液相色譜-高分辨質(zhì)譜法快速篩查蔬菜中20種氨基甲酸酯類農(nóng)藥

丁葵英，許文娟，孫軍，郭禮強，李凱

（濰坊出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，山東濰坊261041）

液相色譜-高分辨質(zhì)譜法快速篩查蔬菜中20種氨基甲酸酯類農(nóng)藥

丁葵英，許文娟，孫軍，郭禮強，李凱

（濰坊出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，山東濰坊261041）

建立蔬菜中20種氨基甲酸酯類化合物高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜分析法。樣品經(jīng)乙腈提取，QuEChERS方法對樣品凈化后，采用高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法對樣品中的目標(biāo)化合物進(jìn)行定性分析，外標(biāo)法定量確證。結(jié)果表明：20種氨基甲酸酯類農(nóng)藥在0.005 μg/mL～0.1 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好，R2均大于0.99，且所有農(nóng)藥定量限（LOQ）（S/N=10）均低于國際限量要求；在0.01、0.02 mg/kg和0.04 mg/kg的添加水平下，蔬菜中20種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的平均回收率介于60%～120%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不大于5.0%。該方法較為簡單，只需全掃描并提取精確質(zhì)量數(shù)即可進(jìn)行準(zhǔn)確定量，受基質(zhì)干擾小，能很好的滿足我國進(jìn)出口蔬菜中20種農(nóng)藥限量的嚴(yán)格要求，可以用于蔬菜基質(zhì)中此20種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測。

靜電場軌道阱；高分辨質(zhì)譜；蔬菜；20種氨基甲酸酯

氨基甲酸酯類混合物農(nóng)藥是一種廣泛使用的殺蟲劑，具有殺滅效果強、分解代謝快、殘留期短、高效、選擇性強［1］，作用范圍廣等特點。近年來氨基甲酸酯類農(nóng)藥引起的中毒事件時有發(fā)生，2009年安丘大蔥中“涕滅威亞砜”和最近“神農(nóng)丹”事件，使得氨基甲酸酯類化合物的殘留問題更加引起了人們的關(guān)注。氨基甲酸酯類化合物的品種多，毒性差別較大，能同時準(zhǔn)確地檢測多種此類農(nóng)藥十分必要。目前對于氨基甲酸醋類農(nóng)藥的檢測方法很多，有酶聯(lián)免疫吸附法［2］，該法靈敏度低無法滿足當(dāng)今社會的嚴(yán)格要求。液相色譜柱后衍生熒光法［3-4］，該方法應(yīng)用最廣泛，靈敏度高，但是柱后衍生過程繁瑣，特異性不強，干擾嚴(yán)重。氣相色譜質(zhì)譜法（GC/MS）［5-7］，由于具有高選擇性、成本低廉、易于操作且一次分析可以鑒定多種農(nóng)藥等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥分析。然而，如果樣品不進(jìn)行衍生化處理，GC/ MS很難分析極性、熱不穩(wěn)定或低揮發(fā)性的化合物。由于部分氨基甲酸醋類農(nóng)藥的熱穩(wěn)定性較差，采用氣相色譜法測定會造成分解，如涕滅威、甲萘威等，使得測定不準(zhǔn)確，因此液相色譜比氣相色譜更適合于氨基甲酸酷類農(nóng)藥的分析。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法［8-11］是近年來發(fā)展起來的一種簡便、準(zhǔn)確、快捷、靈敏度高和檢測限低的方法，可以在一次分析中定量和鑒定幾百種目標(biāo)化合物，具有很高的選擇性和靈敏度，但常規(guī)的低分辨色譜-質(zhì)譜法需要比較復(fù)雜的方法開發(fā)過程：如確認(rèn)每個化合物的母離子、子離子和碰撞能量條件等，而采用高分辨質(zhì)譜，只需采用簡單的全掃描并提取精確質(zhì)量數(shù)色譜圖即可進(jìn)行定量；此外，由于高分辨質(zhì)譜的高選擇性，進(jìn)一步增強了抗干擾能力，目前關(guān)于高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法測定氨基甲酸酯類化合物還鮮見報道。

本研究創(chuàng)建了一種利用高效液相色譜-靜電場軌道阱質(zhì)譜法快速篩查蔬菜中20種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留化合物，該方法操作簡單、靈敏度較高，可以大批量篩查該類農(nóng)藥殘留化合物，快速省時。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

Thermo scienticic Exactive orbitrap高分辨質(zhì)譜儀、Dionex ultimate U-HPLC液相色譜儀（配有電噴霧離子源）：美國Thermo公司；GM200碾磨儀；電子天平：感量為0.1 g和0.001 g（MettlerAE163）；IKA T25均質(zhì)器；冷凍離心機：德國Eppendof公司，5810R；氮吹儀（N-eovap111）；格蘭仕WD9000微波爐；0.45μm針頭過濾器；渦流混勻器：德國IKA。

甲醇、乙腈（色譜純）：美國Fisher公司；乙酸乙酯（色譜純）：德國Merk；甲酸（色譜純）：美國，Tedia；無水硫酸鎂（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，用前在500℃馬弗爐內(nèi)烘5 h，200℃時取出冷卻備用；石墨炭黑粉、C18、PSA粉和氨丙基粉：均購于Agelatechnologies inc公司；滅多威和殺線威標(biāo)準(zhǔn)品：購于Accustandard公司，100 μg/mL的液體標(biāo)準(zhǔn)品；其他18種氨基甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)品：均購于美國Sigma-Aldrich Laborchemikalien Gmbh公司，純度≥95%。

蔬菜樣品來自企業(yè)報檢樣品。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取10 mg（精確至0.1 mg）硫雙威、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、乙霉威、仲丁威、克百威、甲奈威、殘殺威、抗芽威、猛殺威、茚蟲威、速滅威、呋線威、乙硫苯威、異丙威、苯氧威和二氧威標(biāo)準(zhǔn)品，分別置于100 mL的容量瓶中，用甲醇溶解，準(zhǔn)確定容至100 mL，得標(biāo)準(zhǔn)儲備液，濃度100 μg/mL，存儲期6個月；滅多威和殺線威液體標(biāo)準(zhǔn)品為100 μg/mL，純度大于99.0%。

中間工作液：取上述各標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL于100 mL容量瓶，用甲醇準(zhǔn)確定容，得標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，濃度1 μg/mL，有效期3個月；以信噪比（S/N）≥10時的添加濃度確定本方法的檢出限（DOQ）；分別移取各中間工作液5、10、25、25、50、80、100 μL混合于10 mL容量瓶中，用流動相準(zhǔn)確定容，得0.005、0.01、0.025、0.05、0.08、0.10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（需當(dāng)日新配），用于繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.2樣品處理

大蔥、蒜苔切成約2 cm的小段，洋蔥撕成片，姜等其他蔬菜打碎，然后取出部分有代表性的樣品，縮分不少于500 g試樣，裝入清潔容器內(nèi)，加封后標(biāo)明標(biāo)記備用；準(zhǔn)確稱取30.00 g上述樣品，大蔥、蒜苔和洋蔥等樣品需消解后轉(zhuǎn)移至100 mL離心管中，其他樣品直接稱取30 g樣品至100 mL離心管中，依次加入6 g無水硫酸鎂，15 mL乙腈提取試劑，于高速分散機上充分均質(zhì)，離心10 min（10 000 r/min），取上清液3 mL于10 mL玻璃試管中過粉凈化，根據(jù)基質(zhì)情況分別過石墨炭黑粉、C18、PSA粉和氨丙基粉，渦混2 min，靜止分層后取2 mL上清液與另一干凈玻璃試管中，氮氣吹干，用1 mL流動相溶解，用一次性注射器吸取上述溶液，過0.45μm的濾膜，上機待用。

1.3LC-MS條件

1.3.1LC條件

色譜柱AgilentZORBAXSB-C18柱：3.0mm×100mm，φ1.8 μm；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：20 μL；流速：0.3 mL/ min，共運行12 min；流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：甲醇。梯度洗脫程序見表1。

表1　液相色譜梯度洗脫條件Table 1Gradient Elution Conditions

1.3.2MS條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子（ESI+）模式掃描；檢測方式：FT Orbitrap；質(zhì)量范圍：160-530，50-150，CID25V；鞘氣流速：35 arb；輔助氣流速：10 arb；噴霧電壓：3 500 V；毛細(xì)管溫度：320℃；毛細(xì)管電壓：52.5 V；分辨率：50 000；離子源溫度：200℃。

2結(jié)果與分析

2.1農(nóng)藥種類的確定

首先查閱了國內(nèi)外對蔬菜產(chǎn)品中氨基甲酸酯類的種類和限量要求，并分別對國內(nèi)及主要進(jìn)出口國家CAC、歐盟、美國、日本、加拿大和澳大利亞等國家對氨基甲酸酯類化合物種類和限量的要求［4］，同時根據(jù)氨基甲酸酯類化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)確定化合物了20多種氨基甲酸酯類化合物；同時根據(jù)高分辨質(zhì)譜儀的特點，根據(jù)一級全掃描并提取精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定量的特點，篩選淘汰出靈敏度較低、無法滿足限量值要求的農(nóng)藥，最終確定了氨基甲酸酯類化合物20種，基本滿足了蔬菜產(chǎn)品中氨基甲酸酯類化合物殘留檢測的需求。

2.2流動相的選擇

不同流動相對目標(biāo)化合物的離子化影響較大［5］，從而影響目標(biāo)化合物的影響值。本試驗研究了0.1%的甲酸水-乙腈和0.1%甲酸水-甲醇體系作為流動相的對比試驗，相同梯度比例的情況下，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同體系的流動相對待測物的出峰時間和離子化產(chǎn)生較大影響，乙腈作為有機相的體系中各農(nóng)藥出峰時間較早且較集中，同時較0.1%的甲酸水-甲醇體系中各農(nóng)藥的響應(yīng)值較低，且重現(xiàn)性不好，故采用0.1%的甲酸水-甲醇作為本次試驗的流動相體系。采用表1的梯度條件，12 min即可完成一個樣品20種氨基甲酸酯類化合物的分析，大大縮短了分析時間。

2.3特征離子的選擇

根據(jù)各農(nóng)藥的分子式數(shù)據(jù)庫信息表，并指定離子加合物類型和數(shù)量，這里設(shè)定了正模式下的H+和Na+兩種加合物離子，化合物篩選的離子提取窗口寬度為4 ppm。20種農(nóng)藥的0.1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品的H+和Na+加合離子提取色譜圖見圖1和圖2。

圖1　H+加合離子提取色譜圖Fig.1Chromatograph of extracted H+adduct ion

圖2　Na+加合離子提取色譜圖Fig.2Chromatograph of extracted Na+adduct ion

由圖1、圖2可知：滅多威、涕滅威亞砜、涕滅威、殺線威、涕滅威亞砜、呋線威和茚蟲威的Na+加合離子響應(yīng)強度要高于H+加合離子的響應(yīng)強度，特別是涕滅威和殺線威H+加合離子幾乎不出峰，Na+加合離子峰是H+加合離子峰的幾十倍，但因為Na+的來源不固定，故Na+加合離子不穩(wěn)定響應(yīng)值不穩(wěn)定，涕滅威和殺線威選擇Na+加合離子作為檢測離子外，其他物質(zhì)均選用H+加合離子為檢測離子。其中仲丁威和猛殺威為同分異構(gòu)體，在電源上加上25 V的電壓，進(jìn)一步尋找各自的子離子，其子離子檢測圖如下圖3。

2.4質(zhì)譜方法的建立

高分辨質(zhì)譜儀不需要對質(zhì)譜條件進(jìn)行特殊優(yōu)化，綜合考慮靈敏度和儀器能承受的溫度，離子源溫度確定為200℃，其余離子條件為通用質(zhì)譜條件，見1.3.2。用篩選軟件建立各農(nóng)藥的分子式數(shù)據(jù)庫信息表，并指定離子加合物類型和數(shù)量，這里設(shè)定了正離子模式下H+和Na+化合物離子?；衔锖Y選離子提取窗口寬度為4×10-6m，20種氨基甲酸酯類農(nóng)藥0.01 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液被檢測，其各農(nóng)藥的分子式及檢測離子等性質(zhì)見表2。

圖3　仲丁威和猛殺威的子離子色譜圖Fig.3Chromatograph of Fenobucarb’s and Promecarb’s product ion

表220　種氨基甲酸酯類化合物性質(zhì)Table 2The physical quality of 20 carbamate pesticides

2.5凈化方法的確定

由于氨基甲酸酯類化合物極性較高，易與樣品基質(zhì)中的高極性化合物在質(zhì)譜電噴霧電離源處發(fā)生離子化抑制現(xiàn)象而導(dǎo)致回收率偏低。此外，如果樣品不凈化可能污染儀器和縮短色譜柱使用壽命，但高分辨質(zhì)譜儀具有較高分辨率能有效去除基體干擾，所以本試驗選擇較為簡單的凈化方法，改進(jìn)的QuEChERS方法。根據(jù)不同粉末對不同干擾物質(zhì)的凈化作用，同時不能對目標(biāo)化合物進(jìn)行吸附，最終選用石墨碳50 mg，PSA100 mg，C18200 mg作為凈化粉末，盡可能去除樣品基質(zhì)中的雜質(zhì)，凈化效果好，回收率理想。

2.6線性范圍、定量限、精密度和準(zhǔn)確度

配制20種氨基甲酸酯類化合物不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以各目標(biāo)組分定量離子色譜峰面積縱坐標(biāo)，以各目標(biāo)組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，3種目標(biāo)組分在0.005 μg/mL～0.10 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，具體方程見表2。以目標(biāo)組分特征離子的10倍信噪比（S/N=10）的加標(biāo)水平為定量限，以平行測定7次的平均值作為該方法各目標(biāo)物的LOQ。

以空白大蔥和生姜樣品試驗，分別加入20種氨3結(jié)論

基甲酸酯類化合物，使得目標(biāo)化合物在樣品中的濃度分別為10、20、40 μg/kg，分別重復(fù)5次，按2.4和2.5的方法對樣品進(jìn)行處理和測定，結(jié)果表明所有目標(biāo)物的添加平均回收率在55.3%～119.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD＜5%），能夠滿足國內(nèi)外對蔬菜中氨基甲酸酯類殘留量檢測方法的要求。

本文根據(jù)氨基甲酸酯類化合物的結(jié)構(gòu)特性和基質(zhì)特點優(yōu)化了提取條件和凈化方法，建立了用乙腈提取、改進(jìn)的QuEChERS方法對樣品凈化方法，應(yīng)用HPLC與ExactiveOrbitrap質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)，建立并驗證了快速而可靠地篩查多種農(nóng)藥殘留的方法，在12min內(nèi)完成20種氨基甲酸酯類農(nóng)藥篩查，Exactive質(zhì)譜的高分辨率和高準(zhǔn)確度確保了所有化合物的鑒定。該方法不但采用了非常簡便的QuEChERS凈化方法，同時采用只需全掃描和精確質(zhì)量數(shù)的高分辨質(zhì)譜法，所以該方法簡便快速。此外，該方法具有較高的靈敏度，其定量限低于歐洲和日本法律所規(guī)定的限值，該方法能滿足進(jìn)出口企業(yè)蔬菜樣品中農(nóng)藥殘留限量檢測的要求。

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Rapid Screening of 20 Carbamate Pesticides in Vegetables Using High Resolution Benchtop Oritrap Mass Spectrometer

DING Kui-ying，XU Wen-juan，SUN Jun，GUO Li-Qiang，LI Kai
（Technical Center of Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Weifang 261041，Shandong，China）

A method with the High Resolution Benchtop Oritrap Mass Spectrometer was established to rapid screen and identify accurate Mass of 20 carbamate pesticides in vegetables.The samples were extracted by acetonitrile and purified by the QuEChERS，then qualitatively analyzed with the LC-OBMS and quantitatively analyzed with the external standard method.The results indicated the linearity of the method was good between 0.005 μg/mL and 0.1 μg/mL，and all the limits of quantities（LOQ）of this method can meet the international standard.Meanwhile，the average percent recoveries of the twenty pesticides ranged from 60%to 120%，and the relative standard deviations（RSDS）were all less than 5.0%，at three different addition levels（0.01，0.02 and 0.04 μg/mL）.This simple method，which can exactly quantitative analyze just by full scaning and extracting exact mass number，and can overcome the matrix-effect influence，can be used for the detection of the 20 carbamate pesticides in vegetables，perfectly satisfying the pesticide residues limit requirements.

orbitrap；high resolution mass spectrometer；vegetables；20 carbamate pesticides

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.031

2014-02-18

山東出入境檢驗檢疫局項目（SK201284）

丁葵英（1982—），女（漢），工程師，碩士，主要研究食品中農(nóng)獸藥殘留檢測。