過表達(dá)NeuroD1對(duì)脊髓反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元的影響☆

康文博陳翀李曉紅王景景涂悅張賽梁海乾

過表達(dá)NeuroD1對(duì)脊髓反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元的影響☆

康文博*陳翀*李曉紅*王景景*涂悅*張賽*梁海乾*

目的 探討過表達(dá)NeuroD1對(duì)脊髓反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元的影響。方法 體外原代培養(yǎng)SD大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞，以劃痕實(shí)驗(yàn)制備反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為空白組（NV組）、對(duì)照病毒組（GFP組）和NeuroD1病毒組（NeuroD1組）。各組行劃痕處理7 d后，NV組不感染病毒，GFP組感染攜帶GFP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，NeuroD1組感染同時(shí)攜帶GFP和NeuroD1基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，24 h后同時(shí)更換神經(jīng)元條件培養(yǎng)基。各組在1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、14 d觀察細(xì)胞形態(tài)，并采用免疫熒光染色方法分別在感染病毒后7 d觀察細(xì)胞DCX陽性率和14 d觀察細(xì)胞NeuN陽性率。結(jié)果 更換神經(jīng)元條件培養(yǎng)基后，各組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，胞核明顯飽滿，胞漿減少，突起減少并延長(zhǎng)。與NeuroD1組相比，NV組和GFP組細(xì)胞突起短而分枝多，胞核較小。感染病毒后7 d，NV組和GFP組細(xì)胞部分形態(tài)逐漸恢復(fù)以前形態(tài)而NeuroD1組維持變化后形態(tài)。與NV組和GFP組相比，NeuroD1組出現(xiàn)DCX（9.84%±2.06%）（F=40.107）和NeuN（8.25%±2.78%）陽性細(xì)胞（F=21.73），結(jié)果差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 在體外培養(yǎng)，NeuroD1的過表達(dá)可以介導(dǎo)體外培養(yǎng)脊髓反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元。

NeuroD1轉(zhuǎn)分化 反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞 神經(jīng)元 劃痕

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種破壞性極大的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷，可造成嚴(yán)重的肢體功能障礙，使患者喪失勞動(dòng)能力，給家庭和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)。SCI后，在細(xì)胞水平會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)元凋亡缺失、軸突斷裂，并且數(shù)量最多的星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)迅速活化形成反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞（reactive astrocytes，RAS）［1］。RAS過度增生形成的膠質(zhì)瘢痕不僅對(duì)軸突的再生起到了物理阻擋作用［2-3］，還可分泌和釋放多種生長(zhǎng)抑制因子和炎性因子來抑制軸突再生，嚴(yán)重阻礙神經(jīng)功能恢復(fù)［4-5］。近年來，細(xì)胞轉(zhuǎn)分化技術(shù)蓬勃發(fā)展，這種技術(shù)可以直接將某一種成體終末分化細(xì)胞特定轉(zhuǎn)化為其他種類的終末分化細(xì)胞或某種細(xì)胞的前體階段［6-8］。但是將RAS直接轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元的研究很少。本研究在細(xì)胞階段，將攜帶神經(jīng)分化因子1（Neuronal differentiation 1，NeuroD1）基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，以探討過表達(dá)NeuroD1對(duì)導(dǎo)脊髓反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元的影響。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象SD孕鼠1只，用于1～3 d新生鼠的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的提取和培養(yǎng)，由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。試劑：DMEM/F12（Dulbecco's Modified Eagle Media:Nutrient Mixture F-12）培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）、胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）（Gibco，美國(guó)）、小鼠抗Nestin抗體（Abcam，英國(guó)）、兔抗GFAP抗體（Sigma，美國(guó)）、小鼠抗NeuN抗體（Abcam，英國(guó)）、兔抗DCX抗體（Sigma，美國(guó)）、FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗（Life technology，美國(guó)）、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（Life technology，美國(guó)）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF）（peprotech，以色列）、B-27（Gibco，美國(guó)）、固定液（BD，美國(guó)）、破膜液（BD，美國(guó)）、同型對(duì)照抗體（BD，美國(guó)）。病毒：對(duì)照病毒攜帶GFP基因，NeuroD1病毒攜帶GFP和NeuroD1基因，均為逆轉(zhuǎn)錄病毒，以MOI值1:100感染細(xì)胞，24 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)。由上海和元生物科技有限公司提供。實(shí)驗(yàn)分為空白組（NV組）、對(duì)照病毒組（GFP組）和NeuroD1病毒組（NeuroD1組）。各組行劃痕處理7 d后，NV組不感染病毒，GFP組感染攜帶GFP基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，NeuroD1組感染同時(shí)攜帶GFP和NeuroD1基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，24 h后同時(shí)更換神經(jīng)元條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14 d。

1.2原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的提取和鑒定 取1～3 d新生SD大鼠，用75%的酒精浸泡5 min，無菌條件下分離后背皮膚、肌肉與脊椎，暴露脊髓，取出脊髓放入0.01 mmol/L磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）中去除脊髓膜和血管等組織，置于DMEM/F12培養(yǎng)基中用200目不銹鋼濾網(wǎng)進(jìn)行研磨，將濾液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，1000 r/min離心10 min，棄上清，加入0.25%的胰蛋白酶消化1～2 min，用含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中止消化，再次離心，棄上清，加入含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸沉淀置于培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h差速粘附，更換培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)至長(zhǎng)滿80%～90%，置于恒溫?fù)u床260 r/ min振蕩16 h，換液繼續(xù)培養(yǎng)并檢測(cè)純度［9-10］，以備后用。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞純度：傳至第3代后，將星形膠質(zhì)細(xì)胞消化離心收集細(xì)胞，加入固定液500 μL懸浮沉淀并進(jìn)行固定20 min，1400 r/min離心10 min，加入破膜液，取所制樣品各100 μL分別加入兩個(gè)離心管，一只再加入兔抗GFAP抗體5 μL，另一只加入同型對(duì)照抗體20 μL，4℃、40 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.3劃痕損傷制備RAS將星形膠質(zhì)細(xì)胞以1×104種植于48孔板，用10 μL無菌加樣槍頭沿“井”字劃痕，劃痕間距0.3 mm，劃痕時(shí)保持勻速和相同力度。劃后換液除去脫落和死亡細(xì)胞及碎片，每隔3 d半量換液［11］。免疫熒光（Nestin/GFAP）染色檢測(cè)RAS：劃痕7 d后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS浸洗3×5 min，0.5%Triton X-100破膜20 min，PBS浸洗3×5 min，5%BSA封閉孵育20 min，加入一抗（1:1000）兔抗大鼠GFAP標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞，4℃過夜，PBS浸洗3×5 min，再加入Nestin（1:300）小鼠抗大鼠標(biāo)記活化的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，4℃過夜，PBS浸洗3×5 min，后續(xù)操作避光，加入二抗（1: 200）羊抗兔抗體綠色，37℃、孵育1 h，PBS浸洗3× 10 min，再加入二抗（1:200）羊抗小鼠抗體紅色，37℃、1 h，PBS浸洗3×10 min，加入DAPI染核（1: 100），37℃孵育10 min，PBS浸洗3×10 min，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.4免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)分化效率 分別在感染病毒7 d、14 d行免疫熒光染色。感染病毒后7 d的各組細(xì)胞分別加入一抗（1:300）兔抗DCX抗體標(biāo)記早期神經(jīng)元，各組用DAPI染細(xì)胞核。感染病毒后14 d的各組細(xì)胞分別加入一抗（1:200）小鼠抗NeuN抗體標(biāo)記成熟神經(jīng)元，各組用DAPI染細(xì)胞核。熒光顯微鏡觀察各時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)分化效率。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)，檢測(cè)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1原代星形膠質(zhì)細(xì)胞純度檢測(cè) 第3次傳代后星形膠質(zhì)細(xì)胞純度檢測(cè)，見圖1。實(shí)驗(yàn)分兩組，同型對(duì)照熒光（圖1A）和GFAP熒光（圖1B）。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示純度為93.94%，符合實(shí)驗(yàn)要求，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞的純度。圖1A顯示為同行對(duì)照的熒光范圍，圖1B顯示為樣品的熒光范圍，C圖顯示為同行對(duì)照和樣品疊加的范圍。

2.2免疫熒光檢測(cè)RAS倒置熒光顯微鏡下觀察，見圖2，各組取6個(gè)視野記錄Nestin陽性細(xì)胞數(shù)和GFAP陽性細(xì)胞數(shù)。RAS可以特異性表達(dá)Nestin［12］，同時(shí)可以表達(dá)GFAP，因此Nestin陽性率可以表示RAS的純度。Nestin陽性率=（Nestin陽性細(xì)胞數(shù)/ GFAP陽性細(xì)胞數(shù)）×100%，各視野Nestin陽性率均大于90%，符合試驗(yàn)要求，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2　熒光顯微鏡（200×）下觀察，紅色熒光為Nestin，標(biāo)記RAS，綠色熒光為GFAP陽性細(xì)胞，標(biāo)記星形膠質(zhì)細(xì)胞，藍(lán)色熒光為DAPI陽性細(xì)胞，標(biāo)記細(xì)胞核。標(biāo)尺刻度為100μm

2.3顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變 光學(xué)顯微鏡下分別在感染后1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、14 d觀察各組的細(xì)胞形態(tài)和劃痕處細(xì)胞的改變，見圖3。感染后7 d內(nèi)，各組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，胞核明顯飽滿，胞漿減少，突起減少并延長(zhǎng)。與NeuroD1組相比，NV組和GFP組細(xì)胞突起短而分枝多，胞核較小。病毒感染后7 d，NV組和GFP組細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)以前形態(tài)而NeuroD1組維持變化后形態(tài)。

2.4免疫熒光染色結(jié)果 分別在感染病毒后7 d觀察DCX陽性率（圖4）和14 d觀察NeuN陽性率（圖5）。倒置熒光顯微鏡下觀察，各組取6個(gè)視野記錄DCX或NeuN陽性細(xì)胞數(shù)和GFP陽性細(xì)胞數(shù)。DCX或NeuN陽性率=（DCX或NeuN陽性細(xì)胞數(shù)/ GFP陽性細(xì)胞數(shù)）×100%。NV組和GFP組的陽性率近乎為0，NeuroD1組的DCX陽性率為9.84%± 2.06%（F=40.107），NeuN陽性率為8.25%±2.78%（F=21.73），都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3　討論

圖3　光學(xué)顯微鏡（100×）下觀察不同時(shí)間細(xì)胞改變，A組為NV組，B組GFP組，C組NeuroD1組，分別在3 d、7 d和14 d時(shí)細(xì)胞形態(tài)的變化

圖4　熒光顯微鏡（200×）下觀察，綠色熒光為GFP陽性細(xì)胞，為感染病毒后細(xì)胞的自發(fā)熒光，紅色熒光為DCX陽性細(xì)胞，標(biāo)記早期神經(jīng)元，藍(lán)色熒光為DAPI陽性細(xì)胞，標(biāo)記細(xì)胞核。A組為NV組，B組為GFP組，對(duì)照組為NeuroD1組。標(biāo)尺刻度為100μm

圖5　熒光顯微鏡（200×）下觀察，綠色熒光為GFP陽性細(xì)胞，為感染病毒后細(xì)胞的自發(fā)熒光，紅色熒光為NeuN陽性細(xì)胞，標(biāo)記成熟神經(jīng)元，藍(lán)色熒光為DAPI陽性細(xì)胞，標(biāo)記細(xì)胞核。A組為NV組，B組為GFP組，對(duì)照組為NeuroD1組。標(biāo)尺刻度為100μm

在脊髓中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量約為神經(jīng)元的4～5倍。SCI后，神經(jīng)元的缺失同時(shí)伴隨星形膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化為RAS，后者會(huì)過度增生形成瘢痕微環(huán)境抑制軸突再生和神經(jīng)功能的恢復(fù)。目前，SCI尚缺乏有效的治療措施，神經(jīng)元較差的再生能力和抑制性膠質(zhì)微環(huán)境的形成已被公認(rèn)為是SCI后軸突再生和功能恢復(fù)障礙的關(guān)鍵性因素。目前最流行的是細(xì)胞替代治療技術(shù)，已從胚胎干細(xì)胞發(fā)展到多能誘導(dǎo)干細(xì)胞重編程技術(shù)［13］，現(xiàn)在已進(jìn)入了轉(zhuǎn)分化技術(shù)的時(shí)代。轉(zhuǎn)分化技術(shù)可以直接將RAS轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元［14-15］。這樣一方面解決了膠質(zhì)瘢痕問題，解除了對(duì)神經(jīng)軸突再生的抑制；另一方面解決了神經(jīng)發(fā)生的問題，如誘導(dǎo)的神經(jīng)元與損傷處微環(huán)境整合，發(fā)揮神經(jīng)傳導(dǎo)的功能，這將對(duì)SCI神經(jīng)功能的修復(fù)有著重要的意義。近年來，RAS轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元的相關(guān)研究不斷深入，轉(zhuǎn)分化誘導(dǎo)條件不斷成熟且誘導(dǎo)方式逐漸多樣性，這為神經(jīng)損傷和神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的患者帶來了曙光。

本研究將攜帶NeuroD1基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染RAS，以探討NeuroD1的過表達(dá)能否介導(dǎo)脊髓反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：①感染后7 d內(nèi)，各組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，胞核明顯飽滿，胞漿減少，突起減少并延長(zhǎng)。各組細(xì)胞都發(fā)生類似的改變可能是由于細(xì)胞為了適應(yīng)環(huán)境改變而發(fā)生的形態(tài)變化。②與NeuroD1組相比，NV組和GFP組細(xì)胞突起短而分枝多，胞核較小。說明NeuroD1組病毒的NeuroD1基因整合到了RAS基因組并開始了轉(zhuǎn)錄和翻譯，形態(tài)開始向神經(jīng)元改變。而NV組和GFP組細(xì)胞發(fā)生改變只是適應(yīng)性的改變。病毒感染后7 d，NV組和GFP組大部分細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)以前形態(tài)而NeuroD1組大多維持變化后形態(tài)。更能說明NeuroD1基因發(fā)揮了明顯的作用。③NV組和GFP組的DCX、NeuN陽性率均近乎為0，NeuroD1組的DCX陽性率為（9.84%±2.06%），NeuN陽性率為（8.25%± 2.78%），都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。說明在病毒感染后7 d，NeuroD1的過表達(dá)介導(dǎo)脊髓反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為早期神經(jīng)元；而感染后14 d，轉(zhuǎn)分化為成熟神經(jīng)元。

綜上所述，將攜帶NeuroD1基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞后，NeuroD1的過表達(dá)可以介導(dǎo)脊髓反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元。本研究所進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)為后期的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供了可靠的理論依據(jù)。但是還存在一些不足：①轉(zhuǎn)分化的效率很低；②轉(zhuǎn)分化而來的神經(jīng)元是否可以有電活動(dòng)未經(jīng)證明。以上問題有待后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

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The influence of overexpression of NeuroD1 on transdifferentiation of spinal cord reactive astrocytes intoneurons.

KANG Wenbo，CHEN Chong，LI Xiaohong，WANG Jingjing，TU Yue，ZHANG Sai，LIANG Haiqian.Institute of Traumatic Brain Injury and Neurology，Brain Hospital of Affiliated Hospital of Logistics College of Chinese People's Armed Police Forces，Tianjin Key Labrotary of Neurotrauma Repair，Tianjin 300162，China.Tell：022-60577125.

Objective To investigate the effect of the overexpression of NeuroD1 on mediating transdifferentiation of spinal reactive astrocytes into neurons.Methods Spinal cord astrocytes were cultured from the SD rat，and reactive astrocytes were prepared by scratches treatment.Cells were divided into blank groups（NV group），control virus group（GFP group）and NeuroD1 virus group（NeuroD1 group）.At 7 d after scratches treatment，GFP and NeuroD1 groups were infected with retroviruses carrying the GFP gene and and GFP gene plus NeuroD1 gene，respectively，whereas NV group was not infected with the virus.Twenty-four hours late，the culture medium were replaced by neuron conditioned medium.Cell morphology was examined at 1，2，3，5，7 and 14 d.DCX positive and NeuN positive cells were detected at 7 d and 14 d after infection by using immunofluorescence staining method，respectively.Results After replacement with the neuron conditioned medium，the nucleus was obviously plump，the cytoplasm was thin and neurites was reduced and extended.Compared with the NeuroD1 group，neurites of NV group and GFP group were shorter with many branches andthe nucleus was smaller.At 7 d after infection，cell morphology of NV group and GFP group gradually recovered，but cell morphology of NeuroD1 group did not.Compared with NV group and GFP group，NeuroD1 group had more DCX（9.84± 2.06%）and NeuN（8.25±2.78%）positive cells［F values 40.107 for DCX and 21.73 for NeuN（P＜0.05）］.Conclusion The overexpression of NeuroD1 can mediate the transdifferentiation of spinal reactive astrocytes into neurons.

NeuroD1 Transdifferentiation Reactive Astrocytes Neurons Scratches

R651

A

2015-03-27）

（責(zé)任編輯:甘章平）

10.3969/j.issn.1002-0152.2015.09.010

☆國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81301050，81271392，81401067）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（編號(hào)：14JCQNJC10200，15JCYBJC28100）；中國(guó)博士后基金項(xiàng)目（編號(hào)：2013M542583）

*武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院，腦創(chuàng)傷與神經(jīng)疾病研究所，天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（天津 300162）