草魚冷藏過(guò)程中肌原纖維蛋白的變化

王發(fā)祥，張付蘭，劉永樂，俞　健，王建輝，李向紅，陳　奇（長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410114）

草魚冷藏過(guò)程中肌原纖維蛋白的變化

王發(fā)祥，張付蘭，劉永樂*，俞健，王建輝，李向紅，陳奇
（長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410114）

通過(guò)亞基組成、熱力學(xué)性質(zhì)、表面疏水性和Ca2+-ATPase活性的變化分析，評(píng)價(jià)了草魚（Ctenopharyngodon idellus）肌原纖維蛋白在冷藏過(guò)程中的變化。結(jié)果表明：冷藏前期草魚肌原纖維表面疏水性增加，說(shuō)明蛋白逐漸變性導(dǎo)致更多的疏水性基團(tuán)暴露出來(lái)，而第6 d后又大幅降低，可能與其部分降解為小分子并聚合有關(guān)；而Ca2+-ATPase活性在冷藏前6 d顯著下降，進(jìn)一步說(shuō)明冷藏前期肌原纖維蛋白變性程度增加；SDS-PAGE分析表明草魚肌原纖維蛋白的亞基組成變化不大，但其蛋白含量在冷藏過(guò)程中呈先增加后下降的趨勢(shì)，同時(shí)部分蛋白條帶信號(hào)時(shí)有時(shí)無(wú)，也說(shuō)明冷藏過(guò)程中既存在大分子亞基一定程度的降解，也存在小分子亞基聚合的情況；冷藏過(guò)程中草魚肌原纖維蛋白的熱力學(xué)性質(zhì)沒有明顯的變化，表明冷藏對(duì)其熱穩(wěn)定性影響不大。

草魚，肌原纖維蛋白，表面疏水性，差示掃描量熱法，冷藏

草魚（Ctenopharyngodon idellus）肉質(zhì)鮮美，價(jià)格適中，深受消費(fèi)者喜愛，是我國(guó)產(chǎn)量和消費(fèi)量最大的淡水魚之一。然而，草魚肉水分含量高，組織酶活性強(qiáng)，很難保鮮和貯藏，即使在冷藏條件下，肌肉也極易軟化、汁液流失甚至腐敗。蛋白質(zhì)為草魚肌肉組織的最重要組成部分，其冷藏過(guò)程中的降解和變性均會(huì)導(dǎo)致其功能喪失，從而直接決定了魚肉質(zhì)量的好壞［1-3］。肌原纖維蛋白是組成肌肉中肌原纖維的蛋白質(zhì)，不溶于水，僅溶于高鹽溶液，種類包括肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白、肌鈣蛋白、輔肌動(dòng)蛋白等15種以上的蛋白質(zhì)。草魚肌肉蛋白質(zhì)中60%～75%為肌原纖維蛋白，其不僅與魚體死后僵硬和肌肉的收縮有關(guān)，還與魚肉加工、儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中的蛋白質(zhì)變性和凝膠形成能力及其穩(wěn)定性有密切關(guān)系［4-5］。已有研究關(guān)注到草魚冷藏過(guò)程中肌肉蛋白質(zhì)的變化［3］，但尚未具體到肌原纖維蛋白變化規(guī)律的研究。因此，研究冷藏過(guò)程中草魚肌原纖維蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，對(duì)研究淡水魚肌肉質(zhì)量的變化及品質(zhì)劣化機(jī)制具有重要意義。

目前，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和差示掃描量熱（DSC）等方法已被用作評(píng)估肌肉蛋白質(zhì)在貯藏過(guò)程中變化和穩(wěn)定性的有力工具。冷藏過(guò)程中，肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase活性、表面疏水性和熱力學(xué)性質(zhì)等作為判定肌肉蛋白質(zhì)變性的重要指標(biāo)，其隨時(shí)間延長(zhǎng)的改變也能直接反映肌肉蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和微結(jié)構(gòu)的變化情況。本文通過(guò)SDS-PAGE、DSC、反相高效液相色譜（RP-HPLC）和Ca2+-ATPase活性測(cè)定等方法，研究了冷藏過(guò)程中草魚肌原纖維蛋白的變性特征及其亞基、熱力學(xué)性質(zhì)的變化規(guī)律，旨在從肌原纖維蛋白變化角度闡述冷藏對(duì)草魚肉的影響，為草魚的保鮮或加工提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮草魚購(gòu)于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，每尾約1.5 kg；甘氨酸、SDS、三羥甲基氨基甲烷、聚乙二醇6000、鹽酸胍、尿素、對(duì)苯二酚、亞硫酸鈉、鉬酸銨分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；5，5’-二硫代-2-硝基苯甲酸分析純，濰坊華實(shí)藥業(yè)有限公司。

Centrifuge 5430R型高速冷凍離心機(jī)德國(guó)eppendorf公司；AUY120分析天平日本島津公司；DTS系列雙頻超聲波清洗機(jī)、微波光波超聲波萃取儀寧波新芝生物科技股份有限公司；THX-05低溫恒溫循環(huán)泵寧波天恒儀器廠；STA449PC型綜合熱分析儀德國(guó)耐馳公司；LC20高效液相色譜日本島津公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1不同冷藏時(shí)間肌原纖維蛋白樣品的制備新鮮草魚致死后去頭、尾、鱗，洗凈后去骨，將肌肉分割成10 g左右的小塊，自封袋包裝（100 g）后于2～4℃冰箱冷藏，分別在0、2、4、6、8和10 d的同一時(shí)間點(diǎn)取出，參考Chen［6］方法制備肌原纖維蛋白樣品。

1.2.2肌原纖維蛋白SDS-PAGE分析在1.2.1中所收集的上清液中吸取肌原纖維蛋白上清液400 μL于1.5 mL Eppendorf管中，1∶1加入2倍還原上樣緩沖液（Tris-HCl，pH6.8，100 mmol/L；SDS，4%；溴酚蘭，0.2%；甘油，20%；β-巰基乙醇，200 mmol/L），混勻煮沸3 min，12000 r/min離心5 min，吸取上清液，上清液即為電泳樣品。電泳條件：分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度5%，恒壓電壓120 V，考馬斯亮藍(lán)G250染色，Gel-Pro 4.5軟件分析電泳圖，比較其光密度（IOD）和蛋白條帶。

1.2.3蛋白質(zhì)表面疏水性分析各個(gè)貯藏時(shí)間的魚肉肌原纖維蛋白溶液樣品用磷酸鹽緩沖液（15.6 mmol/L Na2HPO4，3.5 mmol/L KH2PO4，0.5 mol/L NaCl，pH7.5）做50倍稀釋，12000 r/min離心5 min，上清液用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾備用。樣品以高效液相色譜進(jìn)行反相色譜（PRLC）分析，根據(jù)出峰時(shí)間、峰面積判斷蛋白質(zhì)的疏水性［7-8］。色譜條件：Symmetry-C18色譜柱，柱溫為30℃，SPD-M20A二級(jí)管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，進(jìn)樣量為20 μL。流動(dòng)相為甲醇—水溶液，以水為流動(dòng)相A，以甲醇為流動(dòng)相B，洗脫梯度：0 min，5%B；0～30 min，5%～90%B；30～33 min，90%～5%B；33～40 min，5%B。根據(jù)出峰時(shí)間和特征以8.5 min為分界點(diǎn)，可將8.5～30 min的峰面積與總峰面積的比值作為疏水性系數(shù)用于判斷其表面疏水性強(qiáng)弱的依據(jù)。

1.2.4熱力學(xué)性質(zhì)變化分析采用示差掃描量熱（DSC）分析，間接反映蛋白結(jié)構(gòu)的變化。配對(duì)好鋁坩堝，在鋁坩堝中加入2.5 mg的草魚肌原纖維蛋白質(zhì)樣品，壓蓋密封，以綜合熱分析儀掃描曲線。溫度掃描范圍：30～120℃；掃描速率：10℃/min。

1.2.5Ca2+-ATPase活性的變化分析參考Benjakul［9-10］關(guān)于Ca2+-ATPase活性的測(cè)定方法。

1.2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1SDS-PAGE電泳分析

不同冷藏時(shí)間草魚肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖譜如圖1所示?？梢?，草魚肌原纖維蛋白主要由分子量約為215 ku的肌球蛋白重鏈、43 ku的肌動(dòng)蛋白和33～36 ku的原肌球蛋白等組成［11］；而且，除了從第2 d開始新增了一條98 ku的新條帶外，所有樣品的蛋白條帶分布模式幾乎無(wú)肉眼可辨的差別，說(shuō)明冷藏過(guò)程中，組成肌原纖維蛋白的亞基變化不大。

圖1　草魚冷藏過(guò)程中肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.1　SDS-PAGE pattern of myofibrillar protein of Ctenopharyngodon idellus during refrigerated storage

用Gel-Pro Analyzer 4.0凝膠分析軟件對(duì)圖1進(jìn)行分析，得到各個(gè)泳道中蛋白質(zhì)條帶與其相應(yīng)的分子量和光密度，如表1所示?？梢姀牡? d新增的98 ku的蛋白質(zhì)條帶隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，光密度不斷降低；與此同時(shí)，第0 d樣品中分子質(zhì)量為88 ku的蛋白條帶在第2 d未檢測(cè)出信號(hào)，表明冷藏過(guò)程中存在部分蛋白亞基持續(xù)降解過(guò)程；另外，分子質(zhì)量為73 ku和41 ku的蛋白條帶IOD值呈先增加后降低的趨勢(shì)，至第8 d已檢測(cè)不到信號(hào)；而且，每個(gè)樣品檢測(cè)到蛋白條帶的總IOD值也呈現(xiàn)先升高，第4 d到達(dá)峰值，然后再降低的趨勢(shì)。由于蛋白樣品從提取到上樣都嚴(yán)格保證了一致性，因此，表1結(jié)果可說(shuō)明冷藏過(guò)程中草魚肌原纖維蛋白的含量呈先增加后下降的趨勢(shì)，可能是因?yàn)榍捌诘鞍踪|(zhì)變性引起肌球蛋白聚合體解開，溶解性增加，而后期下降則可能與蛋白質(zhì)的降解有關(guān)。這一趨勢(shì)也與Wang等［12］報(bào)道的大西洋鮭魚的變化趨勢(shì)基本相似。此外，分子量在122～147 ku的蛋白條帶信號(hào)時(shí)有時(shí)無(wú)，表明冷藏過(guò)程中不僅存在大分子亞基逐漸降解，也可能存在小分子亞基聚合的情況。

表1　各個(gè)蛋白帶的光密度分子量分析表Table 1　Analysis of optical density of each protein band with molecular weight

2.2熱力學(xué)性質(zhì)變化分析

DSC方法是分析蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性最有力的工具，蛋白質(zhì)變性過(guò)程中的起始溫度T0，峰值溫度Tg，結(jié)束溫度Te和熱焓ΔH，可以間接反映蛋白質(zhì)在冷藏過(guò)程中結(jié)構(gòu)的變化［13-14］。冷藏過(guò)程中草魚肌原纖維蛋白的熱力學(xué)性質(zhì)的變化如表2所示。由表2可知，在本實(shí)驗(yàn)中，隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，熱變性的結(jié)束溫度Te在小幅度的降低，熱焓ΔH呈現(xiàn)先降低再增加，而后繼續(xù)降低的趨勢(shì)，峰值溫度Tg則沒有明顯的變化規(guī)律?？傮w而言，冷藏過(guò)程中草魚肌原纖維蛋白的熱力學(xué)性質(zhì)變化不大。

表2　不同冷藏時(shí)間的草魚肌原纖維蛋白熱特性表Table 2　Time-dependent changes of thermal characteristics of Ctenopharyngodon idellus myofibrillar protein during different refrigerated storage time

2.3表面疏水性的變化分析

蛋白質(zhì)表面疏水性不僅反映其表面疏水性氨基酸的相對(duì)含量，也可反映蛋白質(zhì)的變性程度，表面疏水性的增加表明其變性程度增加［15］。反相高效液相色譜是根據(jù)樣品疏水性的不同而進(jìn)行的分離，樣品的出峰時(shí)間、出峰面積和峰強(qiáng)度反映出樣品疏水性的強(qiáng)弱，出峰時(shí)間越短，峰面積越大，峰強(qiáng)度越強(qiáng)，說(shuō)明蛋白質(zhì)的疏水性越弱［16］。

圖2　草魚肌原纖維蛋白不同冷藏時(shí)期的凝膠色譜圖Fig.2　Gel chromatogram of myofibrillar proteins of Ctenopharyngodon idellus during different refrigerated storage ice protein

圖2為草魚肌原纖維蛋白不同冷藏時(shí)期的凝膠色譜圖，草魚肌原纖維蛋白不同冷藏時(shí)間點(diǎn)的表面疏水性變化規(guī)律如圖3所示?？梢?，隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，反相色譜的第一個(gè)洗脫峰的面積逐漸減小，根據(jù)色譜的雙保留機(jī)理，有機(jī)相為低濃度時(shí)，蛋白質(zhì)保留主要受疏水作用影響，因此，在反相色譜中先洗脫出來(lái)的部分親水性強(qiáng)，說(shuō)明冷藏過(guò)程中草魚肌原纖維蛋白的親水性組分逐漸減少；然而，蛋白質(zhì)的疏水性系數(shù)并沒有呈現(xiàn)出一直上升的規(guī)律，在冷藏前4 d，草魚肌原纖維蛋白的疏水性系數(shù)逐漸增加，印證了冷藏過(guò)程中蛋白質(zhì)變性伸展，埋藏在分子內(nèi)部的部分疏水性氨基酸暴露出來(lái)，從而導(dǎo)致表面疏水性的增加；但從第4 d開始，疏水性系數(shù)有所下降，這可能是因?yàn)槔洳睾笃诓糠值鞍踪|(zhì)降解為更小的蛋白質(zhì)分子后，又因?yàn)槭杷嗷プ饔镁喓?，其疏水性氨基酸又被包埋在更大的蛋白質(zhì)聚集體內(nèi)部，從而導(dǎo)致表面疏水性基團(tuán)減少。這與Soottawat等［17］報(bào)道的凍藏過(guò)程中比大目狗母魚肌肉蛋白表面疏水性變化規(guī)律類似。

圖3　冷藏過(guò)程中草魚肌原纖維蛋白表面疏水性變化Fig.3　Changes in surface hydrophobicity of grass carp myofibrillar protein during cold storage

2.4Ca2+-ATPase活性的變化分析

肌球蛋白是肌原纖維蛋白的主要部分，ATPase位于肌球蛋白的頭部，當(dāng)肌球蛋白在冷藏過(guò)程中發(fā)生變性時(shí)，ATPase活性已因受到影響而隨之變化，從而失去活性［18］。因此Ca2+-ATPase活性是評(píng)定蛋白質(zhì)品質(zhì)的重要指標(biāo)，測(cè)定ATPase活性的變化可以反映出肌球蛋白的變化情況，繼而反映出肌肉的變化情況［19］。圖4為不同冷藏時(shí)間草魚肌動(dòng)球蛋白Ca2+-ATPase的活性測(cè)定結(jié)果。可見，隨著草魚肌肉冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase活性呈下降趨勢(shì)，尤其是前6 d內(nèi)下降非常顯著（p＜0.01）。

圖4　不同冷藏溫度下草魚肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活性的變化Fig.4　Changes of Ca2+-ATPase activities in Ctenopharyngodon idellus muscle at different temperatures

3　結(jié)論

對(duì)冷藏條件下草魚肌原纖維蛋白的亞基分布、熱力學(xué)性質(zhì)、表面疏水性和Ca2+-ATPase活性等理化性質(zhì)的變化進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：冷藏前期，草魚肌原纖維蛋白逐漸變性導(dǎo)致更多的疏水性基團(tuán)暴露出來(lái)，表面疏水性增加，第6 d后開始大幅降低，可能與其部分降解為小分子并聚合有關(guān)；而Ca2+-ATPase活性在冷藏前6 d顯著下降，進(jìn)一步說(shuō)明冷藏前期肌原纖維蛋白變性程度增加；SDS-PAGE分析表明草魚肌原纖維蛋白的亞基組成變化不大，但其蛋白含量在冷藏過(guò)程中呈先增加后下降的趨勢(shì)，同時(shí)部分蛋白條帶信號(hào)時(shí)有時(shí)無(wú)，也說(shuō)明冷藏過(guò)程中既存在大分子亞基一定程度的降解，也存在小分子亞基聚合的情況；另外，冷藏過(guò)程中草魚肌原纖維蛋白的熱力學(xué)性質(zhì)沒有明顯的變化，表明冷藏對(duì)肌原纖維蛋白的熱穩(wěn)定性影響不大。以上結(jié)果說(shuō)明，草魚冷藏前期，原有維持肌原纖維蛋白穩(wěn)定的作用力被破壞，導(dǎo)致其空間構(gòu)象改變而發(fā)生變性，表面疏水性和Ca2+-ATPase活性均下降；同時(shí)變性引起部分聚合體解開，溶解性增加，表現(xiàn)為光密度（IOD）總和增加。冷藏后期，肌原纖維蛋白逐漸降解，總IOD值降低，降解成的小分子蛋白質(zhì)重新聚合，導(dǎo)致表面疏水性重新下降。

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Changes in myofibrillar proteins of grass carp during chilling storage

WANG Fa-xiang，ZHANG Fu-lan，LIU Yong-le*，YU Jian，WANG Jian-hui，LI Xiang-hong，CHEN Qi
（Hunan Provincial Engineering Research Center for Food Processing of Aquatic Biotic Resources，College of Chemisty and Biology Engineering，Changsha University of Science and Technology，Changsha 410114，China）

Through analyzing the variation of protein subunit composition，thermodynamic properties，surface hydrophobicity and Ca2+-ATPase activity of myosin，the changes in myofibrillar proteins of grass carp during chilling storage were investigated.The results showed that with the extension of chilling storage time，the surface hydrophobicity of myofibrillar proteins was increased at first and then descended sharply and the Ca2+-ATPase activity of myosin was declined significantly，indicating that the degree of myofibrillar protein denaturation was augmented gradually.SDS-PAGE analysis revealed that there was little change in subunits composition of myofibrillar protein，but its total content increased at first but later decreased，and at the same time，part of the protein band signal was occasionally detected，suggesting some degree of degradation with macromolecular subunits and polymerization with small molecular subunit might coexist during cold storage period.Besides，there was no apparent change in thermodynamic properties of the myofibrillar protein of different storage time，indicating that cold storage had little effect on its thermal stability.

grass carp；myofibrillar proteins；hydrophobicity；differential scanning calorimetry；chilling storage

TS201.1

A

1002-0306（2015）18-0082-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.008

2015－01－16

王發(fā)祥（1978-），男，博士，副教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：wfaxiang@163.com。

劉永樂（1962-），男，博士，教授，研究方向：食品生物技術(shù)與大宗農(nóng)產(chǎn)品加工，E-mail：lyle19@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201427，31301564）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD31B08）；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（12JJ6028）。