胰泰復(fù)方對(duì)慢性胰腺炎胰腺纖維化大鼠Bcl-x和p53表達(dá)的影響*

王科軍高麗娟張淼劉華生△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040）

·研究報(bào)告·

胰泰復(fù)方對(duì)慢性胰腺炎胰腺纖維化大鼠Bcl-x和p53表達(dá)的影響*

王科軍1高麗娟2張淼1劉華生1△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040）

目的觀察胰泰復(fù)方對(duì)慢性胰腺炎胰腺纖維化大鼠Bcl-x和p53表達(dá)的影響。方法將大鼠分成4組，空白組、模型組、中藥對(duì)照組、中藥治療組?？瞻捉M腹腔注射0.9%氯化鈉注射液；其余各組腹腔注射L-精氨酸，制備慢性胰腺炎大鼠模型。造模成功，各組實(shí)行相應(yīng)治療2個(gè)月。治療結(jié)束后，采用免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠胰腺組織的Bcl-x和p53蛋白表達(dá)。結(jié)果模型組、中藥對(duì)照組和中藥治療組中的Bcl-x蛋白表達(dá)水平顯著低于空白組；中藥治療組中的Bcl-x蛋白表達(dá)水平高于中藥對(duì)照組和模型組；模型組、中藥對(duì)照組和中藥治療組中的p53蛋白表達(dá)水平顯著高于空白組；中藥治療組中的p53蛋白表達(dá)水平低于中藥對(duì)照組和模型組（均P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論胰泰復(fù)方可以減緩慢性胰腺炎胰腺纖維化進(jìn)程，其分子機(jī)制可能與Bcl-x蛋白表達(dá)上調(diào)及p53蛋白表達(dá)下調(diào)相關(guān)。

慢性胰腺炎胰腺纖維化胰泰復(fù)方Bcl-xp53

隨著現(xiàn)代人生活飲食方式的轉(zhuǎn)變，慢性胰腺炎（CP）的發(fā)病有呈逐年升高的趨勢(shì)，但尚未有明確的流行病學(xué)資料。CP是各種致病因素導(dǎo)致胰腺組織及其功能不可逆轉(zhuǎn)改變的一種慢性炎癥性疾病［1］，胰腺實(shí)質(zhì)的纖維化表現(xiàn)是其主要的病理學(xué)特征［2］。細(xì)胞凋亡與組織纖維化的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，很多學(xué)者研究亦集中于此。如曹勤等［3］研究發(fā)現(xiàn)甘草酸可能通過下調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因p53蛋白表達(dá)水平而發(fā)揮其抗肝纖維化的作用。本課題組長期從事胰腺纖維化的研究，亦得出CP胰腺纖維化與細(xì)胞凋亡具有相關(guān)性［4］。基于此，筆者欲通過檢測胰泰復(fù)方對(duì)慢性胰腺炎胰腺纖維化大鼠Bcl-x和p53表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討胰腺纖維化與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及胰泰復(fù)方抑制胰腺纖維化的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量（250±20）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供給。

1.2藥劑與儀器胰泰復(fù)方由柴胡、白術(shù)、人參、紅花、桃仁、當(dāng)歸等組成，于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院購買；清胰利膽顆粒是由吉林省長春銀諾克藥業(yè)有限公司生產(chǎn)制造，于哈爾濱哈恒瑞新特藥店購買；L-精氨酸來源于天津博迪化工有限公司；Bcl-x免疫組化染色試劑盒來源于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；p53免疫組化染色試劑盒來源于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。主要儀器有：日本生產(chǎn)的Olympus B×60研究用顯微鏡、德國生產(chǎn)的Thermo HM 340E石蠟切片機(jī)、中國廈門麥克奧迪提供的Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)。

1.3模型制備應(yīng)用0.9%氯化鈉注射液配置成13.3%的L-精氨酸溶液，模型組、中藥對(duì)照組及中藥治療組實(shí)行左下腹腔注射13.3%L-精氨酸，制備CP大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｃ看谓o藥時(shí)，分2次實(shí)行左下腹腔注射，時(shí)間間隔為1 h，每次所需L-精氨酸的量按照大鼠每100 g質(zhì)量需用藥0.2 g進(jìn)行計(jì)算。L-精氨酸給藥總計(jì)3次，時(shí)間間隔為3 d，共10 d完成?？瞻捉M應(yīng)用0.9%氯化鈉注射液實(shí)行左腹腔注射，用量、次數(shù)及方法與前相同。

1.4分組與方法40只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、中藥對(duì)照組及中藥治療組，共4組，每組各包含10只。造模成功后，于第11日，各組開始行相應(yīng)藥物灌胃治療，中藥治療組應(yīng)用胰泰復(fù)方水煎劑治療，依照11.25 g/kg標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行灌胃，中藥對(duì)照組給予清胰利膽顆粒沖劑，依照2.7 g/kg標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行灌胃（以上計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用正常成人與大鼠給藥劑量系數(shù)折算得出），模型組、空白組給予相應(yīng)量的0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行灌胃。以上治療，每日1次，持續(xù)給藥2個(gè)月。

1.5標(biāo)本采集與檢測灌胃治療結(jié)束后，處死各組實(shí)驗(yàn)大鼠，行開腹解剖，摘取其相同部位的胰腺組織后，立即浸入10%中性甲醛緩沖液中固定24 h以上。先用梯度酒精脫水、二甲苯透明，然后進(jìn)行石蠟包埋，切片厚度約為3 μm，最后施行免疫組化檢測。Bcl-x和p53蛋白表達(dá)檢測，應(yīng)用即用型一步法免疫組化測定法，Bcl-x和p53試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，依照說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。首先將組織切片脫蠟并水化。然后依據(jù)Bcl-x或p53一抗的需要，應(yīng)用pH為6.0的抗原修復(fù)液對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處置。隨后用3%H2O2去離子水孵育切片，持續(xù)15 min，用以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗，滴加Bcl-x或p53一抗，4℃孵育留宿；PBS浸洗，滴加IgG抗體-Fab段-HRP多聚體，37℃孵育30 min，PBS每次沖洗3 min，共5次；使用DAB溶液染色，鏡下控制染色結(jié)果。最后依次進(jìn)行蒸餾水沖洗、蘇木素復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、樹脂封片。將切片置在200倍顯微境下觀察并拍攝照片，采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)各組切片進(jìn)行分析，得到各組切片的陽性目標(biāo)面密度，以此來判定Bcl-x和p53蛋白表達(dá)結(jié)果。Bcl-x表達(dá)為細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，p53表達(dá)為細(xì)胞核，各組切片中陽性表達(dá)為棕黃色沉積。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以（±s）表示，運(yùn)用單因素方差分析的方法對(duì)多樣本均數(shù)進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

各組大鼠胰腺組織Bcl-x與P53表達(dá)水平比較見表1和圖1，圖2。模型組、中藥對(duì)照組和中藥治療組中的Bcl-x蛋白表達(dá)水平顯著低于空白組（P＜0.01）；中藥治療組中的Bcl-x蛋白表達(dá)水平高于中藥對(duì)照組（P＜0.05），且顯著高于模型組（P＜0.01）；模型組、中藥對(duì)照組和中藥治療組中的p53蛋白表達(dá)水平顯著高于空白組（P＜0.01）；中藥治療組中的p53蛋白表達(dá)水平低于中藥對(duì)照組（P＜0.05），且顯著低于模型組（P＜0.01）。

表1　各組大鼠BCL-x和p53蛋白表達(dá)結(jié)果比較（±s）

表1　各組大鼠BCL-x和p53蛋白表達(dá)結(jié)果比較（±s）

與空白組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與中藥對(duì)照組比較，#P＜0.05。

組別nBCL-xp53空白組100.07763±0.010930.00191±0.00098模型組100.01904±0.00331*0.06026±0.01795*中藥對(duì)照組100.03157±0.00576*△0.03932±0.00901*△中藥治療組100.04160±0.00273*△#0.02293±0.00904*△#

3　討論

導(dǎo)致胰腺纖維化的因素較為廣泛，其具體發(fā)病機(jī)制仍尚未明確［5］，但過多分泌的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和大量的成纖維細(xì)胞增生是其主要的病理學(xué)基礎(chǔ)。腺泡逐漸萎縮丟失被纖維增生所替代是CP腺纖維化的前提。胰腺腺泡的壞死及凋亡與與腺泡的萎縮丟失有著密切的關(guān)系，而且胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象在人或大鼠CP組織中都有發(fā)生。因此，細(xì)胞凋亡在胰腺纖維化的發(fā)展進(jìn)程中具有著重要的意義。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞本身主動(dòng)進(jìn)行死亡的生物學(xué)過程，在多種基因調(diào)控下而發(fā)生。其中Bcl-2蛋白家族和抑癌基因p53對(duì)細(xì)胞凋亡有重要的調(diào)控作用。Bcl-2基因家族主要由Bcl-2、Bcl-x及Bax等組成。Bcl-x主要由Bcl-xl和Bcl-xs兩型組成，其中以Bcl-xl的作用為主，對(duì)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（PTP）開放具有抑制的作用，從而起到抑制細(xì)胞凋亡的作用［6］。p53可分為野生型p53和突變型p53兩種類型。野生型p53對(duì)人體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化生長具有較大的調(diào)控作用，具有誘導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞凋亡的作用，而突變型p53可以誘導(dǎo)發(fā)生多種癌變。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)胰腺組織中的Bcl-x及p53蛋白表達(dá)的檢測，可推斷胰泰復(fù)方可能通過調(diào)控與細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bcl-x和p53的表達(dá)而發(fā)揮作用，對(duì)胰腺纖維化的發(fā)展進(jìn)程具有較大的調(diào)控作用，為探討研究中醫(yī)藥治療CP纖維化的機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

圖1　各組BCL-x表達(dá)（HE，×20）

圖2　各組p53表達(dá)（HE，×20）

CP典型的癥狀表現(xiàn)為發(fā)作性上腹部疼痛，后期可逐漸出現(xiàn)食欲降低、食少、納呆、便溏及消瘦。因此癥狀上來看，多與中醫(yī)學(xué)的腹痛和泄瀉等疾病相關(guān)。中醫(yī)之脾為后天之本，主運(yùn)化，是氣血產(chǎn)生的源頭；西醫(yī)之胰為消化腺，具有分泌含有豐富消化液的胰液的作用。因此，從中醫(yī)之病位上來分析，多與脾胃相關(guān)，從中醫(yī)之病機(jī)上來分析，多為虛實(shí)夾雜，以脾虛為本，氣滯血瘀為標(biāo)。因此，中醫(yī)在治療CP時(shí)，應(yīng)標(biāo)本兼治，以治療脾虛為中心，兼以疏肝行氣，活血化瘀。胰泰復(fù)方就是建立在這樣的治療原則基礎(chǔ)上而形成的，在臨床中應(yīng)用效果顯著。針對(duì)CP的中醫(yī)脾虛病機(jī)本質(zhì)，方中選用具有健脾益氣功效的人參、白術(shù)和茯苓為君藥，主要用來恢復(fù)脾的正常生理功能；針對(duì)氣滯血瘀的實(shí)性病機(jī)，選用具有疏肝活血止痛功效的柴胡、桃仁和當(dāng)歸為臣藥，以達(dá)行氣活血而止疼痛的目的；最后，使以甘草，以達(dá)補(bǔ)氣而調(diào)和諸藥的目的?？v觀全方，可知胰泰復(fù)方是由四君子湯與復(fù)元活血湯化裁而成，具有健脾益氣、行氣活血的功用。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科學(xué)分會(huì)胰腺外科學(xué)組.慢性胰腺炎診治指南（2014）［J］.臨床肝膽病雜志，2015，31（3）：322.

［2］Stevens T，Conwell DL，Zuccaro G.Pathogenesis of chronic pancreatitis：an evidence-based review of past theories and recent developments［J］.Am J Gastroenterol，2004，99（11）：2256-2270.

［3］曹勤，蔡瑜，郭曉玲，等.甘草酸對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化肝組織p53蛋白表達(dá)的影響［J］.中華消化病與影像雜志：電子版，2014，4（6）：10-13.

［4］劉華生，劉爽，周景華.胰泰復(fù)方對(duì)慢性胰腺炎胰腺纖維化大鼠凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax表達(dá)的影響［J］.中國中醫(yī)急癥，2008，17（5）：662-663.

［5］Braganza JM，Lee SH，McCloy RF，et al.Chronic pancreatitis［J］.Lancet，2011，377（9712）：1184-1197.

［6］施勤，劉繼明，張學(xué)光.細(xì)胞凋亡的線粒體調(diào)控與BCL-2基因家族［J］.上海免疫學(xué)雜志，2000，20（1）：60-61.

Effects of Yintai Compounded Medication on the Expression of Bcl-x and P53 in the Chronic Pancreatitis Rats with Pancreatic Fibrosis

WANG Kejun，GAO Lijuan，ZHANG Miao，et al.

Department of TCM diagnostics in basic medical college of Heilongjiang University of TCM，Heilongjiang，Harbin 150040，China

Objective：To research the effects of Yintai Compounded Medication on the expression of Bcl-x and P53 in the chronic pancreatitis rats with pancreatic fibrosis and discuss its mechanism of the effects.Methods：40 SD rats were divided into 4 groups：the normal group，the model group（treated with normal saline），Chinese Medicine control group（treated with Qingyilidan Granula）and Chinese Medicine treatment group（treated with Yintai Compounded Medication）.The normal group received celiac injection of normal saline，while the other groups were treated with celiac injection of 13.3%L-arginine for establishing chronic pancreatitis rat models.And then the four groups were given corresponding treatment.After 2-month treatment，we used immunohistochemical method to detect the expression of Bcl-x and P53.Results：The expression levels of Bcl-x in the model group，Chinese Medicine control group and Chinese Medicine treatment group were significantly lower than that of the normal group（P＜0.01）；the expression level of Bcl-x in Chinese Medicine treatment group was higher than that of Chinese Medicine control group（P＜0.05），and significantly higher than that of the model group（P＜0.01）.The expression levels of P53 in the model group，Chinese Medicine control group and Chinese Medicine treatment group were significantly higher than that of the normal group（P＜0.01）；the expression level of P53 in Chinese Medicine treatment group was lower than that of Chinese Medicine control group（P＜0.05），and significantly lower than that of the model group（P＜0.01）.Conclusion：Yintai Compounded Medication can slow down the process of pancreatic fibrosis，which is possibly related with the up-regulation of Bcl-x and the down-regulation of P53.

Chronic pancreatitis；Pancreatic fibrosis；Yintai Compounded Medication；Bcl-x；P53

R285.5

A

1004-745X（2015）10-1705-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.10.005

2015-06-21）

黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（D2005-37）；教育部“春暉計(jì)劃”合作科研資助項(xiàng)目（404S809）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)?？蒲谢鹳Y助項(xiàng)目（2014bs08）

（電子郵箱：741835240@qq.com）