，增加溶液的粘度，可防止冰晶的形成，故提高了釀酒酵母在冷凍干燥過(guò)程中的存活率［12］。其次是海藻糖和脫脂乳，其作用效果與王華和曾小群等研究者相似［8，10］。糖類對(duì)的保護(hù)作用是凍干過(guò)程可取代水分子與磷脂雙分子層的極性基團(tuán)形成氫鍵，防止了磷脂雙分子層的相變，保護(hù)了細(xì)胞膜的完整性［13］。Lodato等［14］也認(rèn)為酵母菌處于高溫、脫水、冷凍等環(huán)境脅迫條件下，海藻糖對(duì)酵母菌具有較好的保護(hù)作用。脫脂乳的保護(hù)作用是脫脂乳中含有乳糖，同時(shí)乳中的膠體物質(zhì)也提高了玻璃化轉(zhuǎn)變溫度［15］。甘氨酸對(duì)酵母菌的保護(hù)作用不明顯?；蛭稽c(diǎn)篩選和基因分析顯示當(dāng)釀酒酵母菌受到高滲環(huán)境脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)增強(qiáng)甘油和海藻糖的的代謝，這兩種代謝也被稱為滲透保護(hù)劑代謝［16-17］。盡管各保護(hù)劑對(duì)酵母菌具有一定的保護(hù)作用，但保護(hù)作用有限，故選用甘油、海藻糖和脫脂乳三種保護(hù)劑進(jìn)行復(fù)配實(shí)驗(yàn)，以期得到較好的存活率。

表4　單一保護(hù)劑對(duì)釀酒酵母菌凍干存活率的影響Table 4　The effect of a single protective agent on survival rate of Saccharomyces cerevisiae

2.5模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

表5列出釀酒酵母菌凍干存活率的實(shí)測(cè)值及預(yù)測(cè)值。

利用Design Expert軟件對(duì)表5中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到甘油（X1）、海藻糖（X2）、脫脂乳（X3）的二次回歸方程為：Y=82.40＋1.95X1＋5.26X2－0.24X3－0.65X1X2－0.75X1X3＋0.58X2X3－5.26X12－4.79X22－4.79X32。并對(duì)該模型進(jìn)行方差分析及模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，見(jiàn)表6、表7。

表5　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 5　Experimental designs and results

表6　真空冷凍干燥對(duì)釀酒酵母菌存活率回歸模型的方差分析結(jié)果Table 6　Analysis of variance for regression equation of Saccharomyces cerevisiae survival rate of vacuum freeze-drying

表7　回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 7　Test of significance for regression coefficient of Saccharomyces cerevisiae survival rate of vacuum freeze-drying

由表6方程回歸模型方差分析（ANOVA）可得，F(xiàn)=23.83＞F0.01（9，4）=14.66，p為0.0002，表明模型方程極顯著。失擬項(xiàng)p=0.0562＞0.05，不顯著。模型的校正決定系數(shù)（R2adj）為0.9278，說(shuō)明該模型能解釋92.78%響應(yīng)值的變化，該方程與實(shí)際擬合的較好，能有效反映釀酒酵母菌存活率與甘油、海藻糖、脫脂乳之間的關(guān)系，因此所得的方程能預(yù)測(cè)響應(yīng)值隨各參數(shù)的變化規(guī)律。

從表7的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)中X1（p＜0.05）的偏回歸系數(shù)顯著，X2（p＜0.01）的偏回歸系數(shù)極顯著，說(shuō)明甘油和海藻糖對(duì)釀酒酵母菌的存活率影響顯著，X3（p＞0.05）的偏回歸系數(shù)不顯著，說(shuō)明脫脂乳對(duì)釀酒酵母菌的存活率影響不顯著。交互項(xiàng)的交互作用對(duì)存活率影響不顯著。綜合上述分析得知，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度為X2（海藻糖）＞X1（甘油）＞X3（脫脂乳）。

2.6保護(hù)劑對(duì)釀酒酵母菌存活率的響應(yīng)面分析

圖3　甘油、海藻糖及其相互作用對(duì)釀酒酵母菌存活率的響應(yīng)面和等高線圖Fig.3　Response surface plot and its contour plot showing the effects of glycerin，trehalose and their mutual interactions on Saccharomyces cerevisiae survival rate

圖4　甘油、脫脂乳及其相互作用對(duì)釀酒酵母菌存活率的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4　Response surface plot and its contour plot showing the effects of glycerin，skim milk and their mutual interactions on Saccharomyces cerevisiae survival rate

圖3～圖5為Design-Expert軟件對(duì)回歸方程構(gòu)建響應(yīng)面分析圖。圖3為脫脂乳12.5%，甘油和海藻糖對(duì)釀酒酵母菌存活率的影響，根據(jù)等高線可看出固定海藻糖含量，在甘油3%～4.1%范圍內(nèi)，釀酒酵母菌的存活率與甘油的用量成正比，在4.1%～5%范圍內(nèi)，存活率與甘油的用量成反比，固定甘油用量，在1%～1.38%范圍內(nèi)，釀酒酵母菌存活率與海藻糖用量成正比。圖4為海藻糖1.25%，甘油和脫脂乳對(duì)釀酒酵母菌存活率的影響，根據(jù)等高線可看出，在甘油含量3%～5%，脫脂乳10%～12.5%時(shí)，固定甘油含量，釀酒酵母菌存活率隨脫脂乳含量的增加而增加。圖5為甘油含量4%，海藻糖和脫脂乳對(duì)釀酒酵母菌存活率的影響，固定脫脂乳含量，在海藻糖含量1%～1.4%時(shí)，釀酒酵母菌存活率隨海藻糖含量的增加而增加，在1.4%～1.5%含量時(shí)，釀酒酵母菌存活率隨海藻糖含量的增加而降低。

圖5　海藻糖、脫脂乳及其相互作用對(duì)釀酒酵母菌存活率的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5　Response surface plot and its contour plot showing the effects of trehalose，skim milk and their mutual interactions on Saccharomyces cerevisiae survival rate

2.7釀酒酵母菌保護(hù)劑最佳配方的確定

在選取的各范圍內(nèi)，根據(jù)回歸模型通過(guò)Design Expert軟件分析優(yōu)化得出，釀酒酵母菌保護(hù)劑最佳配方為甘油4.0%、海藻糖1.3%、脫脂乳12.7%，在此優(yōu)化條件下，釀酒酵母菌的存活率可83%。為證實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用實(shí)驗(yàn)中得到的最佳配方重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次并取平均值，釀酒酵母菌存活率可達(dá)82%，與預(yù)測(cè)值基本一致，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合的較好，充分驗(yàn)證了模型的正確性。

3　結(jié)論

通過(guò)發(fā)酵面糊中酵母菌的生理及耐受性實(shí)驗(yàn)，Y8酵母菌具有良好的生長(zhǎng)特性及耐受性，采用VITEC-2 compact微生物鑒定儀對(duì)其鑒定結(jié)果為釀酒酵母菌。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，海藻糖、脫脂乳、甘油三種保護(hù)劑對(duì)凍干過(guò)程釀酒酵母保持活性效果較好；通過(guò)響應(yīng)面法得到復(fù)合保護(hù)劑配方：甘油4.0%、海藻糖1.3%、脫脂乳12.7%，在此優(yōu)化條件下，釀酒酵母菌的存活率可達(dá)82%，為煎餅等傳統(tǒng)食品的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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Identification of yeast in fermented pancake batter and optimization formulations of protection agent

TANG Ming-li，WANG Bo，LIU He，HE Yu-tang，HUI Li-juan，MA Tao*
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Grain and Oil Science and Technology Institute of Bohai University，Jinzhou 121013，China）

Yeast strain with local characteristics and naturally fermented pancake flavor were isolated and screened from pancake fermented batter，Y8had rapid growth and strong acid resistance，which was identified by VITEC-2 compact microbial identification system and prepared freeze-dried bacteria ferment whose protective agent was screened and identified.The results showed that yeast of fermented pancake batter was Saccharomyces cerevisiae，optimized formulation of cryoprotectant was glycerin 4.0%，trehalose 1.3%，skim milk 12.7%.Under these conditions，the survival rate of Saccharomyces cerevisiae could reach 82%，the study provided support for continuous and industrial production of traditional foods.

yeast；identification；protective agent；formulation optimization

TS201.1

A

1002-0306（2015）18-0219-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.035

2014－12－05

唐明禮（1988-），男，在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏，E-mail：707334794@qq.com。

馬濤（1962-），男，教授，研究方向：糧油與植物蛋白工程，E-mail：1040732408@qq.com。