板栗品種褐變度差異性及其多酚氧化酶活性的相關性研究

鄭　龍，肖正東，王陸軍，蔡新玲，傅松玲，*（.安徽農業(yè)大學林學與園林學院，安徽合肥30036；.安徽省林業(yè)科學研究院，安徽合肥3003）

板栗品種褐變度差異性及其多酚氧化酶活性的相關性研究

鄭龍1，肖正東2，王陸軍2，蔡新玲2，傅松玲1，*
（1.安徽農業(yè)大學林學與園林學院，安徽合肥230036；2.安徽省林業(yè)科學研究院，安徽合肥230031）

以37個板栗品種為試材，研究了板栗果實褐變差異性及其與多酚氧化酶（PPO）活性之間的關系，并根據(jù)褐變差異性對各品種進行聚類分析。結果表明：板栗不同品種間褐變差異顯著（p＜0.05），根據(jù)褐變差異性聚類分析，可將37個品種可以分為5個等級；不同品種間PPO活性差異顯著（p＜0.05）；通過探討不同品種間褐變度與PPO活性的關系，發(fā)現(xiàn)隨著板栗品種間PPO活性的升高，褐變度也開始升高，當PPO活性達到90 U·min-1·g-1時，PPO活性對褐變影響開始降低；通過褐變聚類分析，將板栗PPO活性分為5類，在優(yōu)選或改良品種時，可將品種的PPO活性在第一或第二類活性范圍以下作為選擇依據(jù)之一。

褐變度，多酚氧化酶，相關性

板栗（Castanea mollissima Blume）屬殼斗科（Fagaceae）栗屬（Castanea）植物，其營養(yǎng)豐富，栗仁中含有人體必需的蛋白質、碳水化合物、脂肪和多種微量元素，是經濟價值非常高的干果［1］。板栗在儲藏和加工過程中，易產生褐變，會嚴重影響其外觀、風味，降低產品質量。板栗的褐變主要有酶促褐變和非酶褐變［2］。酶促褐變主要是由栗仁中酶的作用引起的［3］，其中多酚氧化酶（Polyphenol Oxidase，PPO）是起主導作用的酶類。多酚氧化酶是大部分植物中都存在的含Gu元素的氧化還原酶，參與呼吸末端氧化還原反應［4-5］，易催化各種酚類（兒茶酚等）使之氧化成醌，從而進一步氧化成黑色素［6］，PPO活性受多基因控制，在2D、2A、2B、3B、6D染色體上都含有與其相關的染色體［7］。在食品加工過程中，預防多酚氧化酶褐變的方法有很多，主要方法是使PPO失活［8-11］。為了抑制板栗的褐變，人們一直都在探索改變其加工工藝或者利用不同的pH、溫度來抑制PPO活性［12-13］。缺乏對相關板栗品種資源PPO活性差異情況的研究，使得具有針對性的板栗品種遺傳改良無法有效的展開?？梢岳煤肿冾伾纳顪\與PPO活性的關系進行比較，探索兩者的關系［14］，并將板栗的PPO活性進行聚類分析，從而將板栗品種進行分類，篩選優(yōu)良抗褐變品種。本研究測定了37個板栗品種的PPO活性分布規(guī)律及其與褐變的關系，為板栗品種優(yōu)選或者品質改良提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

37個品種板栗（表1） 包括河北、北京引進品種16個，安徽省內品種21個，其中‘全椒1號’、‘全椒2號’、‘全椒3號’三個品種種植于滁州市全椒縣，‘南譙1號’、‘南譙2號’、‘南譙4號’、‘南譙5號’四個品種種植于滁州市南譙區(qū)，其余品種于滁州沙河林木良種繁育中心統(tǒng)一種植，所有板栗品種于同一年度果實完全成熟時收集（即栗苞由綠色轉為黃褐色，并開裂成十字裂口）；PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、PEG（聚乙二醇）、鄰苯二酚、磷酸二氫鈉（磷酸緩沖液） 藥品均來自于合肥美豐化工儀器有限公司。

WB-2010水浴鍋天津奧特賽斯儀器有限公司；UV-7502CS分光光度計上海欣茂儀器有限公司；HC-3515高速離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司；FA2004分析天平上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

表1　供試板栗品種Table 1　List of the Castanea mollissima varieties

1.2實驗方法

1.2.1多酚氧化酶活性測定稱取板栗仁10 g，加入少許含1%PVP（聚乙烯吡咯烷酮）和1%PEG（聚乙二醇）的0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH6.5），研磨成勻漿，然后用緩沖液定容至50 mL，將勻漿液在4℃左右以5000 r/min的速度離心10 min，離心后取上清液即為粗酶液，置于4℃冰箱保存。

取1 mL酶液和2 mL 100 mmol/L的鄰苯二酚于30℃水浴預熱5 min，混合后，用分光光度計在410 nm波長下測定5 min內吸光值的變化，以鄰苯二酚加蒸餾水的自然氧化作對照［12］。在室溫下，每克酶液每分鐘吸光值上升0.001定義為1個酶活性單位（U），PPO活性為△A·103（U·min-1·g-1，△A為5 min內的吸光度變化值），重復3次。

1.2.2板栗褐變測定將新鮮板栗脫殼去衣，洗凈瀝干后，用不銹鋼刀將板栗切碎，稱取2份2.5 g的樣品，加適量磷酸緩沖液（pH5.8），研磨，再定容至25 mL，一份在在4℃下離心（3000 r/min）5 min，取上清液置于30℃水浴鍋中20 min，用分光光度計測定420 nm下吸光值，測得的數(shù)據(jù)為褐變初始值。另一份25 mL溶液置于4℃冰箱中3 d后，取出離心（3000 r/min）5 min，取上清液置于30℃水浴鍋中20 min后，在420 nm下吸光，測得的數(shù)據(jù)為褐變終值。每處理3次重復［14］。

1.2.3統(tǒng)計方法測定重復3次，分別平均取樣，結果以平均值計算，實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行處理，用數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件SPSS 19.0進行方差分析和聚類分析（聚類所用數(shù)據(jù)是PPO活性變化值）。

2　結果與分析

2.1板栗品種褐變度差異

從測定結果看（表2），不同品種的板栗褐變度有很大差異，在30℃褐變20 min的情況下，初始褐變度變化幅度為0.128～0.172，變幅范圍為0.044，變幅范圍較小，品種間差異小。說明板栗品種間在初始褐變時，褐變度差異較小。

在4℃褐變3 d的條件下，褐變度終值變化幅度為0.284～0.751，變幅范圍為0.467，變動幅度較大，種間差異性顯著。與初始褐變相比，褐變終值的差異較大。說明板栗品種褐變隨著時間延長，褐變度差異逐漸變大。褐變變化值從0.151～0.600，變幅范圍為0.449，變動幅度較大，差異性顯著（p＜0.05）。

分析表2中數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，板栗的褐變程度是隨著時間延長而加深的，在研究板栗品種的抗褐變能力時，需將初始褐變值、終褐變值和褐變變化值三者結合，綜合分析，才能正確評價品種的抗褐變能力，如表2中的1號（黑山寨7號）品種，其初始褐變度、終褐變度以及變化值都較小，抗褐變能力較高，而37號（陽光2號）品種，其初始褐變度較低，而其終測褐變度卻很高，說明其褐變速度較快，抗褐變能力較低。

2.2板栗品種PPO活性差異

板栗品種PPO活性變異區(qū)間為8.53～149.48 U· min-1·g-1，變幅范圍為140.95 U·min-1·g-1。PPO活性主要集中在30～70 U·min-1·g-1之間，占整體的62%，呈偏態(tài)性，高活性品種和低活性品種數(shù)量較少，品種間差異顯著（p＜0.05）（表2），說明板栗品種間PPO活性變化幅度很大，而由于PPO活性是板栗褐變的主要影響因子，PPO活性的差異必定會對板栗的褐變程度產生影響。

2.3板栗褐變與PPO活性相關性分析

通過分析板栗的PPO活性與其褐變初始值、終值以及變化度的相關性（表3），發(fā)現(xiàn)板栗PPO活性與其褐變度成正相關關系。其中PPO活性與其褐變度變化值相關性最大，與初始值相關性最小。說明在具體分析PPO活性與褐變關系時，可以利用PPO活性與褐變變化值來進行分析。

表2　不同板栗品種的褐變度和PPO活性Table 2　Browning degree and PPO activity of Castanea mollissima varieties

表3　板栗褐變與PPO活性相關性分析Table 3　Correlation analysis of Castanea mollissima browning and PPO activity

通過圖1板栗品種的褐變度變化值與其PPO活性比較，發(fā)現(xiàn)隨著板栗的褐變度的增大，PPO活性整體呈上升態(tài)勢，板栗的PPO活性與其褐變度整體呈正相關。只有部分板栗品種PPO活性較大，但其褐變度卻較小。在PPO活性小于20 U·min-1·g-1時，板栗褐變程度變化較小，在PPO活性超過20 U·min-1·g-1時，隨著其活性增高，褐變的變化值開始加快，當PPO活性超過90 U·min-1·g-1時，PPO活性與褐變度的關系開始不太明顯，但整體仍呈上升態(tài)勢。這說明PPO活性影響著板栗的褐變度，活性越高，褐變度越大。

圖1　板栗品種PPO活性與褐變變化值Fig.1　PPO activity and browning degree of Castanea mollissima varieties

2.4板栗PPO活性聚類結果分析

板栗37個品種的PPO活性不同，利用PPO活性進行聚類分析，從分析結果看（圖2），在聚類分為兩類時，1～31號品種作為一類，32～37號品種為第二類；分為四類，分類結果為，第一類1～20（18號除外）號，第二類18、21～31號，第三類32、34、36號，第四類為33、35、37號；分為五類，分類結果為，第一類1～5號，第二類6～20（18號除外）號，第三類18、21～31號，第四類為32、34、36號，第五類為33、35、37號。

圖2　板栗品種聚類分析樹形圖Table 2　Cluster analysis dendrogram of Castanea mollissima varieties

在幾種分類結果中，分為5類時，各類數(shù)量較為均衡，較為合理，與其他幾種分類方式相比，能更有效地將PPO活性進行區(qū)分。因此，各類PPO活性范圍為，第一類PPO活性為8.53～22.63 U·min-1·g-1，第二類26.46～45.61 U·min-1·g-1，第三類53.24～71.89 U·min-1·g-1第四類94.20～113.30 U·min-1·g-1，第五類125.78～149.48 U·min-1·g-1。通過分類，不同類別褐變度都各自有一定的各自區(qū)間和重疊，說明PPO活性高低對板栗褐變起到了主要作用，隨著活性增高，抗褐變能力越弱，但是其中也受到了其他底物的影響，隨著PPO活性達到一定程度，對褐變的影響能力開始降低。

由此，發(fā)現(xiàn)1～5號褐變度變化小，為抗褐變能力強的品種，即‘黑山寨7號’、‘全椒3號’、‘燕紅’、‘河北尊玉’、‘陽光3號’；而6～17、19～20號為較抗褐變品種；18、21～31號品種褐變變化程度中等；其余品種抗褐變能力弱。

3　結論與討論

3.1將不同板栗品種在相同的環(huán)境下進行褐變實驗，并在420 nm下測量其吸光值，可有效考察不同品種的抗褐變能力，選取抗褐變的板栗品種。對于抗褐變能力不強的品種，在板栗加工過程中，為了防止其褐變，需要做更多的處理，或者輔助添加劑，從而增強抗褐變能力。通過本實驗可大致將板栗抗褐變品種的褐變的變化值規(guī)范在420 nm下吸光變化值在0.35以下。

3.2在測量板栗PPO活性實驗中，以鄰苯二酚為底物，在420 nm下測量5 min吸光度變化值，使各品種間變幅增大［15］，特別是對于高PPO活性的板栗品種，可使其分辨率有效提高，從而利于區(qū)分不同褐變程度的板栗的PPO活性。PPO活性影響著板栗的褐變，其褐變度整體隨著板栗的PPO活性增大而增大，在進行板栗抗褐變品種優(yōu)選或者品種改良時，需要將其PPO活性控制在第一類或者第二類范圍以下，即至少在45.61 U·min-1·g-1以下，從而保證其在加工或者儲藏中保持良好的品質。

3.3板栗品種的整體PPO活性差異很大，如本研究中最高的PPO活性可達149.48 U·min-1·g-1，對于PPO活性高的品種，將對其加工產品的品質造成較大的影響，另外，板栗PPO活性受環(huán)境影響很大，儲藏時間不同、不同外界環(huán)境因子或者處理方法等都會使得PPO活性產生差異。因此，為了進一步了解板栗褐變與PPO活性的差異，以便更好地進行品種優(yōu)選和對已有品種進行改良，需要在未來進一步研究相關的分子鑒定技術。對于此方面的研究，可以借鑒對小麥的PPO活性分子鑒定的研究，確定影響PPO活性的基因的染色體［16-17］，利用相應的分子標記區(qū)分高低PPO活性等位基因，采用PCR技術判斷PPO活性對褐變的影響［18-20］。

［1］王向紅.不同品種板栗的營養(yǎng)價值和品質分析［J］.食品科技，2004（2）：95-97.

［2］康明麗，牟德華.板栗加工褐變機理及防控方法進展研究［J］.河北科技大學學報，2003（24）：72-74.

［3］周家華，常虹.板栗多酚氧化酶的酶學特性［J］.食品研究與開發(fā)，2010（2）：91-94.

［4］張憲政，陳鳳玉，王榮富.植物生理學實驗技術［M］.沈陽：遼寧科學技術出版社，1994：94-97.

［5］Park W J，Shelton D R，Peterson C J，et al.Variation in polyphenol oxidase and quality characteristics among hard white wheat and hard red winter wheat sample［J］.Cereal chem，1997，74（1）：7-11.

［6］帥玉忠，蔣世云，劉光東.荔枝多酚氧化酶動力研究［J］.山西食品工業(yè)，1999（2）：2-4.

［7］Demeke T，Morris C F，Campbell K G，et al.Wheat analytical polyphenol oxidase distribution and genetic mapping in three inbred line populations［J］.Crop Science，2001，41：1750-1757.

［8］YI Jianyong，JIANG Bin，ZHANG Zhong，et al.Effect of ultrahigh hydrostatic pressure on the activity and structure of mushroom（Agaricus bisporus）polyphenoloxidase［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60（2）：593-599.

［9］LIU Wei，LIU Jianhua，XIE Mingyong，et al.Characterization andhigh-pressuremicrofluidization-inducedactivationof polyphenol oxidase from Chinese pear（Pyrus pyrifolia Nakai）［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（12）：5376-5380.

［10］LIU Wei，LIU Jianhua，LIU Chengmei，et al.Activation and conformational changes of mushroom polyphenol oxidase by high pressure microfluidization treatment［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2009，10（2）：142-147.

［11］YANG Zhenfeng，CAO Shifeng，CAI Yuting，et al. Combination of salicylic acid and ultrasound to control postharvest blue mold caused by Penicillium expansum in peach fruit［J］. Innovative Food Science and Emerging Technologies，2011，12（3）：310-314.

［12］曾婷婷，張立彥，芮漢明.板栗的酶促褐變特性及滅酶預處理研究［J］.食品工業(yè)科技，2011（10）：110-113.

［13］周丹，李潁佳，王建中.板栗酶促褐變過程中多酚氧化酶和過氧化物酶活性的變化［J］.食品科技，2014，39（6）：47-50.

［14］李山云，隋啟君，白建明，等.抗機械損傷褐變馬鈴薯品種（系）的篩選［J］.中國馬鈴薯，2010，24（4）：193-196.

［15］楊朝柱，馬傳喜，司紅起，等.普通小麥多酚氧化酶活性的變異［J］.中國農業(yè)科學，2004，37（11）：1713-1717.

［16］張立平，葛秀秀，何中虎，等.普通小麥多酚氧化酶活性的QTL分析［J］.作物學報，2002，31（1）：7-10.

［17］孫家柱，趙軍濤，劉冬成，等.小麥籽粒多酚氧化酶（PPO）檢測的方法的優(yōu)化及其在育種中的應用［J］.麥類作物學報，2012，32（3）：448-453.

［18］孫道杰，何中虎，王輝，等.小麥籽粒PPO活性分子標記研究［J］.西北農林科技大學學報：自然科學版，2006，34（9）：149-156.

［19］He X Y，He Z H，Morris C F，et al.Cloning and phylogenetic analysis of polyphenol oxidase genes in common wheat and related species［J］.Genetic Rosources and Crop Evolution，2009，56：311-321.

［20］He X Y，He Z H，Morris C F，et al.Allelic wariation of polyphenol oxidase（PPO）genes located on chromosome 2A and 2D and development of functional markers for the PPO genes in common wheat［J］.Theoretical and Applied Genetics，2007，115：47-58.

Study on the relationship between the browning and polyphenol oxidase activity of Castanea mollissima

ZHENG Long1，XIAO Zheng-dong2，WANG Lu-jun2，CAI Xin-ling2，F(xiàn)U Song-ling1，*
（1.School of Forestry and Landscape Architecture，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China；2.Anhui Acaademy of Forestry，Hefei 230031，China）

In this study，37 Castanea mollissima cultivars were used to study the relationship between the activities and Castanea mollissima browning differences and polyphenol oxidase（PPO），and according to the cluster analysis browning differences of all varieties.The results showed that the browning of different virities was significantly（p＜0.05）different according to the cluster analysis of browning differences.37 varieties could be divided into 5 levels.The differences of PPO activity between cultivars were significantly.By comparison between varieties of degree the browning and PPO activity increased with the Castanea mollissima varieties，it was found that PPO activity，browning degree were beginning to rise，When PPO activity reached 90 U·min-1·g-1，PPO activity against browning began to decrease by clustering the Castanea mollissima browning，the activities of PPO were divided into 5 categories.When Castanea mollissima preferred or improved varieties，PPO activity varieties could be in the first or second activity of the range that choose one of the following as the basis.

the degree of browning；polyphenol oxidase；correlation

TS201.2

A

1002-0306（2015）18-0126-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.017

2015－01－06

鄭龍（1988-），男，碩士研究生，研究方向：園林植物與觀賞園藝，Email：zhenglong4150@126.com。

傅松玲（1962-），女，教授，研究方向：森林培育教學及研究，Email：fusongling@ahau.edu.cn。

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201104025－3）。