三物白散對(duì)Survivin-RNA基因沉默轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞的影響*

王燚霈朱瑩

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410005）

·研究報(bào)告·

三物白散對(duì)Survivin-RNA基因沉默轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞的影響*

王燚霈朱瑩△

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410005）

目的觀察中藥三物白散對(duì)含存活素（Survivin）基因沉默的慢病毒顆粒（Survivin-RNAi-LV）轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細(xì)胞的影響。方法分別采用RT-PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）、Western blot方法檢測(cè)人胃癌SGC-7901細(xì)胞中Survivin mRNA和蛋白的表達(dá)；采用甲基噻唑基四唑（MTT）方法檢測(cè)胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖情況、流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率及三物白散對(duì)其增殖抑制率及凋亡率的影響。結(jié)果重組慢病毒顆粒介導(dǎo)的Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細(xì)胞可有效使Survivin mRNA和蛋白的表達(dá)沉默；三物白散對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞組應(yīng)用三物白散，其細(xì)胞增殖弱于、細(xì)胞凋亡率高于三物白散+空白對(duì)照組和三物白散+陰性對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論含Survivin基因沉默的重組慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細(xì)胞，能夠抑制SGC-7901細(xì)胞Survivin的表達(dá)，三物白散對(duì)Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞的殺傷力較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞有明顯的提高。

三物白散Survivin基因沉默胃癌SGC-7901細(xì)胞影響

本課題組前期采用三物白散加減治療進(jìn)展期胃癌能明顯改善患者癥狀［1］，但仍不能達(dá)到滿意的療效，如何提高中藥的療效，成了亟需我們深入研究的課題?；虺聊钦{(diào)節(jié)真核生物細(xì)胞基因表達(dá)的一種重要方法，采用基因沉默來(lái)抑制信號(hào)通路的異常表達(dá)而治療惡性腫瘤被越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)可［2-3］。多項(xiàng)研究［4-6］發(fā)現(xiàn)基因沉默的方法可有效提高化療藥物對(duì)癌細(xì)胞的殺傷力，增強(qiáng)藥物敏感性，而能否增加中藥敏感性的報(bào)道鮮見。因此，本實(shí)驗(yàn)采用含Survivin基因沉默的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細(xì)胞，再加不同濃度的三物白散進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，初步探討三物白散對(duì)Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株及慢病毒人胃癌細(xì)胞SGC-7901購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院腫瘤研究所。含Survivin基因沉默的慢病毒顆粒由上海Genechem公司重組構(gòu)建。

1.2藥物三物白散：巴豆、浙貝母、桔梗，藥材由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院門診中藥房提供，粉碎并充分混勻，調(diào)成0.005 g/mL藥物混懸液，含10%油的巴豆霜、貝母、桔梗比例為1∶3∶3，滅菌后4℃封存于玻璃安瓿。

1.3試劑DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清購(gòu)自于杭州四季青公司。Trizol試劑、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）試劑盒、Western Blot試劑檢測(cè)盒（上海生工生物工程有限公司）。兔抗人一抗Survivin抗體、羊抗兔二抗IgG抗體分別購(gòu)自于Santa Cruz Biotechnology美國(guó)公司、美國(guó)Abcam公司。甲基噻唑基四唑（MTT試劑）、二甲基亞砜（DMSO）分別購(gòu)自美國(guó)Sigma公司、長(zhǎng)沙凱諾生物科技有限公司；Annexin-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒（上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司）。

1.4實(shí)驗(yàn)方法1）細(xì)胞培養(yǎng)。人胃癌SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)傳代。2）慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細(xì)胞。選取生長(zhǎng)良好的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌SGC-7901細(xì)胞，每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于備好的6孔板中，用DMEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清，無(wú)抗生素），繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，當(dāng)貼壁60%左右時(shí)，將SGC-7901細(xì)胞分為3組：空白對(duì)照組（DMEM培養(yǎng)基）、陰性對(duì)照LV-RNAi組（空載體慢病毒顆粒2.5× 109TU/mL）、Survivin-RNAi-LV組（含Survivin基因沉默的重組慢病毒顆粒2.5×109TU/mL），接著進(jìn)行轉(zhuǎn)染，參照轉(zhuǎn)染手冊(cè)，7.0 μL/孔。轉(zhuǎn)染6 h后將濃度為10% DMEM培養(yǎng)基更換為20%，24 h后，繼續(xù)常規(guī)更換培養(yǎng)液，待6孔板被細(xì)胞長(zhǎng)滿后，胰酶消化，進(jìn)行后續(xù)PCR、蛋白檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。3）RT-PCR檢測(cè)Survivin mRNA的表達(dá)。收集上述步驟3組的細(xì)胞，Trizol方法提取總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行目的基因Survivin擴(kuò)增和GAPDH內(nèi)參擴(kuò)增。Survivin上游引物：5′-GCGTGAGCGGGACGTAAT-3′。下游引物：5′-GTGCCCAGGGTACGTGATG-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為337 bp。內(nèi)參GAPDH。上游引物：5′-CTGCCCCTG GCAGCCCTTTC-3′。下游引物：5′-CTCTGGCCCAGCCTTCCA-3′，長(zhǎng)度為182 bp。反應(yīng)條件：首先94℃時(shí)預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)。取5 μL PCR產(chǎn)物，電泳檢測(cè)，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行，Quantity One軟件對(duì)凝膠成像照片進(jìn)行分析，進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，取平均值。4）Western blot檢測(cè)Survivin蛋白的表達(dá)。將2）中3組SGC-7901細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗，去PBS液，在冰上裂解細(xì)胞，提取80～100 μg總蛋白，在10% SDS-PAGE膠上電泳，通過(guò)恒流電1.5 h轉(zhuǎn)移印跡到聚偏二氟乙烯膜（polyvinyli-dene fluoride，PVDF膜），用TBST配制成5%脫脂牛奶，加入兔抗人Survivin一抗，常溫下孵育2 h，置于羊抗兔IgGⅡ抗體（稀釋1∶2000）中，常溫下繼續(xù)孵育2 h，TBST液洗膜，重復(fù)洗膜3次，每次10 min，ECL發(fā)光液中進(jìn)行顯色曝光處理。5）MTT法檢測(cè)三物白散對(duì)Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞后抑制率的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)3組：中藥組（三物白散+空白對(duì)照組）、中藥+LV-RNAi組、中藥+ Survivin-RNAi-LV組，接種各組細(xì)胞到96孔板，每孔1×104個(gè)/100 μL，各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。3組分別加入不同濃度同體積的中藥三物白散（3.5、7.0、14.0 mg/mL）200 μL/孔。48 h后，每孔加入MTT試劑約20 μL，濃度5 mg/mL，繼續(xù)恒溫孵箱孵育4 h，棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜（DMSO），每孔加150 μL，低速震蕩10 min。全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)490 nm處每孔吸光值（A值）。抑制率以（1-A實(shí)驗(yàn)孔均值/A對(duì)照組均值）×100%表示。計(jì)算3個(gè)復(fù)孔的平均值。6）流式細(xì)胞儀檢測(cè)三物白散對(duì)Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染后胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡率的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)3組：中藥組（三物白散+空白對(duì)照組）、中藥+LV-RNAi組、中藥+Survivin-RNAi-LV組，接種到6孔板，每孔接種5×104個(gè)/200 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每組分別加入不同濃度同體積的中藥三物白散（3.5、7.0、14.0 mg/mL）200 μL/孔。37℃培養(yǎng)48 h，胰酶消化各組細(xì)胞，收集于EP管中，PBS液洗滌3次，然后離心，收集棄上清后的細(xì)胞，采用Annexin VFITC/PI法檢測(cè)三物白散處理后胃癌細(xì)胞凋亡率。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以（±s）表示。兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用方差分析。多組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Survivin基因沉默Survivin mRNA表達(dá)的檢測(cè)見圖1。與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比，Survivin-RNAi-LV組條帶明顯變窄，Survivin-RNAi-LV組、陰性對(duì)照空載體慢病毒顆粒組和空白對(duì)照組Survivin mRNA的表達(dá)量分別為（0.15±0.04）、（1.02±0.09）、（1.08±0.14），Survivin-RNAi-LV組mRNA的表達(dá)量分別為陰性對(duì)照LV-RNAi組和空白對(duì)照組的14.71%和13.89%，干擾效率分別為85.29%和86.11%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而陰性對(duì)照LV-RNAi組和空白對(duì)照組的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)含Survivin基因沉默重組慢病毒轉(zhuǎn)染SGC-7901能有效降低內(nèi)源性Survivin mRNA的表達(dá)。

2.2慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)見圖2。Western blot檢測(cè)慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)，與空白對(duì)照組（培養(yǎng)基）、陰性對(duì)照LV-RNAi組（空載體慢病毒顆粒2.5×109TU/mL）相比，Survivin-RNAi-LV組蛋白條帶減弱，Survivin-RNAi-LV組Survivin蛋白的表達(dá)量（0.21±0.08）低于空白對(duì)照組（0.69±0.06）和陰性對(duì)照LV-RNAi組（0.71±0.04），Survivin-RNAi-LV組Survivin蛋白表達(dá)量下降了69.57%和70.42%，陰性對(duì)照LV-RNAi組和空白對(duì)照組的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)含Survivin基因重組慢病毒轉(zhuǎn)染SGC-7901能有效降低內(nèi)源性Survivin蛋白的表達(dá)。

圖1　Survivin基因沉默Survivin mRNA表達(dá)的檢測(cè)

圖2　慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細(xì)胞Survivin蛋白的表達(dá)

2.3MTT比色法檢測(cè)Survivin基因沉默后對(duì)三物白散敏感度的影響見表1。MTT法檢測(cè)Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞后用三物白散處理，觀察各組細(xì)胞的抑制率，觀察發(fā)現(xiàn)，中藥+Survivin-RNAi-LV組能明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖，抑制率明顯高于中藥組和中藥+LV-RNAi組，且隨著三物白散濃度的不同抑制率逐漸升高，提示Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染后能增強(qiáng)對(duì)三物白散的敏感性，且與藥物濃度呈正相關(guān)性，而中藥組和中藥+LV-RNAi組兩組的細(xì)胞抑制率無(wú)明顯差異。

表1　MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后三物白散對(duì)細(xì)胞的抑制率（%，±s）

表1　MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后三物白散對(duì)細(xì)胞的抑制率（%，±s）

與中藥組、中藥+LV-RNAi組比較，*P＜0.05。下同。

藥物濃度（mg/mL）n中藥+Survivin-RNAi-LV組中藥組中藥+LV-RNAi組3.5350.46±3.14*7.0378.52±2.67*29.18±3.5930.95±2.07 41.36±3.4843.07±3.05 14.0389.31±4.35*48.53±4.2349.72±3.89

2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡見圖3，表2。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，慢病毒介導(dǎo)的Survivin基因沉默組的細(xì)胞凋亡率明顯高于單用中藥未轉(zhuǎn)染組和空載體轉(zhuǎn)染組，且隨著三物白散濃度的增高，其凋亡率亦升高，表明三物白散對(duì)Survivin基因沉默后胃癌細(xì)胞的凋亡具有明顯的促進(jìn)作用。

圖3　各組細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果

表2　流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率（%，±s）

表2　流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率（%，±s）

藥物濃度（mg/mL）n中藥+Survivin-RNAi-LV組中藥組中藥+LV-RNAi組3.5314.7±1.2*7.0320.1±2.6*2.3±0.92.5±0.4 4.7±0.64.6±0.8 14.0327.9±1.7*7.2±1.17.4±0.5

3　討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，胃癌歸屬于“胃脘痛”“噎嗝”“癥瘕”“積聚”等范疇，病因病機(jī)主要有氣滯、食積、痰瘀、毒聚、正虛等方面。中醫(yī)在治療該病方面有上千年的歷史，中藥已被肯定具有較好的治療效果且毒副作用較小，中醫(yī)辨證診治有利于提高患者的生存質(zhì)量和延長(zhǎng)患者的生命［11］。經(jīng)方三物白散是出自張仲景的《傷寒論·太陽(yáng)病脈證并治》篇的方劑，由貝母、巴豆和桔梗含為一方，方中貝母化痰散結(jié)，《本草正義》言“象貝母蓄寒泄降，而能散結(jié)”。巴豆性熱味辛并有毒，《神農(nóng)本草經(jīng)》謂其“破癮瘕結(jié)聚堅(jiān)積，留飲痰癖，大腹水腫。蕩練五臟六腑，開通閉塞，利水谷道。去惡肉”。桔梗開肺提氣，既可祛痰散結(jié)開肺，又可行藥力于上，現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為其有增強(qiáng)人體抵抗力的作用；三藥共用，共達(dá)溫下逐瘀、散寒除實(shí)、滌痰破結(jié)之功。前期我們使用經(jīng)方三物白散加味治療胃癌收到了較好的療效［3］，且初步進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)三物白散治療胃癌的機(jī)制與Survivin基因有關(guān)［12-13］。

Survivin是凋亡抑制蛋白（IPA）家族中最受重視的新成員，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)大的凋亡抑制因子，對(duì)細(xì)胞存活至關(guān)重要，故又成為生存素、存活素。在正常細(xì)胞內(nèi)，Survivin的表達(dá)受到嚴(yán)格的控制，而在胃腸癌、肺癌、乳腺癌等癌細(xì)胞中，Survivin呈高表達(dá)［14］。已有多項(xiàng)研究檢測(cè)胃癌組織中Survivin基因的表達(dá)，以探討Survivin基因表達(dá)與胃癌的相關(guān)性。Da等［15］采用免疫組化方法分別檢測(cè)正常胃黏膜、腸化生黏膜、不典型增生胃黏膜、胃癌組織中YAP蛋白和Survivin基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Survivin基因在胃癌組織中表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性。

近幾年來(lái)隨著科技的發(fā)展，RNA干擾（RNAi）技術(shù)、基因沉默抗癌癥的研究也不斷地增加。RNAi技術(shù)對(duì)于特定基因的表達(dá)，可以特異性地剔除或關(guān)閉。慢病毒（Lentivirus）載體技術(shù)，無(wú)論細(xì)胞是否處于分裂期，均可將外源基因或外源的shRNA有效地轉(zhuǎn)染到宿主染色體上，從而達(dá)到持久穩(wěn)定的沉默效應(yīng)，具有高特異性、高效性、高穩(wěn)定性和低毒性、無(wú)病毒蛋白表達(dá)［16］的優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)了基因組學(xué)的發(fā)展。

本研究采用通過(guò)Survivin-RNAi-LV轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細(xì)胞，分為實(shí)驗(yàn)組（含Survivin基因沉默的慢病毒顆粒組）、陰性對(duì)照組（空載體轉(zhuǎn)染組）、空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染組）3組，檢測(cè)到Survivin mRNA和Survivin蛋白在Survivin-RNAi-LV組細(xì)胞中的表達(dá)水平較另2組明顯下降，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照LVRNAi組中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明重組慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以有效沉默Survivin，證實(shí)含Survivin基因沉默的重組慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建成功。構(gòu)建轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后進(jìn)行了后續(xù)三物白散對(duì)轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響實(shí)驗(yàn)，分為中藥組、中藥+LVRNAi組、中藥+Survivin-RNAi-LV組6組，發(fā)現(xiàn)中藥+ Survivin-RNAi-LV組三物白散對(duì)細(xì)胞的殺傷作用高于中藥+LV-RNAi組和中藥組，且隨著藥物濃度的增高，其殺傷作用亦增強(qiáng)。

綜上所述，含Survivin基因沉默慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染人胃癌SGC-7901細(xì)胞，可以降低Survivin基因和蛋白的表達(dá)，再以不同濃度的三物白散處理，癌細(xì)胞增殖抑制率及凋亡率與藥物濃度呈正比；提示三物白散對(duì)于Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷力，而對(duì)于普通胃癌細(xì)胞的殺傷力較弱；提示我們可通過(guò)基因沉默的方法來(lái)增強(qiáng)中藥對(duì)于腫瘤的治療作用，但其具體作用機(jī)制尚不明確，需要課題組進(jìn)一步研究。

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The Effect of Sanwubai Powder on Gastric SGC-7901 Cells Transfected by Survivin-RNA gene Silencing

WANG Yipei，ZHU Ying.
The Second Affiliated Hospital of Hunan University of TCM，Hunan，Changsha 410005，China

Objective：To observe the effect of Sanwubai Powder on human gastric cancer SGC-7901 cells containing survivin（Survivin）gene silencing transfected by Lentiviral Particles（Survivin-RNAi-LV）.Methods：The methods of RT-PCR and Western blot were used to detecte the expression of survivin gene mRNA and survivin protein.The method of MTT was used to detect the proliferation of SGC-7901 cells，and the flow cytometry was uesed to test the apoptosis rate and the effects of Sanwubai powder on proliferation inhibition rate and apoptosis rate.Results：Recombinant lentiviral particle-mediated Survivin gene silencing transfecting human gastric cancer SGC-7901 cells could effectively silence the expression of Survivin mRNA and protein.Sanwubai Powder could inhibit the growth and induce apoptosis of human gastric cancer SGC-7901 cells.The cell proliferation in Survivin gene silencing transfecting into gastric cancer SGC-7901 cells group using Sanwubai Powder was weaker than Sanwubai Powder+blank control group and San Wu Bai San+negative control group（P＜0.05），while apoptosis rate was higher than.Conclusion：Recombinant Lentiviral Particles transfecting human gastric cancer SGC-7901 cells，containing Survivin gene silencing，can inhibit the expression of Survivin mRNA and protein in SGC-7901 cells.The lethality of Sanwubai Powder on gastric cancer cells in the group of Survivin gene silencing transfection has more significantly improved than that in the non-transfected cells.

Sanwubai Powder；Survivin gene silencing；Gastric cancer；SGC-7901 cell；Effect

R730.59

A

1004-745X（2015）10-1758-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.10.022

2015-04-15）

湖南中醫(yī)藥大學(xué)青年基金資助項(xiàng)目

（電子郵箱：zhuying089@126.com）