腺病毒介導(dǎo)的p16基因表達(dá)對體外細(xì)胞增殖和衰老的影響

吳紅平　孫娟娟　李林芳　錢其軍

作者單位：200438　上?！〉诙娽t(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院病毒及基因治療實(shí)驗(yàn)室

基礎(chǔ)研究

腺病毒介導(dǎo)的p16基因表達(dá)對體外細(xì)胞增殖和衰老的影響

吳紅平孫娟娟李林芳錢其軍

作者單位：200438上海第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院病毒及基因治療實(shí)驗(yàn)室

目的探討p16基因表達(dá)對正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增殖和衰老的影響。方法 采用腺病毒載體構(gòu)建并包裝過表達(dá)p16基因的腺病毒，分別感染原代小鼠成纖維細(xì)胞（MEF）和肝癌SMMC-7721細(xì)胞，用CCK8法檢測細(xì)胞增殖，SA-β-gal染色檢測細(xì)胞衰老。結(jié)果 成功構(gòu)建腺病毒介導(dǎo)的p16基因表達(dá)系統(tǒng)，并在MEF和SMMC-7721細(xì)胞中高效表達(dá)。CCK8法檢測p16基因表達(dá)對MEF細(xì)胞增殖的抑制率在第1～4天分別為（6.8±0.25）%、（10.6±0.68）%、（12.4±0.93）%和（45.7±1.13）%（P＜0.01）；但對SMMC-7721細(xì)胞增殖抑制不明顯；SA-β-gal染色顯示p16基因可明顯誘導(dǎo)MEF細(xì)胞衰老［（15±5）個/視野］，但不能誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞發(fā)生衰老（0個/視野）。結(jié)論單獨(dú)p16基因表達(dá)在體外不足以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的衰老和生長阻滯。

腫瘤；p16基因；衰老；增殖；腺病毒

細(xì)胞衰老是指正常細(xì)胞經(jīng)過有限的次數(shù)分裂后停止生長，細(xì)胞形態(tài)和生理代謝活動發(fā)生顯著改變的現(xiàn)象［1，2］。細(xì)胞衰老在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中非常重要，在早期是抑制腫瘤的發(fā)生［3］，但當(dāng)細(xì)胞衰老引起衰老相關(guān)分泌表型（senescence associated secretary phenotype， SASP）時又可促進(jìn)腫瘤發(fā)生［4～7］。p16基因是一種抑癌基因，在細(xì)胞周期的G1期起重要調(diào)控作用。研究表明，p16基因是細(xì)胞衰老的關(guān)鍵效應(yīng)物，是遺傳控制程序中的主要環(huán)節(jié)，它通過p16-cyclinD/CDK-RB途徑調(diào)控細(xì)胞周期，影響細(xì)胞壽命和端粒長度［8］。盡管p16基因表達(dá)被認(rèn)為是衰老的必要因素，但其表達(dá)在體外是否可直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老仍不清楚。本研究通過檢測攜帶p16基因的腺病毒對肝癌細(xì)胞衰老的誘導(dǎo)作用，以明確其在肝癌基因治療中的應(yīng)用前景。

1　材料和方法

1.1材料

PDC315腺病毒載體購自Microbix Biosystems INC。增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescentprotein，PDC315-EGFP）、PPE3載體為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。大腸桿菌DH5α、MEF細(xì)胞、SMMC-7721細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。293細(xì)胞購自加拿大MICROBIX BIOSYSTEMS公司。細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自北京碧云天公司。CCK8試劑盒購自同仁化工公司。所有內(nèi)切酶購自NEB公司。DNA連接酶Solution I、KOD PLUSNEO（KOD-401）購自TOYOBO公司。2×Taq PCR MasterMix（KT201）購自北京天根生化科技有限公司。胎牛血清、DMEM購自GIBCO BRL公司。膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA制備試劑盒、病毒DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司。LipofectAmine2000試劑盒購自GIBCO BRL公司。

1.2方法

1.2.1人源p16序列的克隆與測序（GenBank：JQ694043.1）。在p16前加入c-Myc標(biāo)簽，根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物，上游引物W173：CTCATCTCAGAAGAGGATCTGGAGCCGGCGGCGGGGAGCAG，上游引物W174：CCGGAATTCGCCACCATGGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG（含有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物W 175：ACGCGTCGACTTATCAATCGGGGATGTCTGAGGGACCTTC（含有 SalⅠ酶切位點(diǎn)）。以PDC659-p16（捷瑞公司合成）為模板，用引物W 173+ W 175擴(kuò)增p16（PCR1），然后再以PCR1為模板，用引物W174+W175進(jìn)行擴(kuò)增（PCR2）。擴(kuò)增p16引入Myc標(biāo)簽。擴(kuò)增條件如下：94℃變性2min，98℃變性10 s，56℃退火30 s，68℃延伸30 s，28個循環(huán)，68℃延伸5min。將PCR2產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖電泳分離后做膠回收，將回收產(chǎn)物用EcoR I與SalⅠ雙酶切后克隆入PDC315腺病毒載體以構(gòu)建PDC315-p16Myc，經(jīng)酶切鑒定正確后送測序公司測序。

1.2.2p16載體的構(gòu)建和鑒定PCR2產(chǎn)物和PDC315

載體均用EcoR I、Sal I雙酶切，電泳后分別回收載體和片段，連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑克隆后經(jīng)EcoRⅠ+SalⅠ、BglⅠ+KpnⅠ、SacⅡ酶切鑒定PDC315-p16Myc是否構(gòu)建成功。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)MEF細(xì)胞用DMEM、10%胎牛血清在37℃下培養(yǎng)，常規(guī)傳代。SMMC-7721細(xì)胞用1640、10%胎牛血清在37℃下培養(yǎng)，常規(guī)傳代。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.2.4腺病毒包裝轉(zhuǎn)染前1 d將293細(xì)胞按1×105個細(xì)胞/孔接種于6孔板中，待293細(xì)胞匯合率達(dá)到約80%時，根據(jù)說明書將質(zhì)粒PDC315-p16Myc、PPE3和Lipofectamine 2000混合，共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后9～14 d出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過三次病毒空斑純化，應(yīng)用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取腺病毒DNA，應(yīng)用2×Taq PCR MasterMix進(jìn)行PCR鑒定。其PCR擴(kuò)增條件為94℃3 min，94℃30 s，56℃30 s，72℃60 s共33個循環(huán)，72℃5min。經(jīng)鑒定正確的腺病毒命名為腺病毒（adenovirus，Ad）-p16，即攜帶Myc標(biāo)簽的p16基因的5型非增殖型腺病毒。

1.2.5腺病毒感染腺病毒綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，Ad-GFP）或Ad-p16感染SMMC-7721（感染復(fù)數(shù)MOI：10）和MEF（MOI：100）細(xì)胞48 h，以熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)情況。細(xì)胞采用IP裂解液裂解后泡SDS-PAGE（10%）電泳，通過Western blot法檢測攜帶Myc標(biāo)簽的p16基因表達(dá)情況。

1.2.6CCK8試劑盒檢測細(xì)胞增殖檢測步驟：每孔加入100μl約2 000個細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別給予不同的腺病毒感染細(xì)胞，在不同時間點(diǎn)（d0、d1、d2、d3、d4）每孔加入10μl CCK8檢測液，使CCK8檢測液與細(xì)胞培養(yǎng)液的體積比為1∶10。采用相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK8檢測液在沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對照；細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，注意保證每個檢測時間點(diǎn)的孵育時間相同，在450 nm處測定吸光度。

1.2.7SA-β-gal染色上述細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，感染相應(yīng)腺病毒后，采用細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒在96 h時吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次，加入1mlβ-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15min。吸除細(xì)胞固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次3 min。吸除PBS，每孔加入1 ml染色工作液，37℃孵育過夜，用保鮮膜封住6孔板防止蒸發(fā)，普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1腺病毒介導(dǎo)的p16基因表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)采用腺病毒PDC315載體分別構(gòu)建和包裝GFP基因和p16基因（攜帶Myc標(biāo)簽）的腺病毒。體外感染MEF細(xì)胞和肝癌SMMC-7721細(xì)胞后在熒光顯微鏡下觀察，當(dāng)感染復(fù)數(shù)（MOI）分別為100和10時，絕大多數(shù)MEF細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞均表達(dá)GFP。采用同樣感染復(fù)數(shù)的p16腺病毒感染上述兩種細(xì)胞，經(jīng)Western blot法檢測可見p16基因高水平表達(dá)。見圖1、圖2。

圖1　腺病毒介導(dǎo)的GFP基因在SMMC-7721細(xì)胞和MEF細(xì)胞中的表達(dá)（×200）

圖2　腺病毒介導(dǎo)的p16基因在SMMC-7721細(xì)胞和MEF細(xì)胞中的表達(dá)

2.2腺病毒介導(dǎo)的p16基因表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響腺病毒介導(dǎo)的GFP和p16表達(dá)后，采用CCK8法檢測MEF和SMMC-7721細(xì)胞增殖的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SMMC-7721細(xì)胞感染 Ad-blank、Ad-GFP和Ad-p16后三組細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。p16表達(dá)顯著抑制MEF細(xì)胞增殖，Ad-p16組與Ad-blank組比較5個檢測時間點(diǎn)（d0、d1、d2、d3、d4）的抑制率分別為（0.1±0.03）%、（6.8±0.25）%、（10.6±0.68）%、（12.4±0.93）%和（45.7±1.13）%，經(jīng)配對t檢驗(yàn)，兩組細(xì)胞增殖明顯差異（P=0.007），Ad-blank組和Ad-GFP組比較增殖率無明顯差異，（P=0.351）。見圖3。

圖3 腺病毒介導(dǎo)的p16基因表達(dá)對SMMC-7721細(xì)胞和MEF細(xì)胞增殖的影響

2.3腺病毒介導(dǎo)的p16基因表達(dá)對細(xì)胞衰老的影響

SMMC-7721細(xì)胞和MEF細(xì)胞分別感染Ad-GFP和Ad-p16腺病毒并培養(yǎng)96 h后，SA-β-gal染色顯示SMMC-7721細(xì)胞感染Ad-GFP和Ad-p16腺病毒后沒有觀察到細(xì)胞衰老。MEF細(xì)胞感染Ad-GFP和Adp16腺病毒后，Ad-GFP孔未觀察到典型的細(xì)胞衰老（0個/視野），而Ad-p16孔中可見廣泛的細(xì)胞衰老［（15±5）個/視野］。見圖4。

圖4　腺病毒介導(dǎo)的p16基因表達(dá)96 h后對SMMC-7721細(xì)胞和MEF細(xì)胞衰老的影響（×200）

3　討論

p16基因又稱為MTS（multiple tumor suppressor 1）基因，是一種細(xì)胞周期調(diào)控基因，可抑制細(xì)胞增殖及分裂，在人類50%腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有雜合或純合子缺失或突變。有研究者將p16基因比作細(xì)胞周期中的剎車裝置，其一旦失靈則會引起細(xì)胞惡性增殖，導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生［9］。p16基因已在肺癌、乳腺癌、腦腫瘤、骨腫瘤、皮膚癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌、淋巴瘤和黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)純合子缺失以及無義、錯義及移碼型突變，表明p16基因以缺失、突變方式廣泛參與腫瘤形成，檢測p16基因有無改變對判斷腫瘤的易感性以及預(yù)測腫瘤的預(yù)后具有十分重要的臨床意義［10］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞衰老時，p16基因表達(dá)明顯升高；當(dāng)年輕細(xì)胞導(dǎo)入p16基因后可出現(xiàn)衰老表型。因此p16基因也被認(rèn)為是細(xì)胞衰老的關(guān)鍵分子標(biāo)志［1，11］。

Ad為雙鏈DNA病毒，它能感染各時相的細(xì)胞，以其高效轉(zhuǎn)染和高效表達(dá)而成為應(yīng)用廣泛的病毒載體。與其他載體相比，腺病毒感染的靶細(xì)胞種類多，既可感染分裂期細(xì)胞，又可感染非分裂期細(xì)胞，還可感染增殖靜止期細(xì)胞，故在轉(zhuǎn)染原代（腫瘤）靶細(xì)胞及體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染上有很大優(yōu)勢；腺病毒基因組較少發(fā)生重排，不整合到宿主染色體中，不會引起插入突變，外源基因能游離地表達(dá)，因此潛在的致癌危險度較??；腺病毒載體具有容量大、感染性強(qiáng)、導(dǎo)入效率高，可經(jīng)不同途徑進(jìn)入不同組織；體外穩(wěn)定性好，滴度高易于制備和純化等諸多優(yōu)點(diǎn)［12］。

研究表明，p16基因在肝癌中的表達(dá)顯著下調(diào)，其主要機(jī)制可能與p16基因啟動子區(qū)域的高度甲基化密切相關(guān)［13］?；趐16基因在衰老和抑制細(xì)胞增殖的重要作用，本實(shí)驗(yàn)采用腺病毒介導(dǎo)p16基因表達(dá)，觀察其對正常小鼠MEF細(xì)胞和肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長和衰老的影響。研究結(jié)果顯示，腺病毒可介導(dǎo)p16基因在上述兩種細(xì)胞中高水平表達(dá)，但與對照病毒比較，p16基因表達(dá)僅顯著抑制正常小鼠的MEF細(xì)胞而不能顯著抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖和衰老。其原因可能與細(xì)胞的正常生長依賴于細(xì)胞周期中各種調(diào)節(jié)因子的平衡調(diào)控有關(guān)。參與細(xì)胞周期調(diào)控的主要因子有細(xì)胞周期蛋白（cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）和CDK抑制蛋白（cyclin dependent kinase inhibitors，CDKIs）。CDKI分為兩大類：一類為Ink4，包括p16、p15、p18和p19；另一類為Cip/kip，包括p21cip1、p27kip1、p57 kip2等。上述細(xì)胞周期主要調(diào)控物質(zhì)彼此之間關(guān)系，并形成一個以CDK為中心的細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，以保障各個細(xì)胞周期事件的啟動、完成、忠實(shí)性及其按序進(jìn)行［8，14］。由此可見，p16基因與許多CDKIs協(xié)同調(diào)控細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)，由于腫瘤細(xì)胞發(fā)生了顯著的細(xì)胞周期調(diào)控異常，單獨(dú)的p16基因表達(dá)可能不足以阻斷腫瘤細(xì)胞周期阻滯。另一方面，p16、p21和p19等細(xì)胞周期抑制分子在細(xì)胞中可經(jīng)REGγ依賴的蛋白酶體非泛素途徑快速降解［15］。此外，p16基因啟動子甲基化也是抑制其表達(dá)的重要因素［16］。本研究腺病毒介導(dǎo)的p16基因表達(dá)與GFP比較，其豐度較低，提示外源的p16分子被快速降解，因而達(dá)不到抑制細(xì)胞周期的表達(dá)水平。今后在本研究基礎(chǔ)上，我們擬構(gòu)建可抵抗降解的p16基因，進(jìn)一步驗(yàn)證腺病毒介導(dǎo)的p16基因?qū)Ω伟┘?xì)胞衰老誘導(dǎo)作用，明確其在肝癌基因治療中的有效性和可行性。

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［2015-04-01收稿］［2015-09-21修回］［編輯江德吉］

Im pact of adenovirus-mediated p16 expression on cell proliferation and senescence in vitro

Wu Hongping，Sun Juanjuan，Li Linfang，Qian Qijun（Molecular Virology Laboratory，Shanghai Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200438，P.R.China）

Qian Qijun.E-mail：qianqj@163.com

Objective To investigate the influence of exogenous p16 expression on cell proliferation and senescence in normal and tumor cells.M ethod Genes encoding p16 and GFP were subcloned into an adenovirus vector，then recombinant adenovirus was produced in 293 cells and purified for subsequent infection into MEF and SMMC7721 cells.Cell proliferation was examined by CCK8 assay and senescence by SA-β-gal staining.Results The number of senescent MEF cells was much higher in cultures after infection with adenovirus expressing p16 than after infection with control adenovirus（15±5 vs 0 senescent cells/field），and p16-expressing cultures showed significantly lower proliferation on days 1-4［（6.8±0.25）%，（10.6±0.68）%，（12.4±0.93）% and（45.7±1.13）%；P＜0.01］.In contrast，no significant differences in proliferation or senescence were observed between control SMMC-7721 cultures or cultures expressing p16.Conclusion Expression of p16 alone is insufficient to induce cell growth arrest and senescence in tumor cells.

Neoplasm；p16 gene；Senescence；Proliferation；Adenovirus

R730.2

A

1674-5671（2015）05-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.05.02

國家科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目（2013ZX10002010-007）

錢其軍。E-mail：qianqj@163.com