抗壞血酸對暗誘導(dǎo)擬南芥葉片衰老的影響

李　媚， 陳曉鋒， 彭長連

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510631)

抗壞血酸對暗誘導(dǎo)擬南芥葉片衰老的影響

李媚， 陳曉鋒， 彭長連*

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510631)

分析黑暗誘導(dǎo)衰老條件下3種內(nèi)源抗壞血酸含量不同的擬南芥(GLDH基因超表達植株gldh236OE、哥倫比亞野生型Col和擬南芥抗壞血酸缺乏突變體vtc2-1)表型、抗壞血酸含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)等生理指標的變化，研究抗壞血酸對暗誘導(dǎo)擬南芥葉片衰老的影響.結(jié)果表明，黑暗脅迫后3種擬南芥抗壞血酸含量均呈下降趨勢，與Col相比，vtc2-1的抗壞血酸含量顯著降低(P<0.05)，葉片黃化速度明顯較快；gldh236OE葉片黃化速度較慢；黑暗均引起了PSII最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)和PSII實際光化學(xué)量子產(chǎn)量(Yield)降低，PSII的光合效率受到阻礙；也減少了vtc2-1非光化學(xué)猝滅(NPQ)，外施抗壞血酸對植株熱耗散能力顯著增強(P<0.05).研究表明，內(nèi)源抗壞血酸含量的缺失會導(dǎo)致植株對黑暗脅迫的適應(yīng)性降低，外施1 mmol/L抗壞血酸能部分緩解植物的黑暗脅迫.

擬南芥； 抗壞血酸； 黑暗處理； 葉綠素?zé)晒鈪?shù)； 抗逆性

植物衰老是指一個器官或整個植物生命功能逐漸衰退的過程，植物衰老的普遍特征：葉綠素、蛋白質(zhì)迅速喪失及RNA水解等稱為“衰老綜合征”，并認為衰老是由內(nèi)部因素控制的導(dǎo)致死亡的衰退過程.已有報道提出衰老原因的假說，其中生物自由基傷害學(xué)說受到較多關(guān)注[1].植物在正常代謝過程中會產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)，在細胞中活性氧的產(chǎn)生及清除處于動態(tài)平衡，當(dāng)植物在衰老或受到外界環(huán)境脅迫過程中產(chǎn)生并積累過量的活性氧[2].

抗壞血酸(ascorbicacid, AsA)也稱維生素C，是植物細胞中大量存在的有機小分子，在活性氧清除系統(tǒng)中起著重要作用，參與抗氧化、光保護、調(diào)節(jié)生長發(fā)育、衰老調(diào)控以及脅迫響應(yīng)等多種生理調(diào)控過程[3-6].在合成抗壞血酸主要途徑L-半乳糖途徑[7]中，L-半乳糖-1，4-內(nèi)酯脫氫酶(L-galactono-1,4-lactonedehydrogenase, GLDH)是調(diào)節(jié)最后一步的關(guān)鍵酶[8]，定位于植物細胞線粒體內(nèi)膜上[9]，相對分子量約為56×103[8]，專一地以細胞色素C(Cytc)作為酶促反應(yīng)的電子受體，催化還原Cytc并直接氧化L-半乳糖內(nèi)酯(Gal)生成AsA[10].VTC2基因位于擬南芥的4號染色體[11]，與VTC5基因編碼GDP-L-半乳糖磷酸酶(GGPase),是L-半乳糖途徑的第六步的關(guān)鍵酶[12-13]，催化GDP-L-半乳糖轉(zhuǎn)化成L-半乳糖-1-磷酸[14].有研究報道指出VTC2與GLDH基因控制植物體內(nèi)AsA的含量，在植物生長與發(fā)育以及抗逆性等方面起重要作用[15-16].

光照是影響植物衰老的一個重要外源因素，黑暗脅迫被認為是最有效、最簡便的誘導(dǎo)衰老的信號，用于研究葉片衰老的機制[17-18].當(dāng)植株在黑暗下生長時，葉綠素加速降解伴隨著光合功能被破壞的現(xiàn)象被稱為黑暗誘導(dǎo)衰老.Weaver等[19]指出擬南芥成熟連體葉片被整株置于黑暗環(huán)境下時不能引發(fā)衰老，但黑暗脅迫會誘導(dǎo)離體葉片的衰老.當(dāng)整株擬南芥置于黑暗環(huán)境中，成熟連體葉片的衰老不是被誘發(fā)而是部分被抑制，但是當(dāng)單個葉片處于黑暗而植株其余部分處于光照環(huán)境時，黑暗條件極大地加速了葉片的衰老[17].一般而言，抗壞血酸與植物的抗逆性呈正相關(guān)，即植物細胞內(nèi)的抗壞血酸的含量增加，植物耐炎熱、寒冷和鹽堿環(huán)境等逆境的能力也會增強[20]. 如果植物體內(nèi)AsA缺失往往會誘發(fā)氧化脅迫,進而觸發(fā)細胞提前衰老[21-22]，而外施AsA能夠延緩細胞衰老[23].為了解抗壞血酸對擬南芥葉片衰老的生理生化變化，本文采用黑暗誘導(dǎo)的方法研究葉片衰老過程中抗壞血酸含量、表型以及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化，為認識擬南芥抵御外界環(huán)境脅迫提供理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1植物材料

所用植物材料擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)為哥倫比亞野生型(Col)；gldh突變體株系SALK_008236(經(jīng)鑒定為GLDH基因超表達植株)，購于美國擬南芥突變體種子庫(http://www.arabidopsis.org/)，本文用gldh236OE表達；抗壞血酸合成缺失植株vtc2-1，由Patricia Müller-Moulé教授實驗室(Developmental and Molecular Plant Biology, Heinrich-Heine-University, Düsseldorf, Germany)贈予.

擬南芥種子置于4 ℃冰箱春化2～3 d；經(jīng)10%次氯酸鈉消毒10 min、70%乙醇表面消毒30 s、無菌水沖洗4～5次后，均勻播種于MS培養(yǎng)基上.10～12 d后移至土壤中, 在光周期為16 h光/8 h暗，培養(yǎng)溫度為22±2 ℃，光照強度為70～80 μmol/(m2·s)條件下培養(yǎng)，2～3 d澆水1次；將苗齡4周的幼苗轉(zhuǎn)移至完全黑暗條件下(其它生長條件不變)培養(yǎng).

1.2抗壞血酸含量測定

參照Gillespie等[24]的方法并改進，取擬南芥新鮮蓮座葉的成熟葉片約0.05 g，用2 mL預(yù)冷的6%三氯乙酸充分研磨、震蕩混勻后置于冰上.待所有樣品研磨完畢，4 ℃、13 000 r/min離心5 min.取上清液加入2 mL反應(yīng)體系中，37 ℃水浴1 h，用分光分光計檢測525 nm的吸光值.

1.3葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

參照柯展鴻等[25]的方法并改進,葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm和Yield和NPQ均由便攜式熒光測定儀(PAM—2100，Germany)測定和計算得出.測定前先將植株暗適應(yīng)30 min，測定初始熒光Fo和暗下最大熒光Fm.經(jīng)光活化后，測定光下最大熒光F′m和穩(wěn)態(tài)熒光Fs，光化光強度為80 μmol/(m2·s).最大原初光化學(xué)量子效率Fv/Fm、實際光化學(xué)效率Yield和非光化學(xué)淬滅NPQ的計算公式如下：

Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm，Yield=l-Fs/Fm，NPQ=(Fm-F′m)/F′m.

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010進行整理，用SPSS 12.0 One Way ANOVA 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，求出平均值及標準誤，對同一測定指標在不同處理間的差異進行方差分析，并用LSD法檢驗各處理與對照組的差異顯著性，獲得的數(shù)據(jù)利用SigmaPlot12.0進行繪圖.統(tǒng)計分析采用T檢驗.

2　結(jié)果與分析

2.1黑暗條件下不同GLDH基因型植株AsA含量與表型的變化

經(jīng)黑暗處理的不同GLDH基因型5周齡幼苗總抗壞血酸含量變化趨勢相同(圖1).黑暗處理3 d，Col、gldh236OE和vtc2-1的總抗壞血酸含量分別為處理前的54%、53%和29%，顯著降低(P<0.01)，其中vtc2-1降幅最明顯；黑暗處理10 d，總AsA達到最大值.與Col相比，除了處理前，vtc2-1無顯著差異；gldh236OE的總抗壞血酸含量一直處于同時期的最大值.

Col、gldh236OE和vtc2-1植株在黑暗處理7 d后開始衰老(圖2).與對照Col相比，抗壞血酸缺失突變體vtc2-1在黑暗處理后黃化較嚴重且出現(xiàn)卷曲，甚至枯死的表征，而抗壞血酸超表達突變體gldh236OE受損較輕微，從水處理組分析，葉片黃化速度vtc2-1>Col>gldh236OE；同時期同基因型外源施加1 mol/L AsA處理，擬南芥黃化速度沒有顯著緩解，所有植株在黑暗處理15 d時完全死亡.

2.2黑暗條件下不同GLDH基因型植株光合作用的變化

圖3顯示了黑暗脅迫處理條件下，抗壞血酸含量不同的擬南芥幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、Yield、NPQ的變化.其中葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm代表PSII光化學(xué)反應(yīng)的最大量子產(chǎn)率，反映PSII反應(yīng)中心捕獲激發(fā)能的最大量子效率與利用能力，是植物PSII受害程度的重要指標[26].PSII實際光化學(xué)量子產(chǎn)量Yield，能反映PSII對吸收光能的利用情況和光合電子傳遞鏈的電子傳遞的真實速率，能更好地反應(yīng)PSII的功能[27].黑暗處理后，不同基因型植株的葉片F(xiàn)v/Fm與Yield均呈下降趨勢，說明幼苗葉片的PSII均受到損傷，隨著脅迫時間延長損傷加??；三者間無顯著性差異，外施抗壞血酸組與對照組差異不顯著. 非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ反映的是PSII天線色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散掉的光能部分.當(dāng)PSII反應(yīng)中心天線色素吸收了過量的光能時，如不能及時地耗散將對光合機構(gòu)造成損傷，所以非光化學(xué)淬滅是光合機構(gòu)的一種保護機制[28].圖3E表示，抗壞血酸外施組的不同基因型幼苗的NPQ呈先上升后下降的趨勢.黑暗處理3 d，3種基因型幼苗NPQ均增加；黑暗處理3 d之后，NPQ均不同程度下降；黑暗處理10 d，gldh236OE的NPQ有部分回升；不同基因型幼苗無顯著性差異.圖3F表示，對照組的Col與gldh236OE的NPQ呈先上升后下降的趨勢，而vtc2-1則呈相反的趨勢.黑暗脅迫處理3 d后，抗壞血酸外施組Col與vtc2-1的NPQ分別是對照組的123.64%、138.68%，顯著高于對照組(P<0.05).

圖1暗誘導(dǎo)衰老條件下Col、gldh236OE和vtc2-1植株總抗壞血酸含量變化(平均值±標準誤，n=4)

Figure 1Changes of total AsA contents in leaves of 5-week-oldCol,gldh236OEandvtc2-1 plants under dark-induced senescence condition (Mean±SE,n=4)

圖2　抗壞血酸含量對暗誘導(dǎo)衰老條件下植株表型的影響

圖3　暗條件下苗齡4周Col、gldh236OE和vtc2-1植株葉綠素?zé)晒鈪?shù)指標變化(平均值±標準誤，n=4).

Figure 3Changes of chlorophyll fluorescence parameters in 4-week-oldCol,gldh236OEandvtc2-1 plants under dark condition (Mean±SE,n=4). Student’s t-test was used to calculate statistical significance.

3　討論

本研究中，抗壞血酸合成超表達突變體gldh236OE與抗壞血酸合成缺失突變體vtc2-1的AsA含量，分別比野生型增加約32%或減少70%～80%[11]，實現(xiàn)了從內(nèi)源調(diào)控抗壞血酸合成的含量.有報道指出，通過超表達水稻GLDH基因可提高抗壞血酸的合成量，延緩水稻衰老，提高結(jié)實率，而干涉水稻GLDH基因表達使抗壞血酸合成量減少，加速水稻衰老，結(jié)實率降低[29].過表達VTC2基因可提高植物體內(nèi)抗壞血酸含量[12-13，30]，而vtc2-1突變體與野生型相比，抗壞血酸含量更低且株型更小[12].

VTC2與GLDH基因的轉(zhuǎn)錄具有光誘導(dǎo)特性，其特性與光誘導(dǎo)植物細胞中AsA含量增加一致.Tamaoki等[31]發(fā)現(xiàn)，擬南芥GLDH基因的表達呈現(xiàn)出晝夜變化并且受光調(diào)控，它在調(diào)控AsA庫的大小上可能起作用.Dowdle等[12]發(fā)現(xiàn)，在強光條件下，誘導(dǎo)VTC2基因表達，GDP-L-半乳糖磷酸酶活性增加，同時植物葉片中AsA含量上升.超表達GLDH基因植物體內(nèi)AsA含量提高，一定程度提高植株對強光的抗性[15].

黑暗誘導(dǎo)的葉片衰老具有個體與基因型之間的同步性，因此被作為模型應(yīng)用到很多葉片衰老的研究中，然而其具體的調(diào)控機制仍不清楚.在本研究中，黑暗脅迫處理后，3種基因型幼苗的AsA含量均顯著下降(P<0.05)；在黑暗脅迫處理6 d后，與處理前相比，抗壞血酸缺失突變體vtc2-1的抗壞血酸含量顯著降低(P<0.05)，進一步印證了VTC2與GLDH基因具有光誘導(dǎo)特性.黑暗脅迫處理后，不同基因型幼苗開始出現(xiàn)不同程度的黃化、卷曲，甚至枯死的表征.與對照Col相比，gldh236OE衰老特征較輕，抗壞血酸缺失突變體vtc2-1衰老更為明顯.推測可能在擬南芥幼苗受到黑暗脅迫過程中，較高含量的抗壞血酸能夠提高植株對黑暗的適應(yīng)性，維持正常的生理狀態(tài).但是，外施AsA除了顯著提高抗壞血酸缺失突變體vtc2-1葉綠素?zé)晒鈪?shù)的非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ(P<0.05)，對于其他部分暗誘導(dǎo)的衰老并沒有得到顯著性緩解.

生物或非生物脅迫對植物光合作用過程產(chǎn)生的影響都可通過葉片葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)參數(shù)的變化反映出來[32].Fv/Fm的降低是光抑制的顯著特征，說明植物可能遭遇逆境，受到光抑制，光抑制還會引起PSII反應(yīng)中心的破壞或失活，導(dǎo)致PSII的下降[33].本實驗中研究葉片衰老的結(jié)果顯示，與黑暗脅迫處理前相比，3種基因型擬南芥Fv/Fm顯著降低，并且隨著脅迫時間延長而加劇，說明黑暗脅迫使幼苗產(chǎn)生了光抑制，可能造成了PSII反應(yīng)中心的失活，使光能轉(zhuǎn)化效率降低. Yield呈下降趨勢，而后期有部分上升，進一步說明PSII反應(yīng)中心的功能受到可逆的損傷.與黑暗處理前相比，Col與gldh236OE幼苗的NPQ隨黑暗處理時間的延長呈先上升后下降的趨勢，說明Col與gldh236OE幼苗熱耗散能力是先增強后減弱，推測擬南芥幼苗在遭受脅迫后采取的一種應(yīng)激反應(yīng)抵抗外界環(huán)境脅迫，但是NPQ的形成受到了抑制.而vtc2-1幼苗的NPQ則無顯著變化，推測抗壞血酸缺失會降低幼苗對外界環(huán)境脅迫的響應(yīng).而內(nèi)源AsA的增加和外施AsA均減緩了黑暗脅迫對幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)NPQ的影響，說明AsA有利于幼苗在黑暗脅迫的生理響應(yīng)，可能是內(nèi)源AsA對黑暗脅迫下幼苗的PSII反應(yīng)中心有一定的保護作用，增加其熱耗散能力，以增強幼苗對黑暗脅迫的適應(yīng)性，而外施AsA可補充內(nèi)源AsA不足，在一定程度緩解植物受到響應(yīng)脅迫.

眾所周知，衰老與抗氧化能力的下降和ROS的增加有密切關(guān)系[34].VTC2與GLDH基因表達量降低導(dǎo)致抗壞血酸含量減少，低水平的抗壞血酸可以導(dǎo)致ROS的積累，光合器官的損害將會增加，導(dǎo)致缺少抗壞血酸的光合組織的光合能力下降，衰老也會因此被加速.AsA不僅能作為電子供體維持光合作用, 還在保護光合器官方面起到重要作用[35].AsA通過參與水循環(huán)、谷胱甘肽-抗壞血酸循環(huán)或者作為APX的輔助因子消除光呼吸等過程產(chǎn)生的過剩ROS，保護光合功能[36].本研究中抗壞血酸含量最高的gldh236OE在黑暗誘導(dǎo)的衰老中能夠維持更高的葉片光合能力也證實了AsA的功能[33].

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【中文責(zé)編：成文英文責(zé)編：李海航】

Effects of Ascorbate on Darkness Induced Aging in Arabidopsis

Li Mei, Chen Xiaofeng, Peng Changlian*

(School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

Arabidopsisthalianahad been selected as the research material in this study, to test the darkness stress on the eco-physiological characteristics (including phenotype, total ascorbate content and the chlorophyll fluorescence) of three genotype plants with different endogenous ascorbate contents (GLDHgene over-expression named asgldh236OE, wide typeColand the AsA deficient mutantsvtc2-1). The results indicated that the contents of total ascorbic acid of the three genotype plants were trended down under the darkness. Compared with the wide type (Col), total ascorbate content ofvtc2-1 was significantly reduced (P<0.05). The leaf etiolation speed ofvtc2-1 was faster thanCol, butgldh236OEwas slower. The darkness induced the decrease ofFv/Fm and Yield, which hindered photosynthetic efficiency of PSII. It also reduced the NPQ ofvtc2-1, and exogenous applied ascorbic acid markedly enhanced its capability of the heat dissipation (P<0.05). The present results indicated that the deficient of endogenous ascorbate reduced plants’ resistance to dark stress and exogenous ascorbate relieved the stress of the dark in part.

Arabidopsisthaliana; ascorbate; darkness; the chlorophyll fluorescence parameters; stress resistance

2015-04-07《華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國家自然科學(xué)基金項目(31270287)

彭長連，研究員，Email:pengchl@scib.ac.cn.

Q945.3

A

1000-5463(2015)05-0071-07