Leptin、NF-κBp65在子宮頸上皮內(nèi)病變組織中的表達(dá)及意義

羅元　李辛辛　魏斐斐，3　林思彤　韋玉鸞　鄭萍，3

作者單位：530021　南寧　1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科；530022　南寧　2南寧市第一人民醫(yī)院病理科；530021南寧　3廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院；4廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科

臨床研究

Leptin、NF-κBp65在子宮頸上皮內(nèi)病變組織中的表達(dá)及意義

羅元1李辛辛2魏斐斐1，3林思彤1韋玉鸞4鄭萍1，3

作者單位：530021南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科；530022南寧2南寧市第一人民醫(yī)院病理科；530021南寧3廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院；4廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科

目的 探討瘦素（leptin）、核轉(zhuǎn)錄因子-κBp65（nuclear factorκBp65，NF-κBp65）與子宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical inraepithelialneoplasia，CIN）發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。方法 采用免疫組化染色MaxVisionTM法檢測(cè)63例慢性子宮頸炎（炎癥組）、125例CIN組織（CIN組）中Leptin和NF-κBp65的表達(dá)。結(jié)果Leptin在炎癥組中100%表達(dá)，且呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在CIN組中隨著CIN級(jí)別的升高其表達(dá)逐漸減弱；NF-κBp65在炎癥組和CIN組織中陽(yáng)性表達(dá)率均為100%，CIN組為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度隨CIN級(jí)別升高而增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Leptin和NF-κBp65的表達(dá)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.234，P＜0.05）。結(jié)論NF-κBp65的高表達(dá)對(duì)CIN的發(fā)生、發(fā)展起促進(jìn)作用。在CIN發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，可能由于細(xì)胞異常增生影響Leptin合成與分泌而致其表達(dá)下降或異常。

子宮頸腫瘤；子宮頸上皮內(nèi)瘤變；瘦素；核轉(zhuǎn)錄因子-κBp65；免疫組化

子宮頸癌是婦女最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居?jì)D女惡性腫瘤的第2位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年約有529 800例新發(fā)病例和275 100例死亡病例，其中85%發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家［1］。子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的長(zhǎng)期過(guò)程，目前對(duì)子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究已趨于深入，這對(duì)子宮頸癌的早期診斷、早期治療具有重要意義。瘦素（Leptin）是由肥胖基因（OB）編碼的一種蛋白質(zhì)產(chǎn)物，能通過(guò)多種效應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮生物學(xué)作用，目前研究認(rèn)為其與肥胖、炎癥及多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系［2］。在婦產(chǎn)科領(lǐng)域中鮮見(jiàn)對(duì)Leptin研究的文獻(xiàn)報(bào)道。核轉(zhuǎn)錄因子-κBp65（nuclear factorκBp65，NF-κBp65）是一種細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，其與腫瘤的關(guān)系備受廣大學(xué)者的關(guān)注。本研究觀察Leptin、NF-κBp65蛋白在子宮頸炎與子宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervicalinraepithelialneoplasia，CIN）中的表達(dá)情況，探討其與子宮頸上皮內(nèi)瘤變-子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1臨床資料

選取廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2008年7月至2010年7月間實(shí)施衛(wèi)生部/中國(guó)癌癥基金會(huì)子宮頸癌早診早治項(xiàng)目所采集的子宮頸病變活檢標(biāo)本87例以及病理科部分存檔蠟塊標(biāo)本101例（主要補(bǔ)充CINⅢ級(jí)/原位癌病例及CINⅡ級(jí)病例），共188例?；颊吣挲g30～59歲，中位年齡43歲。其中慢性子宮頸炎63例（炎癥組），CIN組中CINⅠ級(jí)37例、CINⅡ級(jí)47例、CINⅢ級(jí)/原位癌41例。CIN判斷標(biāo)準(zhǔn)按照衛(wèi)生部癌癥早診早治項(xiàng)目專(zhuān)家委員會(huì)/中國(guó)癌癥基金會(huì)子宮頸癌早診早治項(xiàng)目工作手冊(cè)（2008年2月）技術(shù)方案（普及版）中CIN病理診斷報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)為CINⅠ級(jí)：異型細(xì)胞累及鱗狀上皮下1/3或限于下1/2，細(xì)胞異型性大多較輕，有時(shí)可見(jiàn)HPV感染的細(xì)胞病理變化。CINⅡ級(jí)：異型細(xì)胞累及鱗狀上皮下1/2或限于下2/3，個(gè)別異型細(xì)胞可散在于鱗狀細(xì)胞上1/3，但表層上皮總體仍分化良好。CINⅢ級(jí)/原位癌：鱗狀上皮2/3以上或全層為異型細(xì)胞所代替，但上皮基底膜仍清晰完整。如全層為異型性強(qiáng)的惡性細(xì)胞時(shí)，則歸入原位癌。由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富且經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的病理專(zhuān)業(yè)醫(yī)生進(jìn)行雙盲診斷。

1.2免疫組化方法及結(jié)果判定

所有標(biāo)本均用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋并切片。采用免疫組化染色MaxVisionTM法。實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，以已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。光學(xué)顯微鏡下觀察顯色反應(yīng)。Leptin、NF-κBp65陽(yáng)性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：Leptin為細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色顆粒，NF-κBp65蛋白以細(xì)胞核呈棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。按染色強(qiáng)度評(píng)分：0分為無(wú)染色，1分為淺黃色，2分為黃色，3分為棕黃色；按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：0分為陰性，1分為陽(yáng)性細(xì)胞占10%，2分為陽(yáng)性細(xì)胞占11%～50%，3分為陽(yáng)性細(xì)胞占51%～75%，4分為陽(yáng)性細(xì)胞＞75%。每張切片分別從上下左右及中間觀察5個(gè)不連續(xù)的高倍視野（×400），取均值為該切片的積分值。陽(yáng)性程度按積分值分為＜2分為陰性（-），3～5分為弱陽(yáng)性（+），6～8分為陽(yáng)性（++），≥9分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，兩者相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Leptin與NF-κBp65在各種子宮頸病變組織中的表達(dá)

Leptin在炎癥組中100%表達(dá)，且呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（圖1A）；在CINⅠ級(jí)、CINⅡ級(jí)、CINⅢ級(jí)/原位癌中隨著CIN級(jí)別的升高其表達(dá)逐漸減弱（表1）。NF-κBp65在各組子宮頸病變中均呈不同程度的陽(yáng)性（+～+++）表達(dá)，表達(dá)率均為100%。隨著CIN級(jí)別的升高，NF-κBp65蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在CINⅢ級(jí)/原位癌組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（圖1B）。

表1　Leptin及NF-κBp65在各種子宮頸病變組織中的表達(dá)情況（n）

圖1　Leptin與NF-κBp65在子宮頸病變組織中的表達(dá)

2.2Leptin及NF-κBp65在各種子宮頸病變組織中表達(dá)的兩兩比較

Leptin蛋白的表達(dá)在炎癥組與各組CIN之間表達(dá)的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；各組CIN之間的兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。NF-κBp65蛋白的表達(dá)在炎癥組與CINⅢ級(jí)及CINⅠ級(jí)與CINⅢ級(jí)、CINⅡ級(jí)與CINⅢ級(jí)之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；在炎癥組與CINⅠ級(jí)、CINⅡ級(jí)及CINⅠ級(jí)與CINⅡ級(jí)之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2　Leptin及NF-κBp65在各種子宮頸病變組織中表達(dá)的兩兩比較結(jié)果

2.3Leptin與NF-κBp65在各種子宮頸病變組織中表達(dá)的相關(guān)性

Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，兩者在慢性子宮頸炎癥、CINⅠ級(jí)、CINⅡ級(jí)、CINⅢ級(jí)/原位癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.234，P＜0.05）。

3　討論

Leptin是肥胖基因（OB）編碼的16kD（1kD-0.9921 ku）的小分子多肽激素，主要合成于白色脂肪細(xì)胞。Leptin與其受體結(jié)合后通過(guò)JA K2/STAT3途徑與特定基因啟動(dòng)子區(qū)域的DNA元件相互作用，從而發(fā)揮生物學(xué)作用，如免疫、造血、生殖、創(chuàng)傷愈合和血管形成等［3］。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，機(jī)體在炎癥狀態(tài)下Leptin濃度升高，激活并趨化中性粒細(xì)胞，刺激單核巨噬系統(tǒng)和淋巴細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)外周血液白細(xì)胞介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumornecrosis factorα，TNF-α）等炎性因子的表達(dá)，從而參與炎性反應(yīng)［3～5］。本研究結(jié)果顯示，Leptin在慢性子宮頸炎組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)Leptin是子宮頸炎癥的重要參與因子。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究多數(shù)報(bào)道Leptin與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［2，5］，其中與子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和胃癌等腫瘤的發(fā)生有促進(jìn)關(guān)系［6］，Leptin蛋白在這些腫瘤組織中均呈不同程度的高表達(dá)，Leptin及其受體同時(shí)可引起乳腺細(xì)胞的增生和乳腺癌的發(fā)生［7］。但亦有研究發(fā)現(xiàn)，Leptin的表達(dá)在單純?cè)錾?非典型增生-子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展中呈遞減趨勢(shì)［8］。Mantovani等［9］對(duì)晚期惡性腫瘤患者血漿進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)血漿瘦素水平與癌的進(jìn)展成負(fù)相關(guān)。Petridou等［10］研究表明，在絕經(jīng)前的婦女中，瘦素水平與乳腺癌發(fā)生的危險(xiǎn)性存在負(fù)相關(guān)。Elinav等［11］首次發(fā)現(xiàn)，在肝癌小鼠模型中，外源瘦素能顯著減小腫瘤大小和提高小鼠存活率。進(jìn)一步研究表明，Leptin誘導(dǎo)的抑制作用大部分可能通過(guò)其誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞的增殖和活化介導(dǎo)。Thompson等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝癌H4IIE細(xì)胞體外培養(yǎng)模型中，Leptin通過(guò)抑制p38-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制細(xì)胞增殖。但目前對(duì)Leptin是否能促進(jìn)腫瘤形成仍存在一定爭(zhēng)議。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Leptin蛋白的表達(dá)下降可使子宮頸上皮細(xì)胞增生，支持Leptin能抑制細(xì)胞增殖的論點(diǎn)。

NF-κB是一種重要的細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，其活化與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可促進(jìn)轉(zhuǎn)移相關(guān)因子如基質(zhì)金屬蛋白酶、纖溶酶原動(dòng)物尿激酶等的表達(dá)［13］。NF-κB通常由p50和p65亞基組成，可調(diào)控多種生長(zhǎng)因子。NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路屬于受調(diào)蛋白水解酶依賴(lài)的受體信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的NF-κB通路可以阻斷細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡，由此認(rèn)為NF-κB對(duì)腫瘤的增殖起十分關(guān)鍵的作用［14］。近年研究［15～17］發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤、子宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌等腫瘤中存NF-κB異常表達(dá)及活化而促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果表明，NF-κBp65在CINⅢ級(jí)/原位癌組織中多呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；隨著子宮頸上皮內(nèi)瘤變級(jí)別的升高其N(xiāo)F-κBp65蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，提示NF-κBp65的高表達(dá)對(duì)CIN的發(fā)生、發(fā)展有促進(jìn)作用，這與上述報(bào)道結(jié)果相似。

有文獻(xiàn)報(bào)道［18］，Leptin與成纖維細(xì)胞增殖以及上皮再生密切相關(guān)，成纖維細(xì)胞及其他細(xì)胞的增殖是創(chuàng)傷修復(fù)的基礎(chǔ)，再上皮化是創(chuàng)面閉合的中心環(huán)節(jié)，主要由角質(zhì)形成、遷移完成，而Leptin具有調(diào)節(jié)角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子的作用。另有報(bào)道［19］，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB家族的Rel B以細(xì)胞特異性的方式對(duì)活化的成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌炎性分子的過(guò)程進(jìn)行負(fù)調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)NF-κBp65與Leptin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，但有關(guān)NF-κBp65與Leptin之間有無(wú)相關(guān)調(diào)控作用的機(jī)制，有待進(jìn)一步深入研究。

［1］ Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012［J］. CA Cancer JClin，2015，65（2）：87-108.

［2］ 胡斐，效小莉，濮德敏，等.瘦素及其受體在宮頸癌中的表達(dá)和意義［J］.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2006，15（3）：297-301.

［3］ Iikuni NL，Lam QL，Lu L，et al.Leptin and Inflamma tion［J］.Curr Immunol Rev，2008，4（2）：70-79.

［4］ Marron MB，Hughes DP，Edge MD，et al.Evidene for heterotypic interaction between the receptor tyrosine kinases TIE-1and TIE-2［J］.J Biol Chem，2000，275（50）：39741-39746.

［5］ Chang S，Hursting SD，Contois JH，etal.Leptin and prostate cancer［J］. Prostate，2001，46（1）：62-67.

［6］ Mix H，Widjaja A，Jandl O，et al.Expression of leptin and leptin receptor isoforms in the human stomach［J］.Gut，2000，47（4）：481-486.

［7］ Tessitore L，Vizio B，Pesola D，et al.Adipocytes expression and circulating levels of leptin increase in both gynecological and breast cancer patients［J］.Int JCancer，2004，24（6）：1529-1535.

［8］ 董嬌愛(ài)，喬杰，陳詠健，等.瘦素及瘦素受體在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)［J］.實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2004，20（1）：18-20.

［9］Mantovani G，MacciòA，Madeddu C，et al.Quantitative evaluation of oxidative stress，chronic inflammatory indices and leptin in cancer patients：correlation with stage and performance status［J］.Int JCancer，2002，98（1）：84-91.

［10］Petridou E，Papadiamantis Y，Markopoulos C，et al.Leptin and insulin growth factor Iin relation to breastcancer［J］.Cancer Causes Control，2000，11（5）：383-388.

［11］Elinav E，Abd-Elnabi A，Pappo O，et al.Suppression of hepatocellular carcinoma growth in mice via leptin，is associated with inhibition of tumorcellgrowth and naturalkillercellactivation［J］.JHepatol，2006，44（3）：529-536.

［12］Thompson KJ，Lau KN，Johnson S，etal.Leptin inhibits hepatocellular carcinoma proliferation via p38-MAPK-dependent signalling［J］.HPB（Oxford），2011，13（4）：225-233.

［13］Bharti AC，Aggarwal BB.Nuclear factor-kappa B and cancer：its role in prevention and therapy［J］.Biochem Pharmacol，2002，64（5-6）：883-888.

［14］Wang D，Richmond A.Nuclear factor-kappa B activation by the CXC chemokine melanoma growth-stimulatory activity/growth-regulated protein involves the MEKK/p38 mitogen activated protein kinase pathway［J］.JBiol Chem，2001，276（5）：3650-3659.

［15］Shin JS，Yun CH，CHumg KS，et al.Standardized ethyl acetate fraction from the roots of Brassica rapa attenuates the experimental arthritis by down regulating inflammatory responses and inhibiting NF-κB activation［J］.Food Chem Toxicol，2014，66（24）96-106.

［16］Mohapatra DK，Reddy DS，Ramaiah MJ，et al.Rugulactone derivatives act as inhibitors of NF-κB activation and modulates the transcription of NF-κB dependent genes in MDA-MB-231cells［J］. Bioorg Med Chem Lett，2014，24（5）：1389-1396.

［17］Kojima M，Morisaki T，Sasaki N，et al.Increased nuclear factor-B activation in human colorectal carcinoma and its correlation with tumor progression［J］.Anticancer Res，2004，24（2B）：675-681.

［18］鄧子輝，顏光濤，王曉輝.Leptin與創(chuàng)傷修復(fù)［J］.標(biāo)記免疫分析與臨床，2007，14（1）：54-57.

［19］郭雙平，王文亮，翟宇強(qiáng).核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的研究進(jìn)展［J］.中華病理學(xué)雜志，2000，29（5）：379-380.

［2015-04-08收稿］［2015-08-15修回］［編輯阮萃才］

Expression and clinical significance of Leptin and NF-κBp65 in cervical intraepithelial neoplasia

Luo Yuan1，Li Xinxin2，Wei Feifei1，3，Lin Sitong1，Wei Yuluan4，Zheng Ping1，3（1Department of Pathology，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China；2Department of Pathology，The First People′s Hospital of Nanning，Nanning 530022，P.R.China；3Graduate School of Guangxi Medical University；4Department of Gynecology and Oncology，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

Li Xinxin.E-mail：7965257@qq.com

Objective To explore the expression of Leptin and NF-κBp65 in cervical intraepithelial neoplasia and its clinical significance.M ethods Expression of Leptin and NF-κBp65 was analyzed immunohistochemically in 63 patients with chronic cervicitis and 125 patients with cervical intraepithelial neoplasia.Results Leptin expression was detected in 100%of samples from patients with chronic cervicitis，and staining intensity was strong.NF-κBp65 was detected in 100%of samples from both groups of patients.NF-κBp65 staining intensity was significantly higher in cervical intraepithelial neoplasia than in chronic cervicitis，and intensity increased with severity of neoplasia.Leptin and NF-κBp65 expression correlated negatively in both sets of patients. Conclusion High expression of NF-κBp65 promotes the development of cervical intraepithelial neoplasia.As this disease develops，Leptin expression decreases and becomes abnormal.

Cervical neoplasm；Cervical intraepithelial neoplasia；Leptin；NF-κBp65；Immunohistochemistry

R737.33

A

1674-5671（2015）05-04

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.05.04

廣西衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目（重200870）

李辛辛。E-mail：7965257@qq.com