黃芩抗菌作用物質(zhì)基礎研究

雷蕾　楊秦予

（陜西省友誼醫(yī)院，陜西西安710069）

·實驗報告·

黃芩抗菌作用物質(zhì)基礎研究

雷蕾楊秦予

（陜西省友誼醫(yī)院，陜西西安710069）

目的觀察黃芩提取物及分離的化合物的抑菌效果。方法醇提法對黃芩進行提取，對提取物用不同溶劑進行萃取，對萃取物進行分離和純化，得到了4個化合物并進行結(jié)構(gòu)鑒定，對不同提取物和化合物進行體外抑菌實驗。結(jié)果黃芩乙酸乙酯和正丁醇提取物在質(zhì)量濃度為1 mg/mL時對大腸桿菌有一定的抑菌作用，千紙層素-A和黃芩素對大腸桿菌也有一定的抑菌作用。結(jié)論千紙層素-A和黃芩素是黃芩抗菌作用的物質(zhì)基礎之一。

黃芩抗菌黃芩素千紙層素-A

黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）是臨床中最常用的中藥之一，具有清熱燥濕、瀉火解毒、涼血止血的功效。文獻中對黃芩抗菌作用研究主要集中在黃芩水溶性黃芩苷類成分，而黃芩中的脂溶性抗菌成分研究較少。筆者以70%的乙醇對黃芩進行了提取，再以硅膠分離得到了黃芩不同極性的部分，并對這些部分進行了體外抗菌活性篩選?，F(xiàn)將對黃芩脂溶性抗菌成分的研究報告如下。

1　材料與方法

1.1試藥與試劑黃芩采購自西安市萬壽路藥材市場，經(jīng)鑒定為黃芩屬植物黃芩的干燥根；無水乙醇、石油醚購自西安試劑廠；乙酸乙酯、正丁醇、石油醚購自南京市鑫宏發(fā)化工有限公司；蛋白胨、酵母提取物購自Oxid公司。

1.2實驗儀器垂直流動超凈工作臺，上海智誠儀器制造有限公司；303型數(shù)顯溫控電熱恒溫培養(yǎng)箱，銳鋒制藥機械有限公司；RE-522旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3菌株E.coli BL21，購自中國食品藥品檢驗所。

1.4黃芩的提取與粗分離取黃芩1 kg，適當粉碎后放于自制的浸泡缸中，向其中加入3 L 70%的乙醇，室溫浸泡7 d后將提取液取出，再加入3 L 70%的乙醇室溫提取2次，每次7 d。將3次的提取液合并，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮，回收溶劑，得到浸膏。稱取黃芩浸膏100 g，加200 mL水使其分散均勻。將混懸液加入到1000 mL的分液漏斗中，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取。每次200 mL，重復3次。合并每部分的萃取液，進行減壓濃縮。分別得到黃芩的3種不同極性的混合物，用來進行抑菌實驗。

1.5乙酸乙酯萃取物分離稱取黃芩乙酸乙酯部分20 g，用硅膠濕法裝柱，進行柱分離。以石油醚∶乙酸乙酯15∶1作為起始的洗脫劑，依次調(diào)整洗脫劑的比例為15∶1，12∶1，10∶1，8∶1，6∶1，5∶1，4∶1，2∶1，1∶1，最后用甲醇將柱子沖洗并收集洗脫液，合并含有相同組分的洗脫液，回收溶劑，共得到5段不同極性的混合物，用作下一步的抑菌試驗。

1.6柱分離后第2段和第4段的分離1）稱取第2段100 mg丙酮溶解，進行拌樣。用硅膠濕法裝柱，以氯仿∶丙酮（10∶1）開始進行洗脫。等到第1個黃色色帶完全下來后并且洗脫液沒有顏色時，將洗脫液換成5∶1進行洗脫。對洗脫液進行TLC分析，合并含有相同成分的洗脫液。將合并液減壓濃縮后再進行TLC檢測。本次分離得到了2個化合物，分別編號為化合物1和2，質(zhì)量分別為25 mg和40 mg，用作下一步的抑菌試驗。2）稱取第4段100 mg用丙酮溶解，進行拌樣。稱取20 g的硅膠放于燒杯中，加入200 mL石油醚后攪拌除氣泡并進行裝柱。上樣，以氯仿∶丙酮（8∶1）為起始，依次調(diào)整洗脫劑的比例為8∶1，6∶1，4∶1，2∶1進行洗脫。收集洗脫液并進行TLC檢測，合并相同部分的洗脫液，對合并液進行減壓濃縮。得到了兩個化合物，分別編號為化合物3和4，質(zhì)量分別為20 mg和25 mg，用作下一步的抑菌試驗。

1.7體外抑菌試驗將大腸桿菌接種到含有蛋白胨和酵母提取物的固體培養(yǎng)基中，將含有黃芩提取物的濾紙片（d=0.2 cm）貼到培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈的直徑。黃芩提取物以水為溶劑，若不溶于水，以10%的吐溫-80作為助溶劑，以氨芐青霉素作為陽性對照組，以10%的吐溫-80溶液作為陰性對照。

2　結(jié)果

2.1黃芩不同提取物的抑菌結(jié)果見表1。從結(jié)果中可以看出，黃芩乙酸乙酯和正丁醇層對大腸桿菌有抑菌作用較強，石油醚層基本沒有抑菌作用。乙酸乙酯層柱分離后的活性主要集中在第2段和第4段，分離得到化合物1和化合物4相比另外兩個化合物的作用較強。

表1　黃芩不同提取物的抑菌結(jié)果

2.2化合物的結(jié)構(gòu)確定

2.2.1化合物1的結(jié)構(gòu)鑒定1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：12.5（1H，s，5-OH），7.91（2H，m，2’，6’-H），7.57（3H，m，3’，4’，5’-H），6.69（1H，s，3-H），6.45（1H，s，8-H），4.04（3H，s，OCH3）。EI-MS：［M］+m/z 284，［M-CH3］+m/z 269，［A1-CH3-CO］+m/z 139。

經(jīng)過與文獻對照分析［1］，發(fā)現(xiàn)該化合物與黃芩中千紙層素-A（oroxylin-A）的氫譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致。因此鑒定化合物1為千紙層素-A。結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1　千紙層素-A的結(jié)構(gòu)

2.2.2化合物2的結(jié)構(gòu)鑒定1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：12.39（1H，s，5-OH），7.33（1H，t，J=8.4Hz，4’-H），6.73（1H，s，3-H），6.66（1H，d，J=8.4 Hz，3’-H），6.58（1H，d，J=8.4 Hz，5’-H），4.10（3H，s，OCH3），3.94（3H，s，OCH3），3.91（3H，s，OCH3），3.85（3H，s，OCH3）。EIMS：［M］+m/z 374，［M-CH3］+m/z 359。

經(jīng)過與文獻對照分析［2］，該化合物與黃芩中黃芩黃酮-Ⅱ的氫譜和核磁數(shù)據(jù)一致。因此，該化合物為黃芩黃酮-Ⅱ。結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2　黃芩黃酮-Ⅱ的結(jié)構(gòu)

2.2.3化合物3的結(jié)構(gòu)鑒定1H-NMRR（CD3COCD3，400 MHz）δ：12.23（1H，s，5-OH），10.42（1H，s，3-OH），7.46（1H，t，J=8 Hz，4’-H），6.91（2H，d，J=8 Hz，3’，5’-H），6.41（1H，d，J=1 Hz，6-H），6.36（1H，d，J=1 Hz，8-H），5.99（1H，d，J=4 Hz，2-H），5.10（1H，d，J=4 Hz，8-H）。EI-MS：［M］+m/z 304。

通過與文獻對照［3］，該化合物與反式5，7，2’，6’-四羥基二氫黃酮醇的氫譜和核磁數(shù)據(jù)一致。因此，化合物3為5，7，2’，6’-四羥基黃酮醇。結(jié)構(gòu)見圖3。

圖3　反式5，7，2’，6’-四羥基黃酮醇的結(jié)構(gòu)

2.2.4化合物4的結(jié)構(gòu)鑒定1H-NMR（CD3COCD3，400 MHz）δ：12.75（1H，s，5-OH），8.07（2 H，m，2’，6’-H），7.60（3 H，m，3’，4’，5’-H），6.76（1 H，s，3-H），6.69（1 H，s，8-H）。EI-MS：［M］+m/z 270。

通過與文獻比較［4］，該化合物與黃芩素的氫譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致。因此，化合物4的結(jié)構(gòu)鑒定為黃芩素。結(jié)構(gòu)見圖4。

圖4　黃芩素的結(jié)構(gòu)

3　討論

黃芩中的化學成分比較復雜，從黃芩中已經(jīng)分離并鑒定了295種化合物［5］，其主要有黃酮類［6］、生物堿本實驗通過對黃芩提取物進行體外抗菌作用研究，對黃芩乙酸乙酯層進行純化得到了4個化合物，分別為千紙層素-A、黃芩黃酮-Ⅱ、5，7，2’，6’-四羥基黃酮醇和黃芩素。體外抑菌實驗表明，千紙層素-A和黃芩素有一定抑菌作用，表明這兩個化合物是黃芩體外抗菌作用的物質(zhì)基礎之一。但千紙層素-A和黃芩素的作用都比混合物的作用弱，可能是由于混合物中的抗菌作用是多個化合物共同作用的結(jié)果。

類［7］、環(huán)烯醚萜苷類［8］、揮發(fā)油等化學成分，現(xiàn)代藥理學研究表明黃芩具有抗腫瘤［9］、抗菌［10］、抗氧化［11］、保肝和鎮(zhèn)驚的作用。研究報道中關于黃芩的抗菌作用主要為黃芩提取物、黃芩苷等，而黃芩中具體的抗菌物質(zhì)研究較少。

隨著細菌的耐藥性不斷增強，傳統(tǒng)的抗生素篩選方法進展比較緩慢，從天然產(chǎn)物中開發(fā)抗生素就顯得尤為重要。許多中藥都具有一定的抗菌活性，然而成分比較復雜，許多抗菌的有效成分還不明確。本研究為從黃芩中尋找新的抗菌藥物提供了依據(jù)，盡管研究表明千紙層素-A和黃芩素有一定抑菌作用，但具體的抗菌機制還有待進一步研究。

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·綜述·

R289.2

A

1004-745X（2015）11-1967-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.11.029

2015-07-21）