多發(fā)性硬化動物模型神經功能評分的比較與改良

馬可　陳雄　鄭俊炯　陳嘉誠　豐巖清

多發(fā)性硬化動物模型神經功能評分的比較與改良

馬可*陳雄*鄭俊炯*陳嘉誠*豐巖清*

目的探討三種神經功能評分方法在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）模型中的應用情況，并提出最適評價標準。方法 32只雌性C57BL/6小鼠（18～20 g）隨機分配為正常對照組（15只）、造模組（17只）。造模組用MOG33-35多肽與弗式完全佐劑等體積混合成乳劑后多點皮下注射制備成EAE模型。遵循雙人雙盲原則分別使用Kono’s 5分法、Weaver’s 15分法及改良15分法進行神經功能評分，并結合小鼠脊髓H&E染色結果，探究三種評分方法的評價準確性、癥狀敏感性、病情相關性。結果據神經功能評分趨勢圖，改良15分法后期癥狀波動更明顯。對于非典型性發(fā)病EAE，改良15分法和15分法的評分更準確。改良15分法和15分法的發(fā)病時間顯著早于5分法（P＜0.001），且可反映早期病理改變。改良15分法與高峰期、緩解期病理改變顯著相關（高峰P=0.001，緩解P=0.024），15分法與緩解期病理改變相關（P＜0.05）。結論在實驗性自身免疫性腦脊髓炎動物模型中，改良15分法能有效進行細化評分，更準確地評估各時期神經功能改變。

多發(fā)性硬化 實驗性自身免疫性腦脊髓炎 神經功能評分方法

實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是國際上公認的多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）的理想動物模型，因能復制出與MS相似的臨床表現和病理特征而被廣泛應用，并成為研究MS發(fā)病機制和藥物治療臨床前試驗的重要手段［1-4］。

典型慢性EAE小鼠模型主要表現為運動功能障礙，對其據神經功能評分標準量化后所得分數可反映患病程度。但針對此EAE模型，目前仍沒有統(tǒng)一的神經功能評分方法，常用的評分標準有Kono’s 5分法、Hooper’s 7分法和Weaver’s 15分法［5-6］。其中又因Hooper’s 7分法被多次更改，而最常用Kono’s 5分法和Weaver’s 15分法。但由于5分法適用面受限且評分不夠細化、15分法的評分標準表述缺乏精準性，導致兩種方法的對模型病情反映欠準確、對病情變化反映欠敏感。因此，本研究基于對EAE模型的長期觀察提出了改良15分法。本文從評分方法的評價準確性、癥狀敏感性、病情相關性三個方面對Kono’s 5分法，Weaver’s 15分法和改良15分法進行探究，并提出EAE模型的相對最適神經功能評分方法。

1　材料與方法

1.1實驗動物 8～10周齡的C57BL/6雌性小鼠，體重18到20 g，購自中山大學實驗動物中心（廣東），飼養(yǎng)于中山大學實驗動物中心。

1.2EAE模型制備 C57BL/6小鼠飼養(yǎng)1周后用于實驗，記為第0天。32只8～10周齡的C57BL/6雌性小鼠隨機分為正常對照組（15只）、造模組（17只）。第0天，將100 μL 2mg/mL MOG33-35（MEVGYRSPFSRVVHLYRNGK，西安聯美多肽有限公司）和100 μL弗氏完全佐劑（complete freund’s adjuvant，CFA；美國Sigma公司）混合制成乳劑，多點皮下注射于造模組制備EAE模型；同時正常對照組皮下注射磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）。第0天及第2天，造模組腹腔注射百日咳毒素（pertussis toxin，PTX；美國Sigma公司）300 ng/只。第7天，造模組再次注射乳劑進行二次免疫，造模方法同上；對照組附以PBS注射作對照。

1.3神經功能評分標準

1.3.1Kono’s 5分法 5分法（Kono，1988）［5-6］按照癥狀嚴重程度分為5個級別：0分為不發(fā)??；1分為尾巴無力；2分為后肢無力；3分為后肢癱瘓；4分為前肢癱瘓；5分為死亡。

1.3.2Weaver’s 15分法 15分法（Weaver，2005）［5-6］是對小鼠尾巴和四肢進行評分，再將得到的5個分數累加即得到總分。對于尾巴，0分表示無癥狀，1分表示尾巴半癱，2分表示尾巴全癱；對于四肢，0分表示無癥狀，1分表示無力或步態(tài)改變，2分表示肢體輕癱，3分表示肢體全癱。如此，發(fā)病最重的小鼠即尾巴全癱和四個肢體全癱則應評為14分（2’+3’×4），15分則表示死亡。

1.3.3改良15分法改良15分法是本研究基于Weaver’s 15分法做進一步細化，將小鼠尾巴和四肢進行評分，再將得到的5個分數累加即得到總分。對于尾巴（見圖1），0分表示無癥狀，0.5分表示比正常稍低，1分表示與地面平行，1.5分表示尾尖拖地，2分表示全尾拖地；對于肢體，0分表示正常，0.5分表示四肢掌外翻，1分表示四肢掌外翻且身體相應部位稍壓低，1.5分表示四肢掌外翻且身體相應部位幾乎貼地，2分表示輕癱（行走時有關節(jié)活動），3分表示全癱（肢體不能活動，行走時拖著肢體）。如此，發(fā)病最重的老鼠即尾巴全癱和四個肢體全癱則評為14分（2’+3’×4），15分則表示死亡。

1.4評分方法 神經功能評分方法嚴格遵循雙人雙盲原則，于每日9點對32只小鼠進行觀察評分，對每只老鼠使用兩種評分方法，且同一小鼠的兩次評分時間差控制在20 min以上。

1.5病理改變分析 動物取材時間及數量：①發(fā)病初期：EAE組小鼠（5分法評分=0，15分法、改良15分法評分=0.5）及正常組小鼠各3只；②發(fā)病中期：主發(fā)癥狀不同的EAE組小鼠（分別以“前肢輕癱”和“后肢無力”為主）各1只；③發(fā)病高峰期：EAE組小鼠、正常組小鼠各9只；④疾病緩解期：EAE組小鼠、正常組小鼠各3只。

動物取材方法：用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉小鼠，剖開胸腔，暴露心臟，經左心室刺入注射器，剪開右心耳，灌注生理鹽水，沖洗血液至肝臟變白后，改用4%多聚甲醛先快后慢灌注固定0.5～1 h，然后取出腰骶段脊髓浸入4%多聚甲醛液中固定24 h。濾紙將組織表面的多聚甲醛吸干后制作石蠟切片，厚度為5 μm。進行后續(xù)H&E染色，光鏡下觀察炎性細胞浸潤。

H&E染色評分標準：參照Racke的病理分度標準（400倍鏡下計數）［7］—0分：沒有炎癥細胞；1分：少量散在的炎癥細胞；2分：在血管周圍組織見炎性浸潤；3分：見大量血管套現象并向鄰近組織延伸，或者組織炎性浸潤但不伴有血管套現象。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析，實驗數據以（±s）表示。三種評分方法與病情的相關性分析采用Pearson相關系數。檢驗水準α= 0.05。

2　結果

2.1三種評分方法評價準確性比較

2.1.1神經功能評分總體趨勢 EAE組小鼠全部發(fā)病，表現為食欲不振，體重減輕，精神萎靡，步態(tài)失常，活動減少，并伴有不同程度的尾巴無力、四肢無力等癥狀。由神經功能評分曲線圖（見圖2）可得：①第4至6天，EAE組逐漸起病；15分法、改良15分法的平均癥狀評分=0.5，而5分法的平均癥狀評分仍為0（5分法的最小有癥狀評分為1分）；②第7天開始，EAE組小鼠全部患??；③第17天，EAE組小鼠病情達峰，且改良15分法的癥狀峰值最明顯；④第17至35天，EAE組病情趨于穩(wěn)定；⑤與5分法和15分法相比，改良15分法后期癥狀評分波動較為明顯，能更準確地反映模型病情的變化。

圖2　三種評分方法評分與免疫天數曲線圖

2.1.2EAE模型特例的癥狀描述EAE模型的典型發(fā)病模式為“尾部—后肢—前肢”。而第18天EAE組出現1只非典型性發(fā)病小鼠，其呈現“尾部—前肢”的疾病進展模式，即僅有尾巴無力、前肢輕癱，運動障礙癥狀未波及后肢等其他部位。取此鼠（以“前肢輕癱”為主）與同組常規(guī)發(fā)病鼠（以“后肢無力”為主）的全段脊髓做病理H&E染色，對比二者炎癥浸潤最明顯脊髓節(jié)段的病理情況。結果顯示，與正常對照（見圖5）相比，兩只EAE鼠脊髓白質均見明顯的炎性浸潤（見圖3）；而對比兩只“5分法得分各異、15分法與改良15分法得分相同”的EAE鼠（見表1），H&E染色結果未出現明顯差異。

表1　三種神經功能評分方法的神經功能評分比較

由此說明，對于非典型性發(fā)病的EAE模型，與5分法相比，15分法和改良15分法的癥狀描述準確性較高。

2.2三種評分方法癥狀敏感性比較

2.2.1EAE模型發(fā)病時間基于三種神經功能評分標準，15分法與改良15分法的發(fā)病時間（均為4.20±0.25 d）比5分法的發(fā)病時間（6.30±0.37 d）顯著提前，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001；見圖4）。結果說明與5分法相比，15分法與改良15分法更有利于早期發(fā)現EAE模型的癥狀改變。

2.2.2EAE模型發(fā)病早期病理改變?yōu)檫M一步探究三種評分方法對EAE模型早期癥狀發(fā)現的敏

圖3　主發(fā)癥狀不同的EAE模型脊髓（炎癥浸潤最明顯節(jié)段）病理切片（HE，400×）

圖4　三種神經功能評分方法的發(fā)病時間（***表示與5分法相比，P＜0.001）

圖5　EAE模型（15分法、改良15分法=0.5，5分法=0）與正常組腰骶段脊髓病理切片（HE，400×）

2.3三種評分方法病情相關性比較

2.3.1發(fā)病高峰期三種評分方法的病情相關性比較根據三種神經功能評分標準，預實驗結果顯示改良15分法的發(fā)病高峰時間（17.00±0.98）d遲于5分法的高峰時間（15.20±0.89）d、15分法的高峰時間（13.50±1.06）d，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，見圖6）。

圖6　三種神經功能評分方法的發(fā)病高峰時間（###表示與5分法、15分法相比，P＜0.001）

基于上述結果，分別于第14、15、17天（分別對應15分法、5分法、改良15分法的高峰期）取小鼠腰骶段脊髓進行H&E染色觀察，并參照Racke的病理分度標準評分。再據三種評分方法高峰期評分與脊髓病理評分進行Pearson相關分析（見表2）顯示，5分法、15分法與病理評分相關性無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），改良15分法與病理改變顯著相關（P=0.001，γ=0.709）。

表2　三種神經功能評分方法的病情相關性比較（高峰期）

2.3.2疾病緩解期三種評分方法的病情相關性比較免疫后第35天取小鼠腰骶段脊髓進行H&E染色觀察，并參照Racke的病理分度標準評分。再據三種評分方法高峰期評分與脊髓病理評分進行Pearson相關分析（見表3）顯示，5分法與病理感性，免疫后第4天處死EAE組（15分法、改良15分法評分=0.5，5分法評分=0）與正常對照組小鼠各3只，并取腰骶段脊髓做H&E染色觀察病理改變。如圖5所示，與正常小鼠相比，EAE組可見脊髓白質炎癥細胞浸潤。這進一步說明與5分法相比，15分法和改良15分法對早期癥狀的發(fā)現更敏感。評分相關性無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），15分法、改良15分法均與病理改變顯著相關（P＜0.05）。

表3　三種神經功能評分方法的病情相關性比較（緩解期）

3　討論

EAE模型作為研究多發(fā)性硬化的主要動物模型被廣泛使用，但目前對其仍沒有統(tǒng)一的神經功能評分方法。其中最常用的評分方法包括Kono’s 5分法、Hooper’s 7分法以及Weaver’s 15分法。而對于Kono’s 5分法又描述各異［8-9］，7分法也被改進成8分法、9分法等［10-11］。這些方法都有其存在的合理性，但由于缺少統(tǒng)一且行之有效的評分標準而造成了學術交流的不便。因此，本研究在15分法的基礎上做出改良，并對5分法，15分法和改良15分法在EAE模型的應用情況進行比較，試圖找到最適評價標準。

多發(fā)性硬化癥病灶具有時間多發(fā)性，其動物模型EAE也具有復發(fā)—緩解的特點。本研究顯示，對比常用的5分法和15分法，評分標準經過合理細化的改良15分法可以更準確地評估EAE模型癥狀的波動情況。多發(fā)性硬化癥病灶還具有空間多發(fā)性，其動物模型EAE的起病部位也并不固定，因此5分法的模型適用范圍嚴重受限。如本研究中出現的非典型性發(fā)病模型（以“前肢輕癱、后肢不受累”為主發(fā)癥狀）與同期常規(guī)型發(fā)病模型（以“后肢無力”為主發(fā)癥狀）相比，二者病理改變評分并無統(tǒng)計學差異，但用5分法評價得到的神經功能評分卻出現了較大的區(qū)別。這充分說明了5分法沒能有效地考慮EAE模型病灶有空間多發(fā)性的特點。而改良15分法和15分法采用分數累加的計分方法，尤其是改良15分法又做了進一步的評分細化，這很有效的解決了病灶隨發(fā)導致行為表現差異的問題。

此外，改良15分法和15分法的早期癥狀發(fā)現敏感性顯著優(yōu)于5分法。如圖4所示，改良15分法和15分法的發(fā)病時間明顯早于5分法，差異有統(tǒng)計學意義。且病理分析也驗證了改良15分法和15分法早期發(fā)現的準確性。在藥物治療臨床前試驗中，15分法，尤其是評分細化后的改良15分法在研究藥物對EAE模型早期變化的有效性方面具有顯著的優(yōu)勢。

同時，我們也對三種評分方法的與病理改變的相關性進行了研究。結果表明，在EAE緩解期，改良15分法和15分法與病理改變顯著相關。這在關于多發(fā)性硬化癥緩解復發(fā)過程的研究具有顯著優(yōu)勢。而在EAE高峰期，改良15分法與病理改變顯著相關，15分法和5分法與病理評分相關性無統(tǒng)計學意義。高峰期在關于EAE模型的研究中是一個常用于觀察的病理階段，一般的研究中該階段的確定主要是通過神經功能評分方法評分結果來確定，所以，該時期神經功能評分方法評分是否準確十分重要。所以，我們有理由相信改良15分法在未來的科研工作中會可以發(fā)揮巨大的作用。

本研究仍存在一些不足之處。首先，本研究中非典型性發(fā)病的模型數量有限，尚未得到更加全面的統(tǒng)計學數據。其次，本研究僅僅對將改良的15分法與常用的5分法和15分法進行比較，沒有將其與常用的7分法進行比較，不能客觀得出改良15分法優(yōu)于其他所有神經功能評分方法。最后，改良15分法是我們根據前人的努力成果以及實驗經驗而提出的，相比5分法和15分法都有了較大的提高，但它仍然還有進一步提高的空間。希望其他科研工作者也能對此進行研究，分享經驗，提出更加準確、敏銳、病理相關性更好的評分方法。

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A comparison study of three neurological assessments in the animal model of multiple sclerosis.

MA Ke，CHEN Xiong，ZHENG Junjiong，CHEN Jiacheng，FENG Yanqing.Department of Neurology，First Affiliated Hospital，Sun Yat-Sen University，Guangzhou，510080，China.Tel:020-87755766.

Objective To evaluate the effectiveness of three neurological assessments in experimental autoimmune encephalomyelitis.Methods Thirty-two female C57BL/6 mice（18-20g）were randomly divided into normal group（n=15）and immune group（n=17）.Immune group were induced subcutaneously in the flank by emulsion consisted of MOG33-35and complete Freund’s adjuvant.Mice were assessed by two investigators for 35 days after immunization in a blinded manner using Kono’s 5-point criterion，Weaver’s 15-point criterion and improved 15-point criterion.Based on H&E staining，we analyzed the accuracy，sensibility and dependency of three assessments.Results 35-day clinical-score plots revealed that the fluctuation of symptoms was more obvious in improved 15-point criterion compared with the other two criteria.15-point criterion and improved 15-point criterion are more accurate than 5-point criterion in atypical-onset EAE.15-point criterion and improved 15-point criterion could detect the neurological deficits much earlier than 5-point criterion（P＜0.001）.Neurological scores assessed by improved 15-point were well correlated with the pathological findings during the peak and remission stage.Conclusion Improved 15-point criterion is better neurological score system than Kono’s 5-point criterion and Weaver’s 15-point criterion because of its accurate assessment of the neurological deficits in experimental autoimmune encephalomyelitis.

Multiple sclerosis Experimental autoimmune encephalomyelitisClinical assessment criterion

R744.51

A

2014-11-07）

（責任編輯:李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2015.11.008

*中山大學附屬第一醫(yī)院神經內科（廣州510080）