食源性致病菌MALDI-TOF MS檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

周千渝，張延國(guó)，黃成才，謝景麗，高青珍，劉　肅，*（.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)部蔬菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，北京0008；.島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司，分析儀器事業(yè)部，北京0000）

食源性致病菌MALDI-TOF MS檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

周千渝1，張延國(guó)1，黃成才2，謝景麗1，高青珍1，劉肅1，*
（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，農(nóng)業(yè)部蔬菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，北京100081；2.島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司，分析儀器事業(yè)部，北京100020）

建立用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）快速檢測(cè)并鑒定從鮮食蔬菜中分離到的5種食源性致病菌的方法。以標(biāo)準(zhǔn)菌株為模式菌，考察基質(zhì)溶液配比、菌株培養(yǎng)條件、溶劑處理方法、點(diǎn)樣方法及比例等條件對(duì)鑒定結(jié)果的影響，確定最優(yōu)方法，并考察方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性和檢測(cè)限。分別用所建立的方法和16S rRNA基因測(cè)序法對(duì)7株標(biāo)準(zhǔn)菌株和93株分離株進(jìn)行分析，比較兩者鑒定結(jié)果的一致性。結(jié)果表明，所建立的方法穩(wěn)定性良好，檢測(cè)限為106～109cfu/mL，菌株鑒定結(jié)果與基因測(cè)序鑒定結(jié)果具有較高一致性（83%在種水平鑒定一致，94%在屬水平鑒定一致）。MALDI-TOF MS法可用于食源性致病菌的準(zhǔn)確、快速、低成本、高通量的檢測(cè)及鑒定。

MALDI-TOF MS，食源性致病菌，檢測(cè)，鑒定

食源性致病菌導(dǎo)致的食品安全問(wèn)題越來(lái)越受到關(guān)注。資料顯示，2006年到2010年，我國(guó)共收到食源性疾病暴發(fā)事件報(bào)告2023起，累計(jì)發(fā)病62920人，死亡967人，其中微生物引起的食源性疾病暴發(fā)事件數(shù)和患者數(shù)最多，分別占40.09%和61.92%［1］。存在于食品介質(zhì)上的潛在致病菌包括沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌等，這些污染若未得到及時(shí)監(jiān)測(cè)和有效控制，則對(duì)人體存在極大潛在危害［2］。微生物快速檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用將為食源性致病菌監(jiān)測(cè)提供重要的技術(shù)支撐。

食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)主要包括基于微生物形態(tài)學(xué)、生理生化反應(yīng)的傳統(tǒng)方法，分子生物學(xué)方法以及免疫學(xué)方法。傳統(tǒng)方法操作復(fù)雜，檢測(cè)周期長(zhǎng)；分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果靈敏，快速高效，但是實(shí)驗(yàn)操作也相對(duì)復(fù)雜，成本較高。在實(shí)際應(yīng)用中上述方法不能完全滿足細(xì)菌準(zhǔn)確、快速、高通量檢測(cè)的需要［3-4］。質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為食源性致病菌的快速檢測(cè)提供了新思路，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）具體原理是細(xì)菌樣品與基質(zhì)（小分子有機(jī)酸）溶液形成的共晶體在激光照射下發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，不同質(zhì)荷比（m/z）的離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)飛行時(shí)間檢測(cè)器（TOF）時(shí)所用的時(shí)間不同而被分離和檢測(cè)，所測(cè)得的蛋白質(zhì)及多肽質(zhì)量指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，即可得到鑒定結(jié)果［5］。目前，此技術(shù)已被應(yīng)用于多種臨床病原菌的快速鑒定［6］。在我國(guó)，MALDI-TOF MS技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的研究尚處于起步階段，已有的研究表明此技術(shù)應(yīng)用于食源性致病菌鑒定和分型方面是可行的。另外，MALDI-TOF MS技術(shù)在真菌毒素檢測(cè)、菌株功能蛋白分析、食品過(guò)敏源檢測(cè)、真?zhèn)伪鎰e、產(chǎn)地溯源、細(xì)菌耐藥性研究等方面也具有潛在應(yīng)用價(jià)值［7-9］。

基質(zhì)溶液配比、菌株培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)基、溶劑處理方法、點(diǎn)樣方法及比例等是影響譜圖質(zhì)量的主要因素［10-12］，本文以幾種標(biāo)準(zhǔn)菌株為模式菌，考察了以上幾個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，研究了樣品處理及質(zhì)譜分析的最佳方法，并通過(guò)分析實(shí)際分離到的菌株對(duì)此方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證，以期建立一種適用于食源性致病菌的快速檢測(cè)方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

甲酸（FA）、乙腈（ACN）、三氟乙酸（TFA）、無(wú)水乙醇、α-氰-4-羥基肉桂酸（CHCA） 色譜純，Sigma公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基（BHI）、改良山梨醇麥康凱（CT-SMAC）瓊脂、Baird-Parke（BP）瓊脂、PALCAM瓊脂、HE瓊脂、XLD瓊脂、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基青島海博生物技術(shù)有限公司；腦心浸液肉湯（BHIB） 美國(guó)Oxid公司；7株標(biāo)準(zhǔn)菌株：出血性大腸桿菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7，CICC 21530）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli，ATCC 8739）、腸炎沙門(mén)氏菌（Salmonella enteritidis，CICC 21482）、鼠傷寒沙門(mén)氏菌2株（Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium，ATCC 14028、ATCC 49416）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CICC 23656）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，CICC 21633）；93株蔬菜中分離到的野生菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

AXIMA Performance基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀島津公司；DHP-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱佳美儀器有限公司；WH-2型微型渦旋混合儀上海瀘西分析儀器廠；TGL-16B型高速臺(tái)式離心機(jī)安亭科學(xué)儀器廠；D-1型高壓蒸汽滅菌鍋湖北永大換熱設(shè)備有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1基質(zhì)溶液的選擇10 mg的α-氰-4-羥基肉桂酸溶解于1 mL的超純水、乙腈、三氟乙酸的混合溶液（三者的體積比分別為19∶20∶1和49.9∶50∶0.1）中制成基質(zhì)飽和溶液1和溶液2。以出血性大腸桿菌CICC 21530和金黃色葡萄球菌CICC 23656為模式菌，考察不同基質(zhì)溶液對(duì)質(zhì)譜結(jié)果的影響。兩株細(xì)菌分別接種于BHI培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h后，無(wú)菌操作分別挑取適量菌落（5～10 mg）加入含300 μL超純水的1.5 mL的無(wú)菌離心管中，仔細(xì)混勻后再加900 μL無(wú)水乙醇，再次混勻滅活，12000 r/min高速離心2 min后棄去上清。滅活后的菌體沉淀中先后加入50 μL的70%甲酸和50 μL乙腈，充分懸浮，混勻，以12000 r/min離心2 min提取蛋白，上清液備用。制備的上清液樣品和兩種基質(zhì)溶液以1∶1的體積比覆蓋法點(diǎn)樣，同一細(xì)菌樣品不同基質(zhì)溶液分別重復(fù)點(diǎn)12個(gè)孔進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.2.2培養(yǎng)條件的選擇以金黃色葡萄球菌CICC 23656和沙門(mén)氏菌ATCC 14028標(biāo)準(zhǔn)菌株為模式菌，分別考察不同培養(yǎng)基及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)質(zhì)譜結(jié)果的影響。將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于NA、BHI、PCA三種非選擇性培養(yǎng)基上，將沙門(mén)氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于BHI、BS、XLD、HE、沙門(mén)顯色培養(yǎng)基上，將上述培養(yǎng)基于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48、72 h培養(yǎng)后，以1.2.1所述方法滅活并提取蛋白后點(diǎn)樣進(jìn)行質(zhì)譜分析，使用上述基質(zhì)溶液1點(diǎn)樣。同一培養(yǎng)條件平行處理三次，每個(gè)處理平行點(diǎn)樣三次。

1.2.3蛋白提取方法的選擇以大腸桿菌ATCC 8739為模式菌，標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于BHI培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)24 h后，挑取適量菌落用1.2.1所述方法滅活后，考察以下六種蛋白提取方法（見(jiàn)表1）對(duì)結(jié)果的影響。滅活菌體沉淀分別按照表1步驟處理后，仔細(xì)混勻樣品，以12000 r/min離心2 min，留取上清液備用。每種方法平行處理3個(gè)樣品，每個(gè)樣品平行點(diǎn)樣三次。

表1　蛋白提取方法Table 1　Protein extraction method

1.2.4點(diǎn)樣及MALDI-TOF MS分析以出血性大腸桿菌CICC 21530為模式菌考察以下不同點(diǎn)樣方法及點(diǎn)樣比例對(duì)質(zhì)譜結(jié)果的影響。覆蓋法：移取經(jīng)上述方法處理后的上清液點(diǎn)至靶板，室溫自然干燥后覆蓋CHCA基質(zhì)溶液，自然干燥后上機(jī)分析，上清液樣品及基質(zhì)溶液點(diǎn)樣量分別為1 μL+1 μL、0.5 μL+1 μL、1 μL+0.5 μL；夾心法：先在靶板上點(diǎn)0.5 μL基質(zhì)溶液，干燥后覆蓋1 μL樣品，自然晾干再覆蓋0.5 μL基質(zhì)溶液；混合干滴法：點(diǎn)靶前樣品和基質(zhì)溶液等量混合，取1 μL混合液立即點(diǎn)樣，干燥后上機(jī)分析。每種點(diǎn)樣方法及比例重復(fù)點(diǎn)樣6次，分析鑒定結(jié)果一致性。

質(zhì)譜儀器參數(shù)如下：線性操作模式，陽(yáng)離子模式，檢測(cè)范圍：2000～20000 Da；激光點(diǎn)擊數(shù)：每圖譜100；激光頻率：50 Hz；離子源加速電壓：20 kV。每次實(shí)驗(yàn)前都要在采集數(shù)據(jù)的質(zhì)量范圍內(nèi)用大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株樣品進(jìn)行儀器校準(zhǔn)，以保證所獲得的離子質(zhì)量數(shù)誤差小于±7。

1.2.5檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌CICC 21530和沙門(mén)氏菌CICC 21482各一株為模式菌，考察方法的檢測(cè)限。兩株菌株分別接種于10 mL的BHIB中于37℃培養(yǎng)24 h后，分別用0.85%無(wú)菌生理鹽水以1∶10的比例梯度稀釋9次。每個(gè)稀釋度的菌液各取1 mL，離心棄上清，沉淀菌體用1.2.1的方法處理并以覆蓋法1 μL+ 1 μL點(diǎn)樣分析。每個(gè)稀釋度的樣品重復(fù)處理三次，每個(gè)處理重復(fù)點(diǎn)樣三次，通過(guò)分析不同稀釋度樣品的鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性來(lái)考察儀器檢測(cè)限。同時(shí)各取兩者的三個(gè)最高稀釋倍數(shù)的菌液1 mL用于PCA平板計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度重復(fù)計(jì)數(shù)三次。

1.2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌CICC 21530和金黃色葡萄球菌CICC 23656作為模式菌，三個(gè)不同時(shí)間分別以同樣的方法處理后進(jìn)行質(zhì)譜分析，每個(gè)菌株3個(gè)平行處理，每個(gè)處理重復(fù)點(diǎn)樣4次，考察同一批次及不同批次處理后鑒定結(jié)果的穩(wěn)定性。

1.3數(shù)據(jù)處理

用Shimadzu Biotech launchpad 2.9軟件對(duì)采集到的圖譜進(jìn)行分析比較。采集結(jié)果導(dǎo)入到SARMIS數(shù)據(jù)庫(kù)中，與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對(duì)，經(jīng)軟件計(jì)算給出相應(yīng)的得分和鑒定結(jié)果。得分在90%～99.9%，結(jié)果以綠色標(biāo)出，表示鑒定結(jié)果可信；得分在85%～89.9%，結(jié)果以黃色標(biāo)出，表示鑒定結(jié)果可信度較高；得分在70%～85%，結(jié)果以白色標(biāo)出，表示可能的菌屬或者菌種鑒定；得分70%以下不給出鑒定結(jié)果。若以紅色標(biāo)出，表示不可信的鑒定結(jié)果或者樣品有雜菌污染。重復(fù)處理及點(diǎn)樣的樣品，以平均鑒定得分及其變異系數(shù)（C.V）考察鑒定結(jié)果的可信度和穩(wěn)定性。

2　結(jié)果與討論

2.1基質(zhì)溶液的選擇

用基質(zhì)溶液1和基質(zhì)溶液2以相同方法點(diǎn)樣分析的所有樣品都得到準(zhǔn)確鑒定結(jié)果，但用基質(zhì)溶液1的平均得分稍高。對(duì)于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，用基質(zhì)溶液1點(diǎn)樣鑒定平均得分分別為99.9%、99.9%，用基質(zhì)溶液2點(diǎn)樣鑒定平均得分為94.7%、95.0%。

圖1是大腸桿菌用兩個(gè)溶液點(diǎn)樣分析后得到的質(zhì)譜圖，看出A的特征峰峰形更好，而B(niǎo)的基線噪音較明顯，部分特征峰的位置有偏離，可能是因?yàn)榛|(zhì)溶液中的三氟乙酸可以影響樣品和基質(zhì)的共結(jié)晶過(guò)程［13］，從而影響數(shù)據(jù)的采集。使用兩者久置（室溫或者4℃保存一個(gè)月）的基質(zhì)溶液實(shí)驗(yàn)時(shí)，這一趨勢(shì)更明顯。因此，基質(zhì)溶液選擇超純水、乙腈、三氟乙酸（體積比19∶20∶1）的CHCA飽和溶液，每次實(shí)驗(yàn)前重新配制。

圖1　大腸桿菌用不同配比的基質(zhì)溶液點(diǎn)樣得到的質(zhì)譜圖Fig.1　The spectra of E.coli strains using

2.2培養(yǎng)條件的選擇

不同條件培養(yǎng)金黃色葡萄球菌CICC 23656，鑒定得分見(jiàn)表2。48、72 h培養(yǎng)的個(gè)別樣品鑒定得分較低，可能是因?yàn)榧?xì)菌長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)產(chǎn)生了代謝物會(huì)對(duì)結(jié)果有所影響，本實(shí)驗(yàn)后續(xù)菌株培養(yǎng)時(shí)間均為24 h。實(shí)際上，細(xì)菌只要經(jīng)過(guò)培養(yǎng)在瓊脂平板上形成可方便挑取的菌落即可，一般過(guò)夜培養(yǎng)就可達(dá)到要求；用NA、PCA、BHI培養(yǎng)金黃色葡萄球菌24 h后，鑒定平均得分均在95%以上，質(zhì)譜圖無(wú)明顯差異，說(shuō)明三種非選擇性培養(yǎng)基對(duì)質(zhì)譜結(jié)果影響不大，但是從幾組鑒定得分的變異系數(shù)看出，BHI培養(yǎng)基24 h培養(yǎng)時(shí)變異系數(shù)最小，結(jié)果穩(wěn)定性更好。

表2　金黃色葡萄球菌經(jīng)不同培養(yǎng)條件培養(yǎng)后的鑒定得分（%）Table 2　Identification scores of Staphylococcus aureus in different cultivation conditions（%）

沙門(mén)氏菌ATCC 14028經(jīng)BHI、BS、XLD、HE、沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24 h并處理后得到的質(zhì)譜圖不同特征峰的峰強(qiáng)度稍有差異，但質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對(duì)，軟件計(jì)算后，都得到準(zhǔn)確鑒定。表3是9個(gè)平行樣品的鑒定得分，可看出平均鑒定得分均大于95%，且除了沙門(mén)顯色培養(yǎng)基外，其他鑒定得分的變異系數(shù)均小于5%，說(shuō)明非選擇性培養(yǎng)基對(duì)鑒定結(jié)果幾乎無(wú)影響。本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一選擇37℃，BHI培養(yǎng)24 h為后續(xù)研究菌株的培養(yǎng)條件。

表3　沙門(mén)氏菌經(jīng)不同培養(yǎng)基培養(yǎng)后的鑒定得分（%）Table 3　Identification scores of Salmonella enteritidis on different culture medium（%）

2.3蛋白提取方法的選擇

六種方法處理大腸桿菌ATCC 8739，得到的譜圖見(jiàn)圖2?？闯龇椒?處理后特征峰數(shù)量有所減少，其他圖譜之間各峰強(qiáng)度稍有差異，可能是因?yàn)椴煌崛》椒▽?duì)非特征峰的出峰有影響，但所有樣品都得到準(zhǔn)確鑒定，平均鑒定得分均在95%以上，變異系數(shù)均小于3%。說(shuō)明處理方法對(duì)特征峰數(shù)量及強(qiáng)度影響不大，這與相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道不太一致［14］。實(shí)驗(yàn)最終確定用報(bào)道較多的70%甲酸和乙腈處理菌株，即為文中提到的方法1。

2.4點(diǎn)樣方法及點(diǎn)樣比例的選擇

不同點(diǎn)樣方法及比例點(diǎn)樣的大腸桿菌所得譜圖見(jiàn)圖3。覆蓋法點(diǎn)樣，前兩者特征峰數(shù)量及強(qiáng)度較一致，平均鑒定得分均大于98%，變異系數(shù)小于1%，但樣品與基質(zhì)以覆蓋法1 μL+0.5 μL點(diǎn)樣時(shí)，特征峰數(shù)量有所減少。夾心法及混合干滴法點(diǎn)樣得到的圖譜基線噪音較大，特征峰數(shù)量明顯減少，平均得分分別為90.8%、89.9%，得分變異系數(shù)分別為4%、9%。證明點(diǎn)樣方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大影響。本實(shí)驗(yàn)后續(xù)研究最終選擇覆蓋法1 μL+1 μL點(diǎn)樣。

圖2　不同處理方法處理大腸桿菌得到的質(zhì)譜圖Fig.2　The spectra of E.coli of different pre-treatment

2.5方法的檢測(cè)限

根據(jù)最高稀釋倍數(shù)的菌液計(jì)數(shù)結(jié)果推算出各個(gè)稀釋度的菌濃度。表4為檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)結(jié)果，菌濃度在105cfu/mL以下的稀釋菌液，滅活離心后菌體沉淀幾乎觀察不到，按照處理步驟加溶劑提取蛋白并點(diǎn)樣分析，無(wú)法得到鑒定結(jié)果。因此確定此方法檢測(cè)限為106～109cfu/mL，這個(gè)檢測(cè)限滿足一般檢測(cè)需求。

圖3　不同點(diǎn)樣方法及點(diǎn)樣比例得到的金黃色葡萄球菌質(zhì)譜圖Fig.3　The spectra of Staphylococcus aureus by different sample/matrix proportion and sample deposition method

表4　檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4　Results of the detection limit

2.6方法的穩(wěn)定性

同一批次的大腸桿菌CICC 21530和金黃色葡萄球菌CICC 23656樣品不同重復(fù)之間鑒定結(jié)果高度一致，平均得分均大于95%，變異系數(shù)均小于5%；三個(gè)不同批次之間，相同菌株的鑒定結(jié)果一致，平均得分均大于97%，變異系數(shù)均小于5%，且質(zhì)譜圖無(wú)明顯差異，證明此方法穩(wěn)定性和重復(fù)性良好。

2.7與16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果的對(duì)比

7株標(biāo)準(zhǔn)菌株，56株根據(jù)食品微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)GB 4789的方法［15］從鮮食蔬菜中分離到的食源性致病菌（包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌），以及37株分離過(guò)程中得到的菌株（包括銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌等涉及食物中毒報(bào)道案例的條件致病菌，或按照傳統(tǒng)方法在檢驗(yàn)過(guò)程中以假陽(yáng)性出現(xiàn)的非常見(jiàn)的野生菌株）。以上共100株菌株分別同時(shí)用MALDI-TOF MS法和16S rRNA基因測(cè)序法分析，前者有91株鑒定到種水平，5株細(xì)菌無(wú)鑒定結(jié)果。后者92株菌株鑒定到種水平，1株測(cè)序結(jié)果BLAST比對(duì)后無(wú)法得到確認(rèn)。表5是兩方法的鑒定結(jié)果對(duì)比，其中83株菌株在種水平上兩方法鑒定一致，94株在屬水平上鑒定一致。MALDI-TOF MS法分析的56株常見(jiàn)食源性致病菌除一株沙門(mén)氏菌和一株李斯特菌只鑒定到屬水平外，其他的都在種水平上與測(cè)序結(jié)果鑒定結(jié)果相符。此結(jié)果說(shuō)明MALDI-TOF MS方法的可靠性良好。

3　結(jié)論與討論

本文建立的菌株處理方法如下：取適量（5～10 mg）新鮮培養(yǎng)的菌株到300 μL超純水中混勻，再加入900 μL無(wú)水乙醇充分混勻滅活，12000 r/min高速離心2 min后棄去上清，沉淀中先后加入50 μL 70%甲酸和等量乙腈，仔細(xì)混勻后，12000 r/min高速離心2 min，上清液以覆蓋法1 μL+1 μL點(diǎn)樣分析，基質(zhì)溶液選擇體積比為19∶20∶1的超純水、乙腈、三氟乙酸三者的混合溶液的CHCA飽和液。另外，文中提到的其他處理方法的適用性及穩(wěn)定性有待進(jìn)一步研究。

MALDI-TOF MS具有操作簡(jiǎn)單，快速（每個(gè)樣品2～3 min可完成鑒定），成本低（與傳統(tǒng)方法比較，可降低20%～30%的檢測(cè)成本），容易實(shí)現(xiàn)大通量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)［16］，可作為一種主要或輔助方法應(yīng)用于食源性致病菌監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。因?yàn)榇蟛糠謱?dǎo)致食源性疾病的致病菌為未知微生物，用傳統(tǒng)方法很難實(shí)現(xiàn)全面的監(jiān)測(cè)，而MALDI-TOF MS常應(yīng)用于一些用傳統(tǒng)方法難鑒定或者鑒定周期長(zhǎng)的微生物的快速鑒定［17-18］，這一點(diǎn)的意義重大。此法也可用于細(xì)菌的全細(xì)胞分析，即不需要經(jīng)過(guò)溶劑處理，純菌落或菌液可直接點(diǎn)樣，這樣可明顯提高檢測(cè)效率，有文獻(xiàn)報(bào)道了其應(yīng)用于多種臨床菌株的全細(xì)胞分析［19］。因此，嘗試不同樣品前處理方式，進(jìn)一步簡(jiǎn)化處理步驟，還有數(shù)據(jù)庫(kù)的完善及補(bǔ)充都是今后研究的重點(diǎn)。另外，雖然MALDITOF MS可實(shí)現(xiàn)菌株的快速鑒定，但其要求必須得到純菌落或者純菌液，依然依賴于基礎(chǔ)增菌及分離培養(yǎng)階段（一般需要1～3 d），所以此法結(jié)合快速?gòu)?fù)合增菌的研究有助于檢測(cè)效率的進(jìn)一步提高。

表5　MALDI-TOF MS法和16S rRNA基因測(cè)序法分析100株細(xì)菌的結(jié)果比較Table 5　The results of the MALDI-TOF MS method and 16S rRNA gene sequence analysis for 100 strains

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Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for the identification and detection of foodborne pathogens

ZHOU Qian-yu1，ZHANG Yan-guo1，HUANG Cheng-cai2，XIE Jing-li1，GAO Qing-zhen1，LIU Su1，*
（1.Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Supervision and Testing Center for Vegetable Quality，Ministry of Agriculture，Beijing 100081，China；2.Shimadzu（China）Co.，Ltd.，Analytical Instruments Dept，Beijing 100020，China）

A method based on matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry（MALDI-TOF MS）was developed for rapid discrimination of 5 species of foodborne pathogens which isolated from fresh vegetables.Standard strains were used in the study to investigate factors affecting the identification results，such as the selection of matrix solution，cultivation conditions，solvent treatment method，and the sample deposition method.After determined the optimal protocol，the stability and repeatability of the method were evaluated.Then bacteria strains separated from fresh vegetables were identified by this protocol.The 16S rRNA gene sequence analysis for 93 wild strains and 7 standard strains was used as a reference to evaluate the credibility of MALDI-TOF MS method.The MALDI-TOF MS method showed good stability with appropriate detection limit（106～109cfu/mL）for rapid detection of those strains and high consistency with the 16S rRNA gene sequence analysis（83%consistency at the species level and 94%consistency at the genus level）.It was showed that MALDI-TOF MS could be used as an accurate，quick，cost-effective and high throughput method in the identification of foodborne pathogens.

MALDI-TOF MS；foodborne pathogens；detection；identification

TS207.4

A

1002-0306（2015）18-0059-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.003

2014－12－05

周千渝（1991-），女，在讀碩士研究生，研究方向：食品加工與安全，E-mail：qyzhou1991@163.com。

劉肅（1955-），男，碩士，研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和安全檢測(cè)技術(shù)，E-mail：liusu@mail.caas.net.cn。

2014年國(guó)家蔬菜產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目（GJFP2014001）。