大黃抑制食源性致病菌的活性成分研究

侯媛媛，吳文惠，許劍鋒，宋益善（上海海洋大學食品學院，上海201306）

大黃抑制食源性致病菌的活性成分研究

侯媛媛，吳文惠，許劍鋒，宋益善*
（上海海洋大學食品學院，上海201306）

研究了大黃對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果，初篩的結(jié)果顯示大黃醇提物對這3種菌均有較強的抑菌作用，并發(fā)現(xiàn)其中抑菌作用最強的物質(zhì)分布在大黃氯仿段萃取物中。利用UPLC-MS-MS分析大黃氯仿段萃取物，發(fā)現(xiàn)大黃氯仿段萃取物的主要成分分別是大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚和大黃酚。在這五種化合物中，大黃酸對大腸桿菌和沙門氏菌具有最強的抑菌效果，對大腸桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度分別為125 μg/mL和250 μg/mL，最小殺菌濃度分別為250 μg/mL和500 μg/mL，大黃素對于金黃色葡萄球菌具有較強的抑菌效果，最小抑菌濃度和最小殺菌濃度分別為62.5 μg/mL和125 μg/mL。

大黃，抑菌，大腸桿菌，沙門氏菌，金黃色葡萄球菌

食源性疾病是較為常見的一類影響人類健康的問題，在美國，每年約有1/6的人由于食用被微生物污染的食物或是飲料而導(dǎo)致疾病發(fā)生。通常，人們會用抗生素來治療各種細菌感染。然而，菌對合成的抑菌劑逐漸產(chǎn)生抗性，且抑菌劑具有毒性引起人們的關(guān)注。因此，從可使用的中藥中尋找新型的抑菌化合物顯得極為重要。

近年來隨著廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，耐藥細菌不斷增多，特別是像大腸桿菌這些高度變異菌株，耐藥性尤為突出［1-3］。目前，醫(yī)學界一直致力于尋找安全有效的抗菌藥物。中草藥是我國醫(yī)學寶庫中最珍貴的財富之一，它存在很多活性強、毒性低的有效成分，如大黃提取物具有較強的抑菌效果，然而，提取物中的主要抑菌成分鮮有報道。

大黃的根是中國最為常用的中藥之一，開始被人們用作瀉藥治療便秘、黃疸和胃腸出血等疾?。?］，近年來，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)大黃具有廣泛的生物活性，主要包括抑菌、抗癌、抗炎和抗氧化［5-7］等。許多研究表明大黃具有廣譜的抗菌作用，Lu等［5］研究發(fā)現(xiàn)大黃蒽醌類化合物對嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度為50～200 μg/mL，李國旺等［8］發(fā)現(xiàn)大黃水提液對大腸桿菌、傷寒沙門氏菌以及綠膿桿菌具有不同程度的抑制作用，茍奎斌等［9］發(fā)現(xiàn)大黃對幽門螺桿菌具有較強的抑制作用。雖然已經(jīng)有人對大黃的抑菌作用有了較為廣泛的研究，但大多是研究大黃粗提物的抑菌作用，而對大黃中起抑菌作用的主要活性化合物鮮有報道，所以本文研究追蹤大黃對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用的主要活性化合物，為天然植物提取物作為抑菌劑提供一定的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

掌葉大黃購自上海同濟大藥堂；乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、DMSO均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養(yǎng)基購于杭州天和微生物有限公司；碘硝基四唑紫（INT）購于生物生工股份有限公司；供試菌種包括大腸桿菌（Escherichia coli ATCC25922）、腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica subsp enterica CMCC50041）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC25923）購于中國科學院微生物研究所。

JSP-1000A小型粉碎機浙江省永康市金穗機械制造廠；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海青浦滬西儀器；DRT-TW調(diào)溫電熱套鞏義市予花儀器有限責任公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋上海博訊實業(yè)有限公司；ESCO垂直流超凈工作臺新加坡ESCO公司；MLS-3750全自動高壓蒸汽滅菌鍋日本三洋；DHG-9243BS-Ⅲ電熱鼓風恒溫干燥箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；CT14RD臺式高速冷凍離心機上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；Waters Acquity超高效液相色譜美國Waters；Waters Xevo G2 Q-TOF質(zhì)譜儀美國Waters。

1.2實驗方法

1.2.1大黃提取和萃取稱取藥材大黃200 g，粉碎后放入1000 mL回流瓶，倒入200 mL無水乙醇70℃回流煮沸5 h，倒出提取液經(jīng)減壓抽濾后，倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，65℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將溶劑再次倒入回流瓶，回流煮沸，重復(fù)5次，得到膏狀提取物22.4 g。稱取10 g大黃乙醇提取物，溶入100 mL去離子水中，得到混濁的水懸浮液，搖勻，裝入1000 mL分液漏斗中，分別用石油醚萃取5次（每次100 mL），合并石油醚萃取液，減壓回收石油醚，制得漿狀石油醚組分；水相繼續(xù)用氯仿萃取5次（每次100 mL），合并有機相，減壓濃縮，制得氯仿組分；按照相同方法依次得到乙酸乙酯組分，正丁醇組分和剩余的水組分。不同組分的萃取物置于4℃冰箱備用。提取和萃取流程見圖1。

圖1　大黃提取和分段萃取流程Fig.1　The process of extraction by ethanol and further fractionation

1.2.2大黃醇提物和各萃取組分的抑菌活性參照Chan等的方法［10］測定抑菌圈直徑，略有改動。將大黃5種分段萃取物和大黃醇提物分別配制成濃度為0.01 g/mL的溶液。將活化后的大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌菌液濃度調(diào)整至107CFU/mL，用移液槍取0.1 mL，均勻涂布于制備好的平板上，置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中10 min，使表面干燥，用無菌鑷子將濾紙片貼在培養(yǎng)基表面，輕壓紙片以確保接觸良好，然后吸5 μL 0.01 g/mL的樣品滴于濾紙片表面并做標記。37℃下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈大小并測定其直徑，濾紙片實驗重復(fù)3次取平均值。

1.2.3最小抑菌濃度（MinimumInhibitory Concentrations）和最小殺菌濃度（Minimum Bactericidal Concentrations）的測定96孔板微量稀釋法：參照NCCLS［11］將大腸桿菌和沙門氏菌菌液濃度調(diào)整至105～106CFU/mL，將樣品溶解于DMSO中，樣品濃度配制成2000 μg/mL，經(jīng)2倍系列稀釋，得到系列濃度為1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81 μg/mL。實驗組每孔加入50 μL菌液和50 μL樣品，對照組只加入50 μL菌液和50 μL DMSO，將96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃條件下培養(yǎng)24 h，取出，每孔加入10 μL的INT溶液，染色30min后觀察顏色變化，活細胞經(jīng)INT染色后變成紫色，若沒有活細胞則不變色，顏色沒有發(fā)生變化的最小濃度即為最低抑菌濃度，培養(yǎng)48 h后染色顏色沒有變化的最小濃度為最小殺菌濃度。

1.2.4大黃氯仿段萃取物UPLC-MS-MS分析稱取1 mg干燥的大黃氯仿萃取組分，溶解于10 mL的甲醇中，得到濃度為100 μg/mL的溶液，常溫下超聲5 min，用0.22 μm濾膜過濾，備用。

色譜條件：超高效液相色譜（UPLC）：Waters Acquity超高效液相色譜。色譜柱：BEH C18。流動相為：A為0.5%甲酸水溶液，B為乙腈。流速為0.4 mL/min，初始為A∶B=70∶30，之后勻速變化，4.5 min到達A∶B= 40∶60，在5 min時改變流動相為A∶B=20∶80，5.1 min時流動相瞬間變?yōu)锳∶B=70∶30運行時間為1.9 min。柱溫40℃，進樣體積5 μL。

質(zhì)譜條件：儀器：Waters Xevo G2 Q-TOF質(zhì)譜儀；電離源：ESI負離子源；質(zhì)量掃描范圍：100～1000；毛細管電壓：2.5 kV；錐孔電壓：35 V；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：450℃；錐孔氣流速：50 L/h；脫溶劑氣流速：800 L/h；二級質(zhì)譜碰撞能量：35 Ev。

2　結(jié)果與分析

2.1大黃醇提物和分段萃取物的抑菌圈直徑

表1為大黃乙醇粗提物和5種分段萃取物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑的結(jié)果，六種溶液對大腸桿菌的抑菌圈直徑大小為：氯仿萃取部分＞乙醇提取物=石油醚萃取部分＞乙酸乙酯萃取部分＞正丁醇萃取部分＞水萃取部分；對沙門氏菌的抑菌圈直徑大小為：氯仿萃取部分＞乙醇提取物＞石油醚萃取部分＞乙酸乙酯萃取部分＞正丁醇萃取部分=水萃取部分；對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大小為：氯仿萃取部分＞乙醇提取物＞乙酸乙酯萃取部分＞石油醚萃取部分＞正丁醇萃取部分＞水萃取部分。說明大黃氯仿段萃取物對大腸桿菌、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌有最好的抑菌效果。

2.2大黃醇提物和分段萃取物的最小抑菌濃度

表1　大黃醇提物和各分段萃取物的抑菌圈直徑Table 1　Diameters of inhibition zone of rhubarb crude extract and five fractions

表2　大黃醇提物和分段萃取物的最小抑菌濃度Table 2　The MIC of rhubarb crude extract and five fractions against 3 strains

從表2可以看出，大黃氯仿組分與大黃乙醇粗提物對3種菌的最小抑菌濃度相同，對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為6.25、12.5、3.16 mg/mL。與各萃取組分相比，最小抑菌濃度值最小，說明大黃氯仿段萃取物的抑菌效果最好。為了追蹤最為有效的抑菌單體化合物，接下來用UPLCMS-MS分析氯仿組分的組成成分。

2.3UPLC-MS/MS分析大黃氯仿部分組成成分

通過圖2和表3以及對比Wei等［12］的研究結(jié)果，可知液相色譜圖中標出的化合物依次為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚。

圖2　大黃氯仿萃取部分的液相色譜圖Fig.2　UPLC chromatogram of the five major compounds identified from chloroform fraction of rhubarb crude extract

2.45種化合物的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

從表4可知大黃酸和大黃素對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有較強的抑菌效果，大黃酸對大腸桿菌最小抑菌濃度和最小殺菌濃度分別為125和250 μg/mL，對沙門氏菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度分別為250和500 μg/mL，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度分別為125和250 μg/mL；大黃素對大腸桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度為250 μg/mL和500 μg/mL，對沙門氏菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度為500和1000 μg/mL，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度為62.5和125 μg/mL。通過實驗對比可知大黃酸對大腸桿菌和沙門氏菌具有較強的抑菌效果，大黃素對金黃色葡萄球菌有較強的抑菌效果。

表3　大黃氯仿萃取物化合物成分Table 3　Chemical composition of chloroform extraction of rhubarb

表4　大黃氯仿組分化合物對3種菌的最小抑菌和殺菌濃度Table 4　The MIC and MBC of five components from chloroform extraction against 3 strains

3　結(jié)論

濾紙片實驗和96孔板微量稀釋實驗結(jié)果表明大黃提取物對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為6.25、12.5、3.16 mg/mL。對抑菌活性成分進一步分析，用四種不同極性的溶劑對大黃提取物水溶液進行萃取，得到五個萃取部分：石油醚部、三氯甲烷部（氯仿部）、乙酸乙酯部、正丁醇部和水部。濾紙片實驗和96孔板微量稀釋實驗測定大黃提取物不同萃取部分對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果結(jié)果表明：氯仿部對這3種菌的抑制效果最強。氯仿部分經(jīng)UPLC-MS/MS分析和抑菌實驗，追蹤到大黃中對大腸桿菌和沙門氏菌抑制作用的有效物質(zhì)為大黃酸，對金黃色葡萄球菌抑制作用的有效物質(zhì)為大黃素。

［1］黃衍強，黃宏思，張蓮，等.6種中草藥抗耐藥性大腸桿菌的抑菌效果川［J］.右江民族醫(yī)學院學報，2009，31（3）：368-369.

［2］張秀英，宋立，趙暉，等.中藥制劑對大腸桿菌耐藥性逆轉(zhuǎn)的作用研究［J］.中國獸藥雜志，2012，46（9）：11-14.

［3］劉坤友，陳桂生，劉鳳玲，等．廣西柳江縣農(nóng)村耐藥性大腸桿菌gyrA基因突變的研究［J］.廣西醫(yī)學，2013，35（1）：25-26.

［4］Huang Q，Lu G，Shen H M，et al.Anti-cancer properties of anthraquinones from rhubarb［J］.Medicinal Research Reviews，2007，27：609-630.

［5］Chunxia Lu，Hongxin Wang，Wenping Lv，et al.Antibacterial properties of anthraquinones extracted from rhubarb against Aeromonas hydrophila［J］.Fish Science，2011，77：375-384.

［6］傅興圣，陳菲，劉訓(xùn)紅，等.大黃化學成分與藥理作用研究新進展［J］.中國新藥雜志，2011，26（11）：1534-1538.

［7］Choi R J，Ngoc T M，Bae K，et al.Anti-inflammatory properties of anthraquinones and their relationship with the regulation of P-glycoprotein function and expression［J］.European Journal of Pharmaceutical Sciences，2013，48：272-281.

［8］李國旺，苗志國，趙恒章.大黃的體外抑菌實驗［J］.光譜實驗室，2011，28（1）：66-68.

［9］茍奎斌，孫麗華，婁衛(wèi)寧，等.大黃中4種蒽醌類化合物抑幽門螺桿菌效果比較［J］.中國藥學雜志，1997，32（5）：278-280.［10］Lai Wah Chan，Emily LC Cheah，Constance LL Saw，et al. Antibacterial and antioxident activities of CortexMagnoliae Officinalis and some other medicinal plants commonly used in South-East Asia［J］.Chinese Medicine，2008（3）：15.

［11］National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing；ninth informational supplement［Z］.NCCLS document M100-S9，2008，120-126.

［12］Wei Jin，Yingfeng Wang，Rili Ge，et al.Simultaneous analysis of multiple bioactive constituents in Rheum tanguticum Maxim. Ex Balf.By high-performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2007，21：2351-2360.

Antibacterial activities of rhubarb extracts against food-borne bacteria and the bioactive compounds

HOU Yuan-yuan，WU Wen-hui，XU Jian-feng，SONG Yi-shan*
（Colleage of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

In this study，antibacterial activities of rhubarb against E.coli，Salmonella and S.aureus were studied. Preliminery screening indicated that rhubarb root ethanol extract，and the chloroform fraction was found to be the most active fraction of the crude extract.Five major compounds were identified from the chloroform fraction by UPLC-MS/MS，namely emodin，aloe-emodin，rhein，physcion and chysophanol.Among these five compounds，rhein showed the greatest antibacterial activities against E.coli and Salmonella with the MIC as 125 and 250 μg/mL，MBC as 250 and 500 μg/mL.Emodin showed the greatest antibacterial activities against S.aureus. with the MIC and MBC as 62.5 and 125 μg/mL.

rhubarb；antibacterial；E.coli；Salmonella；S.aureus

TS201.3

A

1002-0306（2015）18-0073-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.006

2015－01－06

侯媛媛（1989-），女，碩士研究生，主要從事食品微生物方面的研究，E-mail：hou_yuan_yuan@126.com。

宋益善（1980-），男，講師，主要從事無機分析化學及食品微生物方面的研究，E-mail：yssong@shou.edu.cn。

國家自然科學基金（81341082）。