Notch1在B細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)及臨床意義

呂杰譚亞娜邰宵輝李紅玲

作者單位：730000　蘭州　1寧夏醫(yī)科大學(xué)；2甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)；甘肅省人民醫(yī)院3腫瘤內(nèi)科，4組織與病理室

臨床經(jīng)驗(yàn)

Notch1在B細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)及臨床意義

呂杰1譚亞娜2邰宵輝3李紅玲4

作者單位：730000蘭州1寧夏醫(yī)科大學(xué)；2甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)；甘肅省人民醫(yī)院3腫瘤內(nèi)科，4組織與病理室

目的 探討Notch1在B細(xì)胞淋巴瘤組織的表達(dá)及其臨床意義。方法 采用免疫組化SP法檢測(cè)55例B細(xì)胞淋巴瘤組織（B細(xì)胞淋巴瘤組）和27例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織（對(duì)照組）中Notch1蛋白的表達(dá)情況及其特點(diǎn)。結(jié)果Notch1蛋白在B細(xì)胞淋巴瘤組和對(duì)照組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為27.27%和7.41%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Notch1蛋白的表達(dá)與患者年齡、性別、淋巴結(jié)受侵位置及臨床分期均無(wú)關(guān)（P均＞0.05）。結(jié)論Notch1在B細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)上調(diào)，其在B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用。

淋巴瘤；B細(xì)胞淋巴瘤；Notch1；表達(dá)；臨床意義

淋巴瘤是一種發(fā)病率較高的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，原發(fā)于淋巴結(jié)及其它器官的淋巴組織，可發(fā)生于身體任何部位，以實(shí)體瘤的形式生長(zhǎng)，常見(jiàn)于淋巴組織豐富的組織器官，如淋巴結(jié)、扁桃體、脾、骨髓等，其具有高度異質(zhì)性，不同病理類型其臨床表現(xiàn)、治療反應(yīng)及預(yù)后有所差異。我國(guó)T細(xì)胞淋巴瘤約占30%，而B細(xì)胞淋巴瘤則占70%左右。

Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路是由Morgan于1916年在果蠅中發(fā)現(xiàn)，因其部分突變可引起果蠅翅膀殘缺（Notch）而得名。Notch是在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)通路，廣泛存在于包括哺乳動(dòng)物在內(nèi)的多個(gè)物種之中，Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路由Notch受體、配體以及下游靶基因組成。它可通過(guò)與表達(dá)配體的相鄰細(xì)胞間的相互作用傳導(dǎo)信號(hào)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。因而Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)生異?？蓪?dǎo)致多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。Notch受體蛋白有4種（Notch1～Notch4）。目前研究多集中在Notch1受體蛋白與T細(xì)胞白血病/淋巴瘤方面。本研究通過(guò)免疫組化SP法檢測(cè)B細(xì)胞淋巴瘤Notch1蛋白的表達(dá)情況，探討其在B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用，以期為臨床治療提供新的思路。

1　資料與方法

1.1一般資料

回顧性分析2013年1月至2015年1月甘肅省人民醫(yī)院病理科檢測(cè)的55例B細(xì)胞相關(guān)淋巴瘤標(biāo)本（B細(xì)胞淋巴瘤組），其中慢性淋巴細(xì)胞白血病8例，濾泡性淋巴瘤9例，邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤4例，漿細(xì)胞瘤3例，彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤25例，Burkitt淋巴瘤1例，套細(xì)胞淋巴瘤5例；男性32例，女性23例；年齡16～70歲，中位年齡56歲，年齡≤50歲21例，＞50歲34例；另取27例淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織標(biāo)本作為對(duì)照組。

1.2主要試劑

兔抗人跨膜受體蛋白Notch1抗體、免疫組化SP檢測(cè)試劑盒、DAB染色試劑盒均購(gòu)自上海聯(lián)碩生物科技有限公司。

1.3標(biāo)本制備

所有標(biāo)本均經(jīng)4%福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片，厚度為4μm。石蠟切片脫蠟并予乙醇水化；3%H2O2溶液室溫避光孵育20min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；100ml/L正常山羊血清室溫封閉30min，棄去血清，滴加1∶100稀釋的兔抗人Notch1單克隆抗體，4℃過(guò)夜；37℃復(fù)溫1 h后滴加二抗、三抗。以上每一步實(shí)驗(yàn)用0.01mol/L PBS緩沖液振洗3次，每次5min。滴加新鮮配置的DAB顯色液，鏡下控制顯色，蘇木精復(fù)染，二甲苯透明，封片。用已知陽(yáng)性表達(dá)的標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照以PBS代替一抗。

1.4結(jié)果判定

由兩名實(shí)驗(yàn)者對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。評(píng)估時(shí)綜合考慮切片中陽(yáng)性細(xì)胞占觀察細(xì)胞數(shù)的百分比和陽(yáng)性細(xì)胞著色的強(qiáng)度。根據(jù)著色強(qiáng)度判斷陽(yáng)性表達(dá)程度：標(biāo)本無(wú)染色為0分，弱染色（淡黃色）為1分，中等染色（棕黃色）為2分，強(qiáng)染色（棕褐色）為3分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占觀察細(xì)胞數(shù)的比例計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為1分，10%～49%為2分，50%～79%為3分，≥80%為4分。用染色指數(shù)表示細(xì)胞染色強(qiáng)度，染色指數(shù)為上述兩項(xiàng)指標(biāo)的乘積，其結(jié)果分為4級(jí)：0分為（-），1～2分為（+），3～6分為（++），8～12分為（+++）［1］。本實(shí)驗(yàn)以+～+++為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理和分析。樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1樣本組織Notch1蛋白的免疫組化SP法檢測(cè)

Notch1蛋白免疫組化SP法檢測(cè)的陽(yáng)性染色主要集中在細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)，部分淋巴瘤組織的細(xì)胞核亦染色。見(jiàn)圖1。

圖1　Notch1蛋白的免疫組化SP法檢測(cè)結(jié)果（SP×200）

在B細(xì)胞淋巴瘤組中Notch1蛋白陽(yáng)性表達(dá)（+～+++）者15例，其中慢性淋巴細(xì)胞白血病6例，濾泡性淋巴瘤1例，邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤1例，漿細(xì)胞瘤1例，彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤4例，Burkitt淋巴瘤1例，套細(xì)胞淋巴瘤1例，而對(duì)照組僅有2例細(xì)胞質(zhì)輕著色。Notch1蛋白在B細(xì)胞淋巴瘤組和對(duì)照組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為27.27%（15/55）、7.41%（2/27），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.349，P=0.037）。提示Notch1蛋白在B細(xì)胞淋巴瘤組織中的表達(dá)明顯升高。見(jiàn)表1。

2.2Notch1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與B細(xì)胞淋巴瘤患者臨床病理特征的關(guān)系

在B細(xì)胞淋巴瘤中Notch1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)分別與患者不同年齡、性別、淋巴結(jié)受侵位置及臨床分期進(jìn)行比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），即Notch1蛋白在B細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)與患者年齡、性別、淋巴結(jié)受侵位置及臨床分期均無(wú)關(guān)。見(jiàn)表2。

表1　Notch1蛋白在B細(xì)胞淋巴瘤組與對(duì)照組中的免疫組化SP法檢測(cè)結(jié)果

表2　Notch1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與B細(xì)胞淋巴瘤患者臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］

3　討論

Notch是一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)通路，涉及多個(gè)分子信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，且與其他信號(hào)傳導(dǎo)通路如C-Myc通路［2］、NF-κB通路［3］等密切相關(guān)。諾貝爾獎(jiǎng)得主David Baltimore首先研究表明Notch1在急性T淋巴細(xì)胞白血?。═-ALL）的發(fā)生中可能發(fā)揮決定性作用：由點(diǎn)突變或者染色體易位t（7；9）（q34：q34.3）引起的T細(xì)胞白血病中，Notch1信號(hào)傳導(dǎo)通路均持續(xù)活化［4］。Notch1基因突變發(fā)生在近60%的T-ALL患者中［5］。在霍奇金淋巴瘤和間變大細(xì)胞淋巴瘤中也存在Notch1高表達(dá)［6，7］。而Notch在B細(xì)胞相關(guān)淋巴瘤中的研究較少，且目前研究尚存在較大爭(zhēng)議。在慢性淋巴細(xì)胞白血病患者中存在 Notch1、Notch2及其配體 Jagged1、Jagged2的持續(xù)活化，而正常B細(xì)胞卻不存在此現(xiàn)象，表明Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路參與慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的存活及抗凋亡作用［8］。慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中Notch1的突變主要發(fā)生在第34個(gè)外顯子，由兩個(gè)特定堿基缺失移碼引起過(guò)早產(chǎn)生終止密碼子并引起細(xì)胞內(nèi)區(qū)C端PEST結(jié)構(gòu)域缺失，最終導(dǎo)致Notch蛋白持續(xù)活化［9］。在套細(xì)胞淋巴瘤也證實(shí)存在與慢性淋巴細(xì)胞白血病相同的Notch系統(tǒng)激活機(jī)制［10］。濾泡性淋巴瘤中Notch突變的頻率為4%～10%，Notch突變患者以女性居多，脾臟易受累及，以低頻率的t（14；18）易位為特點(diǎn)，且易進(jìn)展為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤［11］。在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中，Tohda等［12］用DAPT、GSI-I和GSI-XII（γ-分泌酶抑制劑，抑制Notch受體蛋白的表達(dá)）抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖，說(shuō)明Notch在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

本研究通過(guò)免疫組化SP法檢測(cè)Notch1蛋白在B細(xì)胞相關(guān)淋巴瘤中的表達(dá)狀況，顯示Notch1蛋白在B細(xì)胞相關(guān)淋巴瘤中高表達(dá)，且其表達(dá)與患者年齡、性別、淋巴結(jié)受侵位置及臨床分期均無(wú)關(guān)。推測(cè)Notch1在B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用。但由于收集病例數(shù)量有限，今后還需更多的資料以進(jìn)一步深入研究。總之，Notch1受體的異常表達(dá)可能與B細(xì)胞相關(guān)淋巴瘤的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)，針對(duì)Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路研發(fā)靶向治療的藥物，以期對(duì)淋巴瘤的治療提供新的療法。

［1］ Bauer L，Takacs A，Slotta-Huspenina J，et al.Clinical significance of NOTCH1 and NOTCH2 expression in gastric carcinomas：an immunohistochemical study［J］.FrontOncol，2015，5：94.

［2］ Hoemann CD，Beaulieu N，Girard L，et al.Two distinct Notch1 mutant alleles are involved in the induction of T-cell leukemia in c-myctransgenicmice［J］.Mol Cell Biol，2000，20（11）：3831-3842.

［3］ Shin HM，Minter LM，Cho OH，et al.Notch-1 augments NF-κB activity by facilitating its nuclear retention［J］.EMBO J，2006，25（1）：129-138．

［4］ García-PeydróM，de Yébenes VG，Toribio ML.Notch1 and IL-7 receptor interplaymaintains proliferation of human thymic progenitors while suppressing non-T cell fates［J］.JImmunol，2006，177（6）：3711-3720.

［5］Breit S，Stanulla M，F(xiàn)lohr T，et al.Activating NOTCH1 mutations predict favorable early treatment response and longterm outcome in childhood precursor T-cell lymphoblastic leukemia［J］.Blood，2006，108（4）：1151-1157.

［6］Jundt F，Anagnostopoulos I，F(xiàn)rster R，et al.Activated Notch1 signaling promotes tumor cell proliferation and survival in Hodgkin and anaplastic large cell lymphoma［J］.Blood，2002，99（9）：3398-3403.

［7］ Kochert K，Ullrich K，Kreher S，et al.High-level expression of Mastermindlike 2 contributes to aberrant activation of the NOTCH signaling pathway in human lymphomas［J］.Oncogene，2011，30（15）：1831-1840.

［8］ Rosati E，Sabatini R，Rampino G，et al．Constitutively activated Notch signaling is involved in survival and apoptosis resistance of B-CLL cells［J］．Blood，2009，113（4）：856-865．

［9］ Puente XS，Pinyol M，Quesada V，et al．Whole-genome sequencing identifies recurrentmutations in chronic lymphocytic leukaemia［J］．Nature，2011，475（7354）：101-105．

［10］Chiang MY，Xu ML，Histen G，et al．Identification of a conserved negative regulatory sequence that influences the leukemogenic activity of NOTCH1［J］．Mol Cell Biol，2006，26（16）：6261-6271．

［11］Karube K，Martínez D，Royo C，et al．Recurrent mutations of NOTCH genes in follicular lymphoma identify a distinctive subset of tumours［J］．JPathol，2014，234（3）：423-430．

［12］Tohda S，Sato T，Kogoshi H，et al．Establishment of a novel B-cell lymphoma cell line with suppressed growth by gamma-secretase inhibitors［J］．Leuk Res，2006，30（11）：1385-1390．

［2015-06-15收稿］［2015-08-10修回］［編輯阮萃才］

R733.4

A

1674-5671（2015）05-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.05.09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30960438；81260342）

李紅玲。E-mail：3253389993@qq.com