長角血蜱雌蜱不同發(fā)育時(shí)期唾液腺蛋白的組成分析

王 多，李海龍，劉敬澤

（河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石家莊 050024）

長角血蜱（Haemaphysalis longicornis）隸屬硬蜱科（Ixodidae）血蜱屬（Haemaphysalis），在我國分布廣泛[1]，能夠傳播伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）、貝氏考克次體（Coxiella burnetti）、埃里克體（Ehrlichia）、巴貝斯蟲（Babesia spp.）、泰勒蟲（Theileria spp.）等多種病原體[2-3]，對(duì)人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展有極大危害[4].最新報(bào)道的新布尼亞病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV）對(duì)長角血蜱的感染率為18.75%，且與病人的SFTSV聚在一支，表明SFTSV、病人和長角血蜱存在一定的關(guān)聯(lián)，長角血蜱極可能是SFTSV傳染的傳播媒介[5].

長角血蜱唾液腺（salivary gland，SG）位于體腔腹側(cè)面，由一對(duì)葡萄狀的腺泡組成.蜱唾液腺功能強(qiáng)大，在蜱類自由生活階段和吸血寄生過程中均發(fā)揮重要作用[6].蜱唾液腺還可儲(chǔ)存萊姆病、Q熱等多種疾病的病原體，并通過唾液將病原體傳遞至宿主[7-8].目前已從蜱唾液腺中發(fā)現(xiàn)許多抑制免疫反應(yīng)和具有抗菌功能的蛋白，包括組胺結(jié)合蛋白、IgG結(jié)合蛋白、IL-2結(jié)合蛋白、p29蛋白和HL34等[9-11].因此，蜱唾液腺蛋白已成為生物學(xué)、免疫學(xué)和生物藥學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一[12].劉光遠(yuǎn)等[13]和謝俊仁等[14]構(gòu)建、篩選了長角血蜱唾液腺的cDNA文庫；Lee等[15]對(duì)唾液腺病原體進(jìn)行了檢測；Shelby等[16]研究了激素對(duì)美洲花蜱（Ambylomma americanum）唾液腺發(fā)育的影響.唾液腺蛋白的含量和成分在蜱不同發(fā)育期的變化尚未報(bào)道.本研究以長角血蜱雌蜱為對(duì)象，分析其不同發(fā)育期唾液腺蛋白含量和成分的動(dòng)態(tài)變化，以期為后續(xù)深入研究唾液腺蛋白及其功能奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 長角血蜱的采集與飼養(yǎng)

長角血蜱采自河北省小五臺(tái)山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的羊體，在實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)繁殖.在家兔耳部進(jìn)行寄生吸血，非寄生期在實(shí)驗(yàn)室光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（27±1）℃，相對(duì)濕度75%，光照時(shí)間與黑暗時(shí)間的比例為6∶18.

1.2 長角血蜱雌蜱不同發(fā)育期唾液腺蛋白含量的測定

選取處于饑餓期（U）、吸血后 2 d（F2）、交配期（M）、飽血當(dāng)天（E0）、飽血后 2 d（E2）和飽血后 4 d（E4）的雌蜱各50頭，冰浴條件下，在緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.2）中解剖出唾液腺，超聲破碎.4℃離心20 min（12 000 r/min），取上清液，－80℃保存?zhèn)溆?，Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量定量.

1.3 不同發(fā)育期雌蜱唾液腺蛋白成分的測定

采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）測定雌蜱唾液腺蛋白的成分[17].將提取的雌蜱唾液腺總蛋白溶液按照體積比為1∶0.2的比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的SDS和微量溴酚蘭，混勻后在沸水中熱處理3 min，之后上樣.電泳條件為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的濃縮膠，電壓設(shè)置為75 V，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的分離膠，電壓設(shè)置為120 V.電泳結(jié)束后取下凝膠，考馬斯亮蘭R250染色，酸甲醇脫色液脫色.Omega 12ic凝膠成像系統(tǒng)拍照，Gel-Pro Analyzer 4.0軟件進(jìn)行分析.

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)育期雌蜱唾液腺總蛋白的含量

雌蜱唾液腺總蛋白含量隨發(fā)育期的不同而變化，且各期的蛋白含量差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），如圖1所示.

圖1 長角血蜱雌蜱不同發(fā)育期唾液腺總蛋白的含量Fig.1 Total protein content of salivary gland in femaleh.longicornis at different developmental stages

由圖1可以看出，饑餓期雌蜱的唾液腺蛋白含量最低（9.51μg/頭）.隨著吸血時(shí)間的延長，蛋白含量逐漸升高，至交配期唾液腺蛋白含量出現(xiàn)峰值（84.40μg/頭）.隨后，唾液腺蛋白的含量逐漸下降，飽血后4 d時(shí)蛋白含量僅為峰值的1/4.

2.2 不同發(fā)育期雌蜱唾液腺蛋白成分的變化

長角血蜱雌蜱的唾液腺蛋白經(jīng)PBS提取后，利用SDS-PAGE進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示.

圖2 不同發(fā)育期長角血蜱雌蜱唾液腺蛋白成分Fig.2 Protein profile of salivary gland in femaleh.longicornis at different developmental stages

由圖2可以看出，隨著吸血時(shí)間的延長，雌蜱唾液腺蛋白的條帶變化明顯.饑餓期雌蜱唾液腺蛋白帶出現(xiàn)17條，吸血后2 d（F2）蛋白條帶增加至23條.交配時(shí)雌蜱唾液腺蛋白的條帶數(shù)最多，達(dá)到26條，交配后至飽血后4 d，蛋白條帶無明顯變化，保持在26條.從饑餓期至飽血后4 d，各發(fā)育期均有5條明顯主帶，其蛋白相對(duì)分子質(zhì)量由大到小為97、84、74、45和32 kDa.

3 討論與結(jié)論

蜱類在叮咬吸血過程中，唾液腺質(zhì)量增加，結(jié)構(gòu)重組明顯，分泌多種功能物質(zhì)抑制宿主免疫反應(yīng)，進(jìn)而使其成功獲得宿主血液，并有助于傳遞病原體至宿主，如蜱類分泌的唾液能夠刺激宿主IL-10和IL-4等細(xì)胞因子的合成，進(jìn)而可以選擇性地減少巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，降低宿主對(duì)蜱類或病原體的免疫反應(yīng)[18].長角血蜱唾液腺鑒定出的黏合劑成分則有助于吸血過程中口器固定[19].此外，不斷有抗凝血酶、抗菌肽等蛋白類功能物質(zhì)在蜱類唾液腺中被鑒定出，由此可見蜱類唾液腺蛋白在蜱類生命活動(dòng)過程中發(fā)揮著重要作用.本研究對(duì)長角血蜱不同發(fā)育期的唾液腺蛋白含量及成分進(jìn)行分析，結(jié)果表明，饑餓期長角血蜱雌蜱的唾液腺蛋白含量最低，交配期蛋白含量最高，飽血后蛋白含量開始下降.該過程可能與蜱類的飽血過程密切相關(guān)，吸血初期蜱類的吸血緩慢，唾液腺逐漸發(fā)育，體積變大，蛋白含量上升.交配可以使長角血蜱進(jìn)入快速吸血期，此時(shí)蜱類唾液腺功能最為強(qiáng)大，蛋白含量達(dá)到峰值.飽血后，蜱類唾液腺逐漸退化，體積變小，蛋白含量逐漸降低.

SDS-PAGE分析表明，隨著吸血的進(jìn)行，長角血蜱雌蜱的唾液腺蛋白成分不斷增加，饑餓期唾液腺蛋白為17條，吸血初期增加至23條，交配期達(dá)到峰值，交配期至飽血后蛋白條帶無明顯變化.這表明吸血的起始能夠促進(jìn)唾液腺發(fā)育，觸發(fā)唾液腺分泌功能蛋白，如黏合劑蛋白、抗凝血酶蛋白等，這些蛋白有助于蜱類叮咬吸血的持續(xù)進(jìn)行.交配后長角血蜱進(jìn)入快速吸血期，多種唾液腺蛋白共同作用促進(jìn)長角血蜱大量吸血.交配期至飽血后蛋白條帶雖無明顯變化，但蛋白含量明顯降低，表明蜱類唾液腺在飽血后發(fā)育過程中的功能逐漸下降，唾液腺逐步退化.在整個(gè)吸血至飽血過程中，5條蛋白主帶有明顯變化.97 kDa蛋白主帶饑餓期存在，吸血2 d后含量增多，交配期和飽血當(dāng)天含量最為豐富，飽血后含量逐漸降低，該蛋白與唾液腺蛋白含量變化趨勢一致.45 kDa蛋白不僅在長角血蜱雌蜱的唾液腺中可檢測到，在美洲花蜱（Amblyomma americanum）、變異革蜱（Dermacentor variabilis）和達(dá)明硬蜱（Ixodesdammini）中都有存在[20]，這表明唾液和唾液腺中的一些蛋白成分在硬蜱中具有一定的保守性.

目前蜱類唾液腺的研究多集中于病原體及生理功能方面，而唾液腺發(fā)育調(diào)控因子及作用機(jī)理、功能蛋白的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定以及蛋白質(zhì)組學(xué)等方面的研究亟待開展.此類研究對(duì)于蜱類防治、人類健康及農(nóng)牧業(yè)的發(fā)展將具有重要意義.

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