堿解法測(cè)定中華鱉肝臟RNA-DNA含量比值方法的改進(jìn)

冀芳爍，楊振才

（河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石家莊050024）

中華鱉是古老的次生水生爬行動(dòng)物，隸屬于龜鱉目（Testudinata）鱉科（Trionychidae），在動(dòng)物界占有獨(dú)特的地位.中華鱉是營(yíng)養(yǎng)豐富的水生動(dòng)物，在其養(yǎng)殖和資源管理的研究中，生長(zhǎng)情況是最重要的研究指標(biāo)之一.水生動(dòng)物的生長(zhǎng)速度多采用測(cè)定一段時(shí)間內(nèi)動(dòng)物體重的變化來(lái)獲得，對(duì)于野生動(dòng)物而言獲得其生長(zhǎng)速度困難，且無(wú)法反映動(dòng)物的瞬時(shí)生長(zhǎng)狀況.近年來(lái)，許多學(xué)者開始探尋能夠反映動(dòng)物瞬時(shí)生長(zhǎng)狀況的指標(biāo).RNA-DNA含量比值（CRNA/CDNA）可以用來(lái)指示動(dòng)物的生長(zhǎng)速度、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、健康狀態(tài)以及生長(zhǎng)潛能[1-4].RNA-DNA含量比值較傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)指標(biāo)能更加靈敏、快速地反映出動(dòng)物體生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的變化，能夠?qū)仔r(shí)或幾天內(nèi)的環(huán)境變化做出反應(yīng)，而傳統(tǒng)生長(zhǎng)指標(biāo)是較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)動(dòng)物生長(zhǎng)狀況的平均值[5-7]，會(huì)掩蓋瞬時(shí)的生長(zhǎng)變化.

RNA-DNA含量比值作為瞬時(shí)生長(zhǎng)指標(biāo)的應(yīng)用是基于如下假設(shè)：細(xì)胞中總RNA表達(dá)量會(huì)隨著蛋白合成需求的增加以及動(dòng)物體的生長(zhǎng)而相應(yīng)增加[1]，而每個(gè)細(xì)胞內(nèi)DNA的含量是相對(duì)恒定的.因此RNA-DNA含量比值可以反映細(xì)胞積累合成蛋白的能力，被認(rèn)為是能夠反映生長(zhǎng)的可靠指標(biāo)[2-5].

堿解法測(cè)定動(dòng)物組織內(nèi)RNA-DNA含量比值的原理是RNA能夠被堿解為酸溶性核苷酸，而DNA不會(huì)被分解.利用堿液和不同濃度的高氯酸使同一組織內(nèi)的RNA和DNA分別沉淀分離，再通過(guò)紫外分光光度法測(cè)定其含量[8].

本實(shí)驗(yàn)整合了Buckley[9]和Robbins[10]發(fā)表的堿解法操作流程，以此作為基礎(chǔ)，結(jié)合其他已發(fā)表的使用堿解法測(cè)定RNA-DNA含量比值的研究，比較操作細(xì)節(jié)中的差異，優(yōu)化離心速率、37℃堿解水浴時(shí)間和堿解量.本研究旨在規(guī)范堿解法測(cè)定中華鱉肝臟組織RNA-DNA含量比值的操作流程，提升測(cè)量的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，為今后相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供方法上的參考.

1 材料和方法

1.1 勻漿液的制備

勻漿器中加入1 mL勻漿介質(zhì)，冰上預(yù)冷.取同一中華鱉肝臟組織100 mg，冰上充分研磨3～5 min至無(wú)組織塊存在.研磨后將勻漿液吸出，分裝入2 mL離心管中，每管0.7 mL.同時(shí)還需要做2個(gè)空白對(duì)照，即在離心管內(nèi)加入0.7 mL勻漿介質(zhì).

1.2 堿解法基本操作流程

加入0.35 mL濃度0.6 mol/L的PCA，冰浴15 min，4℃下相對(duì)離心力為10 000×g（N（r/min）=[G/（1.12×離心10 min.棄上清，沉淀加入1 mL濃度為0.2 mol/L的 PCA，4℃下 10 000×g離心 10 min.棄上清，沉淀加入0.7 mL濃度為0.3 mol/L的KOH，37℃水浴2h.之后冰浴10 min，加入0.35 mL濃度為1.5 mol/L的PCA，冰浴 10 min，4℃下 10 000×g離心 10 min.吸取上清液，260 nm處測(cè)定RNA的吸光度值.沉淀中加入1 mL濃度為 0.2 mol/L的 PCA，4℃下10 000×g離心10 min.棄去上清液，沉淀中加入1.1 mL濃度為0.6 mol/L的PCA.85℃水浴15 min，之后冰浴15 min.4℃下10 000×g離心10 min.吸取上清液，260 nm處測(cè)定DNA的吸光度.

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

除處理因素差異外，其余操作均按1.1和1.2所描述的流程進(jìn)行.

1.3.1 勻漿介質(zhì)的比較

選取2種勻漿介質(zhì)作為處理因素.Ⅰ號(hào)勻漿介質(zhì)：濃度為0.05 mol/L的Tris-HCl+濃度為0.050 mol/L的EDTA.（pH 7.4）；Ⅱ號(hào)勻漿介質(zhì)：濃度為0.05 mol/L的 Tris-HCl+濃度為 0.005 mol/L 的 EDTA（pH 7.4）.每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù).

1.3.2 離心速率的比較

選取4種離心速率作為處理因素，分別為3 000×g，6 000×g，10 000×g，12 000×g.每個(gè)處理做 2個(gè)重復(fù).

1.3.3 堿解水浴時(shí)間的比較

選取2種37℃堿解水浴時(shí)間作為處理因素，分別為水浴1h和水浴2h.每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù).

1.3.4 堿解量的比較

選取2種堿解量作為處理因素，處理Ⅰ為0.56 mL濃度為0.3 mol/L的KOH堿解，之后用0.25 mL濃度為1.5 mol/L的PCA酸化沉淀DNA；處理Ⅱ?yàn)?.7 mL濃度為0.3 mol/L的KOH堿解，之后用0.35 mL濃度為1.5 mol/L的PCA酸化沉淀DNA.每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù).

1.4 核酸含量及RNA和DNA含量比值的計(jì)算

CRNA=A260nm（RNA）/0.03，CDNA=A260nm（DNA）/0.03式中：CRNA為RNA含量，CDNA為DNA含量，單位均為μg/mL；A260nm是指在260 nm處測(cè)得的吸光度值.計(jì)算核酸含量時(shí)核苷酸的消光系數(shù)為0.03[11].

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有分析均使用統(tǒng)計(jì)軟件STATISTICA（version6.0）進(jìn)行.使用成組數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)分析比較勻漿介質(zhì)、37℃堿解水浴時(shí)間和堿解量3個(gè)實(shí)驗(yàn)得到的CRNA、CDNA、RNADNA含量比值.使用單因素方差分析比較4種離心速度間的差異，p＜0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.計(jì)算各種差異處理的變異系數(shù)CV（CV=標(biāo)準(zhǔn)差/平均數(shù)×100%）.

2 結(jié)果與討論

2.1 勻漿介質(zhì)對(duì)RNA-DNA含量比值測(cè)定的影響

分別采用2種勻漿介質(zhì)處理中華鱉的肝臟組織，堿解分離后，RNA和DNA的含量以及比值情況如表1所示.

表1 不同勻漿介質(zhì)處理下肝臟組織中RNA和DNA的分離結(jié)果（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）Tab.1 Seperating resultsof RNA and DNA of liver tissue treated with different reagent for homogenizing

t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，2種勻漿介質(zhì)處理后所測(cè)得的CRNA、CDNA和RNA-DNA含量比值差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05），但是Ⅱ號(hào)勻漿介質(zhì)的3個(gè)變異系數(shù)均小于Ⅰ號(hào)勻漿介質(zhì)，即Ⅱ號(hào)勻漿可提高中華鱉肝臟組織RNA-DNA含量比值測(cè)定的穩(wěn)定性.

2.2 離心速率對(duì)RNA-DNA含量比值測(cè)定的影響

在中華鱉肝臟組織的堿解過(guò)程中，不同離心速率對(duì)CRNA、CDNA和RNA-DNA含量比值的影響如表2所示.

表2 不同離心速率下肝臟組織中RNA和DNA的分離結(jié)果Tab.2 Seperating resultsof RNA and DNA of liver tissue treated with different centrifuge speed

表2結(jié)果顯示，4種離心速率所測(cè)得的CRNA、CDNA和RNA-DNA含量比值略有差異，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05），12 000×g離心速率下 3個(gè)變異系數(shù)最小，即該離心速率能夠提高中華鱉肝臟組織RNA-DNA含量比值測(cè)定的穩(wěn)定性.

露斯塔野鯪（Labeo rohita）的肌肉組織和凡納濱對(duì)蝦（Penaeus vannamei）的腹部肌肉組織RNA-DNA含量比值測(cè)定使用的離心速率是3 000×g[12-13]；歐洲大扇貝（Pecten maximus）的性腺RNA-DNA含量比值測(cè)定使用的離心速率是10 000×g[10]；大西洋鱈魚（Gadus morhua）全魚體RNA-DNA含量比值測(cè)定使用的離心速率是6 000×g[9].這些已有研究中使用不同的離心速率，可能是由于物種不同以及所取的組織不同，因此測(cè)定RNA-DNA含量比值的最佳離心速率不同.

2.3 堿解水浴時(shí)間對(duì)RNA-DNA含量比值測(cè)定的影響

考察中華鱉肝臟組織的堿解過(guò)程中，堿解水浴時(shí)間對(duì)CRNA、CDNA和RNA-DNA含量比值的影響，結(jié)果如表3所示.

表3 不同堿解水浴時(shí)間下肝臟組織中RNA和DNA的分離結(jié)果Tab.3 Seperating resultsof RNA and DNA of liver tissue treated with different time of water bath at 37℃

t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，堿解水浴時(shí)間2h的處理中，CRNA和RNA-DNA含量比值明顯大于水浴時(shí)間1h的處理，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）；水浴時(shí)間1h處理組的CDNA大于2h處理，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）.變異系數(shù)方面，水浴2h處理組中，各項(xiàng)變異系數(shù)均較小.

露斯塔野鯪（Labeo rohita）的肌肉組織和凡納濱對(duì)蝦（Penaeus vannamei）的腹部肌肉組織RNA-DNA含量比值測(cè)定研究中，分離RNA的堿解水浴時(shí)間是2h[12-14]；歐洲大扇貝（Pecten maximus）性腺和大西洋鱈魚（Gadusmorhua）全魚體RNA-DNA含量比值測(cè)定研究中，分離RNA的堿解水浴時(shí)間是1h[9-10].本實(shí)驗(yàn)比較2種常用的堿解水浴時(shí)間，結(jié)果表明37℃堿解水浴2h能夠使中華鱉肝臟組織的RNA堿解更充分，同時(shí)能夠提高測(cè)定的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性.

2.4 堿解量對(duì)RNA-DNA含量比值測(cè)定的影響

不同堿解量下中華鱉肝臟組織中RNA和DNA的分離情況如表4所示.

表4 不同堿解量下肝臟組織中RNA和DNA的分離結(jié)果Tab.4 Seperating resultsof RNA and DNA of liver tissue treated with different quantity of alkaline

t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，處理Ⅰ中 CRNA、CDNA、RNA-DNA含量比值均高于處理Ⅱ，2個(gè)處理組間CRNA和RNADNA含量比值的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）.由此可見(jiàn)，處理2加大堿解量和酸化沉淀的PCA量會(huì)降低肝臟組織CRNA以及RNA-DNA含量比值，同時(shí)各項(xiàng)變異系數(shù)變大.

已發(fā)表研究中[9-13，15]由于物種不同以及所取組織不同，測(cè)定RNA-DNA含量比值的最佳分離RNA沉淀DNA的堿解量和酸化的PCA量也不相同.本實(shí)驗(yàn)比較2種常用的堿解量，結(jié)果表明0.56 mL濃度為0.3 mol/L的KOH+0.25 mL濃度為1.5 mol/L的PCA的堿解酸化組合能夠提高中華鱉肝臟組織RNA-DNA含量比值測(cè)定的穩(wěn)定性.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在測(cè)定中華鱉肝臟組織RNA-DNA含量過(guò)程中，對(duì)勻漿介質(zhì)的組成成分、離心速率、37℃堿解水浴時(shí)間和堿解量這4項(xiàng)操作細(xì)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化.最終認(rèn)為在堿解法基本操作流程的基礎(chǔ)上，使用以0.05 mol/L的Tris-HCl+濃度為 0.005 mol/L 的 EDTA（pH 7.4）作為主要成分的勻漿介質(zhì)，使用12 000×g離心速率，37℃堿解水浴2h，0.56 mL濃度為0.3 mol/L的KOH+0.25 mL濃度為1.5 mol/L的PCA的堿解酸化組合，能夠提升測(cè)定中華鱉肝臟組織RNA-DNA含量比值的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性.

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