p38 MAPK/p53信號通路調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞中Etheràgo-go表達(dá)的研究

吳進(jìn)劉慶軍陳志達(dá)曾文容吳欣宇林斌

作者單位：363000　漳州　廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院1骨科，2神經(jīng)內(nèi)科

基礎(chǔ)研究

p38 MAPK/p53信號通路調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞中Etheràgo-go表達(dá)的研究

吳進(jìn)1劉慶軍1陳志達(dá)1曾文容1吳欣宇2林斌1

作者單位：363000漳州廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院1骨科，2神經(jīng)內(nèi)科

目的 檢測Etheràgo-go（Eag）在人骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)并探索其調(diào)控的分子機(jī)制。方法 采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）和免疫印跡技術(shù)（Western blot，WB）檢測骨肉瘤細(xì)胞MG-63中Eag的表達(dá)。體外實驗檢測Eag抑制劑對MG-63細(xì)胞增殖的影響，體內(nèi)實驗檢測Eag短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）對裸鼠骨肉瘤生長的影響。最后用WB檢測骨肉瘤細(xì)胞中促有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和p53蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果 Eag在MG-63細(xì)胞中高表達(dá)，Eag shRNA或抑制劑丙咪嗪（Imipramine）能從體內(nèi)外有效地抑制人骨肉瘤細(xì)胞增殖。p38 MAPK抑制劑SB203580或小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）可抑制MG-63細(xì)胞的增殖，同時誘導(dǎo)p53的表達(dá)。p53激活劑nutlin-3可抑制MG-63細(xì)胞增殖并下調(diào)Eag的表達(dá)，而p53抑制劑pifithrin-alpha（PFT-α）則能促進(jìn)MG-63細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)Eag的表達(dá)。結(jié)論Eag作為癌基因參與了骨肉瘤細(xì)胞增殖過程，其可能受p38MAPK/p53信號通路的調(diào)控。

骨腫瘤；Etheràgo-go通道；細(xì)胞增殖；MAPK信號通路；p53基因；調(diào)控；表達(dá)

骨肉瘤是青少年最常見的惡性骨腫瘤，其惡性程度高，容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響青少年的生命健康［1］。即使采用外科手術(shù)并聯(lián)合新輔助化療的標(biāo)準(zhǔn)方案治療，無肺部轉(zhuǎn)移患者的5年生存率僅為65%，如發(fā)生肺轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后更差［2，3］。因此深入研究與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展和治療相關(guān)的分子機(jī)制，成為目前研究骨肉瘤較為關(guān)注的疑難問題，也是如何延長骨肉瘤患者生存時間的關(guān)鍵。

Etheràgo-go（Eag）及其編碼的Eag通道是第一個被證明與腫瘤密切相關(guān)的鉀離子通道［4］。近年來，Eag已成為腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)并不斷有新進(jìn)展［4，5］。但其在骨肉瘤中的作用及機(jī)制尚未明確。本研究首先通過PT-PCR和WB法檢測Eag在人骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)，之后通過腺病毒感染抑制Eag的表達(dá)并在體外水平驗證其在調(diào)控MG-63細(xì)胞增殖中的作用，并初步闡明其調(diào)控機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1細(xì)胞人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63、人成骨細(xì)胞瘤細(xì)胞株hFOB 1.19、人黑色素瘤細(xì)胞株MDA-MB435S和人胚腎細(xì)胞株HEK293均購自美國ATCC公司。

1.1.2主要試劑DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)板、丙咪嗪、二甲基亞砜（DMSO）、JNK MAPK通道阻滯劑CEP11004購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒購自美國Dojindo公司；p38 MAPK通道阻滯劑SB203580購自德國Darmstadt公司；ERK1/2 MAPK通道抑制劑PD98059、p53通道激活劑nutlin-3、p53通道抑制劑PFT-α、辣根過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔IgG抗體和Eag siRNA購自美國SantaCruz公司；p38MAPK siRNA、JNK MAPK siRNA、ERK1/2MAPK siRNA和controlsiRNA購自美國Cell Signaling Technology公司；Eag單克隆抗體購自以色列Alomone公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色試劑盒購自美國Millipore公司；細(xì)胞裂解液購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司。

1.2實驗方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染MG-63、MDA-MB435S和HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素），hFOB 1.19細(xì)胞培養(yǎng)于F12/DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100mg/L鏈霉素），均置于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)及傳代。轉(zhuǎn)染前1 d，取處于對數(shù)生長期的MG-63細(xì)胞（1×105個/ml）接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)80%時，使用筆者等［6］之前構(gòu)建的腺病毒表達(dá)載體Ad5-Eag-shRNA和Ad5-Control-shRNA進(jìn)行細(xì)胞感染，8 h后換液，繼續(xù)孵育48 h。

1.2.2蛋白印跡技術(shù)收集（5～6）×107個對數(shù)生長期細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解緩沖液（10mmol/LEDTA、10mmol/L Tris-HCl、150mmol/LNaCl、0.4%SDS、pH 7.4）裂解細(xì)胞，搖晃充分混勻細(xì)胞。然后移入離心管，在4℃離心半徑8 cm下15 000 r/min離心約10min，吸取上清液，用二鋅可酸（bicinchonininc acid，BCA）法測定蛋白濃度后置于-80℃冰箱保存。上樣前把樣品置于沸水浴中5～8 min，然后在100V電流下進(jìn)行12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）2 h分離蛋白，用電轉(zhuǎn)膜儀30伏濕法轉(zhuǎn)膜過夜（轉(zhuǎn)膜前用硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡30min）。用含10%脫脂奶粉的磷酸鹽吐溫緩沖液鹽水（phosphate buffered saline tween，PBST）室溫封閉1.5 h，棄去封閉液，然后在室溫下分別用Eag、β-actin、p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-p38 MAPK、p38 MAPK和p53抗體孵育，置于4℃冰箱過夜；用PBS洗滌3次，每次10 min，加入相對應(yīng)的二抗室溫孵育1.5 h，1∶1 000稀釋；用PBS洗滌3次，每次10 min；采用ECL顯色法檢測，內(nèi)參為β-actin，用凝膠成像分析軟件分析條帶凈灰度，用各組目的蛋白的灰度值除以β-actin的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果為目的蛋白的相對含量，表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.2.3RT-PCR用 Trizol法提取各組細(xì)胞的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟制備cDNA，引物序列如下：Eag上游引物為5′-GCTTTTGAGAACGTGGATGAG-3′，下游引物為5′-CGAAGATGGTGGCATAGAGAA-3′，475 bp，56℃；β-actin上游引物為5′-TCCACCTTCCAGCAGATGTG-3′，下游引物為5′-GCATTTGCGGTGGACGAT-3′，75 bp，54℃。反應(yīng)體系：0.5μlcDNA，7.5μl超純水，上下游引物各1.0μl，SYBR Green 10.0μl，共計20μl。反應(yīng)條件：⑴預(yù)變性：94℃，4min；⑵變性：94℃，45 s；⑶退火：54℃，45 s；⑷延伸：72℃，45s，循環(huán)30次。

1.2.4CCK-8法將1×105個細(xì)胞置于96孔板中，每孔設(shè)置3個副孔。無血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h后分別處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。10ml CCK-8溶液加入每孔中孵育1 h，選擇450 nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值。

1.2.5建立裸鼠骨肉瘤異種移植模型選用6～8周無胸腺的BALB/c雌性裸鼠作為實驗對象，嚴(yán)格按照實驗動物倫理規(guī)定進(jìn)行實驗操作。根據(jù)筆者之前的方法［6］，通過皮下注射l50μl（1.5×106個/ml）MG-63細(xì)胞懸液在裸鼠右側(cè)后腿誘導(dǎo)腫瘤，1周后可長出肉眼可見的腫瘤。之后將裸鼠分為3組（每組6只），實驗組：接受瘤內(nèi)注射Ad5-Eag-shRNA（10 MOI），2 d/次，共6次；陰性對照組：接受瘤內(nèi)注射Ad5-ControlshRNA（10 MOI），2 d/次，共6次；空白對照組：接受瘤內(nèi)生理鹽水注射（10m l），2 d/次，共6次。每2 d測量腫瘤體積，收集結(jié)果，繪制生長曲線圖。體積計算的參考公式：1/2×L×W2，L為腫瘤長度，W為腫瘤寬度。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗或單因素方差分析（ANOVA）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Eag在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)

RT-PCR檢測結(jié)果示：Eag在MG-63細(xì)胞中與陽性對照組MDA-MB435S細(xì)胞中均為高表達(dá)，且明顯高于陰性對照組hFOB 1.19細(xì)胞（圖1A）。WB檢測進(jìn)一步證實了Eag在骨肉瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)（圖1B）。

2.2Eag沉默對骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響

圖2A顯示：Ad5-Eag-shRNA可有效抑制MG-63細(xì)胞中Eag的表達(dá)。與空白對照組相比，Ad5-Eag-shRNA［（48.55±3.07）%，圖2B］和丙咪嗪［（56.17±3.22）%，圖2C］均可明顯抑制MG-63細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001）。

2.3Eag沉默對裸鼠骨肉瘤生長的影響

圖3顯示：從第10天起，實驗組裸鼠骨肉瘤體積小于空白對照組和陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）。與空白對照組和陰性對照組相比，實驗組可有效地抑制裸鼠骨肉瘤的生長。

圖1　Eag在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 Eag沉默對MG-63細(xì)胞增殖的影響

圖3　Eag沉默對裸鼠骨肉瘤生長的影響

2.4p38MAPK通路的活化促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖

WB法檢測結(jié)果示：MG-63細(xì)胞中總p38 MAPK和磷酸化p38MAPK的表達(dá)水平明顯高于其在hFOB 1.19細(xì)胞中的表達(dá)水平。而總JNK MAPK、ERK1/2 MAPK和磷酸化JNK MAPK、ERK1/2 MAPK在兩株細(xì)胞中表達(dá)無明顯異常（圖4A）。CCK-8法實驗顯示：與空白對照組相比，p38 MAPK抑制劑SB203580和p38 MAPK siRNA均可明顯抑制MG-63細(xì)胞增殖，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001）。而JNK MAPK抑制劑CEP11004、JNK MAPK siRNA、ERK1/2 MAPK抑制劑PD98059和ERK1/2 MAPK siRNA對MG-63細(xì)胞增殖均無明顯影響（圖4B和圖4C）。

圖4 MG-63細(xì)胞中p38MAPK信號通路激活并促細(xì)胞增殖

2.5p38 MAPK/p53信號通路調(diào)控MG-63細(xì)胞中Eag通道的表達(dá)

WB法檢測結(jié)果示：p38 MAPK抑制劑SB203580和p38 MAPK siRNA可分別誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞中p53的表達(dá)并抑制Eag的表達(dá)（圖5A）。p53激活劑nutlin-3可抑制MG-63細(xì)胞增殖（圖5B）并下調(diào)Eag的表達(dá)（5C），而p53抑制劑PFT-α則能促進(jìn)MG-63細(xì)胞增殖（圖5D）并誘導(dǎo)Eag的表達(dá)（圖5E），促細(xì)胞增殖的效應(yīng)可被Ad5-Eag-shRNA部分抵消（圖5D）。

圖5 MG-63細(xì)胞中p38MAPK/p53信號通路調(diào)控Eag的表達(dá)

3　討論

研究表明，Eag基因在人類正常組織中只表達(dá)于腦組織、胎盤，短暫性表達(dá)于肌原細(xì)胞，異常表達(dá)于多種人類腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織［7］，Eag在正常組織和相對應(yīng)的腫瘤組織中表達(dá)的差異性使其成為研究的熱點(diǎn)。本研究的RT-PCR和WB檢測結(jié)果證實Eag在骨肉瘤與成骨細(xì)胞中存在差異性表達(dá)，為后續(xù)進(jìn)一步研究Eag與骨肉瘤的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。丙咪嗪是一種常見的抗抑郁藥物，但其特異性差，對心肌細(xì)胞上的某些離子通道有較強(qiáng)的抑制作用［8］。有研究［8］報道，包括丙咪嗪在內(nèi)的多種Eag抑制劑均可達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果。相對于丙咪嗪，siRNA具有更高的特異性，而且無明顯副作用［9］。Eag基因編碼的產(chǎn)物為Eag鉀離子通道，是一個與腫瘤密切相關(guān)的鉀離子通道，在其促進(jìn)腫瘤發(fā)生的過程中不僅僅表現(xiàn)出了離子通道的特性，當(dāng)利用特殊的藥物廢除Eag的通道電流，Eag仍能表現(xiàn)出促腫瘤發(fā)生的能力，這也是其最吸引研究人員的特性［10］。本實驗結(jié)果顯示，Eag非特異性抑制劑丙咪嗪抑制骨肉瘤增殖是通過阻斷Eag離子通道傳導(dǎo)，但Eag-siRNA在體內(nèi)外水平有效地抑制骨肉瘤增殖的機(jī)制則不依賴于Eag的離子通道特性，提示Eag基因與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

前期的研究證實Eag基因參與了多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程，但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不明確。MAPK信號通路是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能夠?qū)⒓?xì)胞外信號傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞增殖、周期、分化等諸多過程。近年來研究顯示MAPK通路參與了包括骨肉瘤在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程［11，12］。結(jié)合本研究的結(jié)果，即在骨肉瘤中異常高表達(dá)的Eag可激活p38 MAPK通路，從而實現(xiàn)促骨肉瘤細(xì)胞增殖的表型，而抑制p38 MAPK則可阻滯骨肉瘤細(xì)胞增殖，提示p38 MAPK的活化與Eag異常高表達(dá)密切相關(guān)，由此推測，位于細(xì)胞核周圍的Eag可激活MAPK信號通道從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［8］，但其具體的調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。

Lin等［13］發(fā)現(xiàn)在人類成神經(jīng)細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中，p53通過p53-miR34-E2F1信號通路負(fù)反饋調(diào)控Eag。本研究也得到了類似的結(jié)果，即p38 MAPK抑制劑SB203580或siRNA可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞中p53的表達(dá)，提示p53可能是p38 MAPK的下游因子。此外，通過p53的激活劑或抑制劑改變p53的表達(dá)水平可誘導(dǎo)Eag表達(dá)水平的變化。綜上所述，在骨肉瘤中，p38 MAPK和Eag形成了一個正反饋循環(huán)，即Eag高表達(dá)可激活p38 MAPK，抑制p53的表達(dá)，而上調(diào)p53的表達(dá)則可抑制Eag表達(dá)。

本研究證實了Eag作為癌基因參與了骨肉瘤細(xì)胞增殖過程，其可能受p38 MAPK/p53信號通路調(diào)控，抑制p38 MAPK或Eag的表達(dá)有望成為一種新的骨肉瘤治療方案。

［1］ 王顯陽，常君麗，施杞，等.骨肉瘤相關(guān)信號通路的研究進(jìn)展［J］.中國癌癥防治雜志，2015，7（1）：52-55.

［2］ Endo-Munoz L，Evdokiou A，Saunders NA.The role of osteoclasts and tumour-associated macrophages in osteosarcoma metastasis［J］. Biochim Biophys Acta，2012，1826（2）：434-442.

［3］ Luetke A，Meyers PA，Lewis I，et al.Osteosarcoma treatment-where do westand?A stateof theart review［J］.Cancer TreatRev，2014，40（4）：523-532.

［4］Pardo LA，del Camino D，Sánchez A，et al.Oncogenic potential of EAG K（+）channels［J］.EMBO J，1999，18（20）：5540-5547.

［5］ Haitin Y，Carlson AE，Zagotta WN.The structural mechanism of KCNH-channel regulation by the eag domain［J］.Nature，2013，501（7467）：444-448.

［6］ Wu J，Wu X，ZhongD，etal.Shorthairpin RNA（shRNA）Etheràgo-go1（Eag1）inhibition of human osteosarcoma angiogenesis via VEGF/ PI3K/AKT signaling［J］.Int JMol Sci，2012，13（10）：12573-12583.

［7］ Camacho J.Etheràgo-go potassium channels and cancer［J］.Cancer Lett，2006，233（1）：1-9.

［8］ Asher V，Sowter H，Shaw R，et al.Eag and HERG potassium channels as novel therapeutic targets in cancer［J］.World JSurg Oncol，2010，8：113.

［9］Weber C，Mello de Queiroz F，Downie BR，et al.Silencing the activity and proliferative properties of the human EagIPotassium Channel by RNA Interference［J］.JBiol Chem，2006，281（19）：13030-13037.

［10］Downie BR，Sánchez A，Kn?tgen H，et al.Eag1 expression interferes with hypoxia homeostasis and induces angiogenesis in tumors［J］.J Biol Chem，2008，283（52）：36234-36240.

［11］ Fang JY，Richardson BC.The MAPK signalling pathways and colorectal cancer［J］.LancetOncol，2005，6（5）：322-327.

［12］Sasaki K，Hitora T，Nakamura O，et al.The role of MAPK pathway in bone and soft tissue tumors［J］.Anticancer Res，2011，31（2）：549-553.

［13］ Lin H，Li Z，Chen C，et al.Transcriptional and post-transcriptional mechanisms for oncogenic overexpression of etherà go-go K+channel［J］.PLoSOne，2011，6（5）：e20362.

［2015-06-03收稿］［2015-07-15修回］［編輯江德吉］

The p38MAPK/p53 pathway regulatesexpression of Etheràgo-go in osteosarcoma

Wu Jin1，Liu Qingjun1，Chen Zhida1，Zeng Wenrong1，Wu Xinyu2，Lin Bin1（1Department of Orthopaedics，2Department of Neurology，The Affiliated Southeast Hospital of Xiamen University，Zhangzhou 363000，P.R.China）

Lin Bin.E-mail：linbin813@163.com

Objective To detect the expression of Etheràgo-go（Eag）in human osteosarcoma and examine possible pathways regulating Eag expression.Methods Eag expression was analyzed in the osteosarcoma cell line MG-63 using reverse transcription-polymerase chain reaction and western blotting.Effects of Eag inhibition on cell proliferation were examined in MG-63 cultures，and effects of short hairpin RNA-mediated knockdown of Eag on osteosarcoma growth were examined in an in vivo xenograft model.Activation of the mitogen-activated protein kinase（MAPK）/p53 signaling pathway in MG-63 cells was detected using Western blot analysis.Results Eag is overexpressed in MG-63 cells，and imipramine or Eag short hairpin RNA significantly inhibited MG-63 proliferation in vitro and in vivo.MG-63 proliferation was also strongly inhibited by the p38 MAPK inhibitor SB203580 or small interfering RNA（siRNA）.Using SB203580 or siRNA to inhibit p38 MAPK activation reduced levels of Eag protein but increased levels of p53 protein.Using nutlin-3 to activate p53 reduced levels of Eag protein and arrested MG-63 growth，while using pifithrin-alpha to inactivate p53 increased the levels of Eag and promoted MG-63 growth.Conclusion The Eag gene functions as an oncogene to promote the proliferation of osteosarcoma cells，and the p38 MAPK/p53 pathway regulates high Eag expression in osteosarcoma cells.

Bone neoplasm；Etheràgo-go；Cell proliferation；MAPK pathway；p53 gene；Regulation；Expression

R738.1

A

1674-5671（2015）05-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.05.03

國家自然科學(xué)基金資助項目（81402217）

林斌。E-mail：linbin813@163.com