天香丹對動脈粥樣硬化穢濁痰阻證ApoE（-/-）小鼠MMP-9和TIMP-1的影響*

孫龍飛　安冬青，2△　馬文慧　古麗加瑪力·尼亞孜

（1.新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院，新疆烏魯木齊830011；2.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學重點實驗室，新疆烏魯木齊830011；3.新疆醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院，新疆烏魯木齊830011）

·研究報告·

天香丹對動脈粥樣硬化穢濁痰阻證ApoE（-/-）小鼠MMP-9和TIMP-1的影響*

孫龍飛1安冬青1，2△馬文慧1古麗加瑪力·尼亞孜3

（1.新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院，新疆烏魯木齊830011；2.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學重點實驗室，新疆烏魯木齊830011；3.新疆醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院，新疆烏魯木齊830011）

目的觀察天香丹對載脂蛋白E基因敲除［ApoE（-/-）］小鼠血清及心肌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP-1）表達的影響，探討天香丹穩(wěn)定斑塊的作用及其可能機制。方法50只8周齡ApoE（-/-）小鼠分為正常對照組（12只，給予普通飼料室溫飼養(yǎng)），高脂飼料復合寒燥環(huán)境組（38只，給予高脂飼料和人工氣候箱干預）。喂養(yǎng)12周后，在成功復制ApoE（-/-）小鼠動脈粥樣硬化穢濁痰阻證模型的基礎(chǔ)上，分為3組：模型組、天香丹組［2.7 g/（kg·d）］、阿托伐他?。劢M6.1 mg/（kg·d）］。繼續(xù)相應(yīng)處理12周后，處死各組小鼠，酶聯(lián)免疫雙抗夾心（ELISA）法檢測血清MMP-9和TIMP-1含量；實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測心肌組織中MMP-9、TIMP-1 mRNA表達水平。結(jié)果模型組小鼠血清中MMP-9含量及心肌組織中MMP-9 mRNA表達水平較正常對照組均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，天香丹組小鼠血清中MMP-9含量及心肌組織中MMP-9 mRNA表達水平均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），血清中TIMP-1含量及心肌組織中TIMP-1 mRNA表達水平較模型組均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結(jié)論天香丹可能通過抑制MMP-9的表達，促進TIMP-1的表達，穩(wěn)定粥樣硬化斑塊。

天香丹動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定基質(zhì)金屬蛋白酶-9基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1

1　材料與方法

1.1動物8周齡ApoE（-/-）小鼠（品系C57BL/6J由北京大學醫(yī)學實驗動物中心從美國Jackson實驗室引進并培育）50只，均為雄性，體質(zhì)量（18±2）g，動物質(zhì)量合格許可證號：SCXK（京）2011-0012。

1.2藥物與試劑天香丹顆粒（由新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)院制劑室制備，批號：新藥制字Z04000820），阿托伐他汀鈣片（立普妥，輝瑞制藥有限公司，批號：03171），膽固醇（美國AMRESCO公司）；小鼠MMP-9、TIMP-1 ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；Trizol（Invitrogen，美國）；DEPC水（Invitrogen，美國）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo，美國）；FastStart Universal SYBR Green Master（羅氏公司）；引物（大連寶生物有限公司設(shè)計合成），無水乙醇（購于天津市大茂化學試劑廠），異丙醇（購于天津市富宇精細化工有限公司），氯仿（購于天津市宏興化工有限公司）。

1.3儀器MIC400人工氣候箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），202-2AB型電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），LEICA DM2500光學顯微鏡（德國），低溫高速離心機（Eppendrof，德國），多功能酶標儀（Type：1500，Thermo，美國），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠），核酸定量儀（NANODROP1000，Thermo，美國），PCR擴增儀（CFX96，Bio-Rad，美國），實時熒光定量PCR儀（CFX96，Bio-Rad，美國）。

1.4分組與造模將50只8周齡ApoE（-/-）小鼠分為正常對照組（12只，給予普通飼料室溫飼養(yǎng)），高脂飼料復合寒燥環(huán)境組（38只，給予高脂飼料和人工氣候箱干預），喂養(yǎng)12周后，ApoE（-/-）小鼠出現(xiàn)行動遲緩，抑郁狀態(tài)，進食較少，舌質(zhì)多見暗紅或暗紫色。隨機從高脂飼料復合寒燥環(huán)境組抽出2只處死，取主動脈根部，HE染色光鏡下觀察，見大量粥樣斑塊形成，管腔明顯狹窄，可見少量泡沫細胞，大量膽固醇結(jié)晶形成，證實AS穢濁痰阻證模型制備成功［2］。將剩余36只ApoE（-/-）小鼠隨機分為模型組、天香丹組［2.7 g/（kg·d）］、阿托伐他汀組［6.1 mg/（kg·d）］，每組12只。

1.5給藥方法藥物干預組劑量均根據(jù)成人臨床常規(guī)用量等效換算，小鼠實驗用藥量=9.1×成人臨床用藥量［3］。將藥物溶于蒸餾水，灌胃給藥，每日1次，每周按體質(zhì)量調(diào)整給藥量。正常對照組和模型組均給予蒸餾水0.2 mL/d，各組小鼠均自由飲水飲食，不限制活動。正常對照組繼續(xù)置于室溫（20～24℃、相對濕度40%～70%）給予普通飼料喂養(yǎng)；模型組及干預組繼續(xù)人工氣候箱干預及給予高脂飼料（基礎(chǔ)飼料72.5%；豬油10%；蔗糖10%；豬膽鹽0.2%；膽固醇2%；丙硫氧嘧啶0.12%；蛋黃5%；21金維他0.1%）。人工氣候箱系統(tǒng)溫度設(shè)定為（6±2）℃，相對濕度控制在25%～32.8%［4］。

1.6標本采集與檢測實驗12周后，于取材前夜禁食，次日摘眼球取血，離心分離血清，-80℃保存，用于測MMP-9、TIMP-1含量，處死全部小鼠，無菌條件下取出心臟和主動脈，放在凍存管內(nèi)液氮驟冷，-80℃保存。

1.6.1血清MMP-9、TIMP-1水平測定采用酶聯(lián)免疫雙抗夾心（ELISA）法檢測血清中MMP-9與TIMP-1的濃度，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。用酶標儀在450 nm波長處測定各孔吸光度值，以濃度值為橫坐標，各標準吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。以各樣品孔測得的吸光度值利用標準曲線計算出相應(yīng)的濃度值。

1.6.2實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測RT-PCR檢測心肌組織中MMP-9、TIMP-1 mRNA表達水平。1）總RNA提取。取60 mg左右心肌組織，加入液氮充分研磨后，加入1 mL Trizol，一段時間后，將混合液體移入無酶EP管中，加入200 mL氯仿，充分震蕩混勻30 s，冰上靜置5～10 min，4℃12000 r/min離心10 min，吸取上層水相移至另一EP管內(nèi)，等體積加入異丙醇（約500 mL），顛倒混勻，放于-20℃冰箱中靜置10 min，4℃12000 r/min離心10 min，棄上清液，等體積加入75%乙醇（約500 mL），輕輕搖動EP管，7500 r/min離心10min，棄上液，再等體積加入75%乙醇（約500mL），重復上述步驟1遍，棄上清液，待EP管干燥后，加入50～80mLDEPC水溶解沉淀，-80℃保存?zhèn)溆?。電泳分析RNA完整性并檢測RNA的純度和含量，選OD260/OD280比值為1.8～2.0的RNA用于反轉(zhuǎn)錄。2）反轉(zhuǎn)錄cDNA。在200 μL RNase-Free離心管中混合下列成分：Total RNA 1000 ng，Oligo dT Primer 1 μL，dNTP 2.0 μL，5xR. T.Buffeer 4 μL，Ribolock 1 μL，Revert Aid 1 μL，加RNase-Free water補足至20 μL，混勻上述成分。反應(yīng)條件：42℃60 min，70℃5 min，終止反應(yīng)，產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?）實時熒光定量PCR引物設(shè)計和合成。MMP-9的引物序列：（Forward）5′-TCACTTTCCCTTCACCTTCG-3′，（Reverse）5′-TGCCGTCCTTATCG-TAGTCA-3′，產(chǎn)物長度：110 bp；TIMP-1的引物序列：（Forward）5′-GGAACGGAAATTT GCACATCAG-3′，（Reverse）5′-CTGATCCGTCCACAA ACAGTGAG-3′，產(chǎn)物長度：182 bp；內(nèi)參基因：GAPDH的引物序列：（Forward）5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAA CG-3′，（Reverse）5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′，產(chǎn)物長度：233 bp。4）實時熒光定量PCR體系和反應(yīng)條件。反應(yīng)體系20 μL：ddH2O 7 μL，2x SYBR Green 10 μL，上下游引物各0.5μL，模板cDNA2μL。反應(yīng)條件：50℃，2min；95℃，10 min；40個循環(huán)：95℃，15 s，60℃，45 s；熔點曲線分析55～95℃。5）實時熒光定量PCR基因表達差異數(shù)據(jù)分析。每個樣品重復3次，以2-△△Ct法進行相對定量分析，計算目標基因與內(nèi)參基因的相對定量值。

1.7統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1各組ApoE（-/-）小鼠血清MMP-9與TIMP-1含量的比較見表1。與正常對照組比較，模型組ApoE（-/-）小鼠血清MMP-9含量顯著升高（P＜0.01），而血清TIMP-1含量亦升高（P＜0.01）；與模型組比較，天香丹組、阿托伐他汀組ApoE（-/-）小鼠血清MMP-9含量均明顯減少（P＜0.01），血清TIMP-1含量繼續(xù)升高（P＜0.01）；天香丹組、阿托伐他汀組兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1　各組ApoE（-/-）小鼠血清MMP-9與TIMP-1水平（±s）

表1　各組ApoE（-/-）小鼠血清MMP-9與TIMP-1水平（±s）

與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。下同。

組別nMMP-9（ng/mL）TIMP-1（pg/mL）正常對照組89.09±0.88580.86±55.24模型組836.18±5.60**753.13±55.08**阿托伐他汀組814.17±1.17△△1084.52±195.59△△天香丹組814.90±1.69△△1001.29±124.41△△

2.2各組ApoE（-/-）小鼠心肌組織MMP-9 mRNA與TIMP-1 mRNA表達量的比較見表2。與正常對照組比較，模型組ApoE（-/-）小鼠心肌組織MMP-9 mRNA表達量顯著增高（P＜0.01），而TIMP-1 mRNA表達量也相應(yīng)升高（P＜0.01）；天香丹組、阿托伐他汀組與模型組比較，心肌組織MMP-9 mRNA表達量均明顯降低（P＜0.01），而TIMP-1 mRNA表達量均明顯升高（P＜0.01），天香丹組、阿托伐他汀組MMP-9 mRNA與TIMP-1 mRNA表達量比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3　討論

MMPs是一組特異性降解細胞外基質(zhì)成分的鋅離子依賴的蛋白水解酶超家族，通過降解細胞外基質(zhì)（ECM），使一些正常和病理性組織發(fā)生重構(gòu)，從而導致了AS的形成，并且能夠使已形成的斑塊不穩(wěn)定、破裂［5］。MMPs是導致AS斑塊不穩(wěn)定的重要因素之一［6］。研究發(fā)現(xiàn)MMPs升高與纖維帽變薄、不穩(wěn)定型心絞痛及急性心肌梗死（AMI）的發(fā)生密切相關(guān)［7］。研究顯示AS斑塊中的MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9表達增加［8］。MMP-9為明膠酶的一種，又稱為明膠酶B，主要降解W型膠原和彈力纖維，MMP-9是MMPs家族重要成員之一，在體內(nèi)可由單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、中性粒細胞、血管平滑肌細胞及內(nèi)皮細胞等多種細胞分泌，在AS斑塊內(nèi)ECM降解中起主要作用［9］。MMP-9是降解基質(zhì)、削弱纖維帽、誘發(fā)斑塊破裂的關(guān)鍵因素。Brown等［10］觀察冠脈旋切術(shù)斑塊中MMP-9的表達發(fā)現(xiàn)，不穩(wěn)定型心絞痛患者斑塊中MMP-9陽性表達占83%，穩(wěn)定型心絞痛斑塊中MMP-9陽性表達占25%，而正常無病變的動脈則無陽性表達?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）是MMPs的特異性抑制劑，TIMPs分為兩個功能區(qū)，其N端功能區(qū)的半胱氨酸殘基與MMP的Zn2+活性中心結(jié)合，其C端功能區(qū)與MMP的其他部位結(jié)合，以1∶1的比例形成MMP-TIMP復合體，從而阻斷MMP與底物結(jié)合而使其失活，抑制ECM的降解。在人體內(nèi)MMP-9的活性受TIMP-1調(diào)控，TIMP-1是調(diào)節(jié)ECM代謝的重要蛋白水解酶，與AS、MI等許多心血管疾病的發(fā)病機制有關(guān)［11］。Inokubo等［12-13］認為正常內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞有TIMP-l和MMP-9的表達，且兩者處于平衡狀態(tài)，以共同維持ECM合成與降解相對平衡，使斑塊趨向穩(wěn)定，不易破裂。MMP-9升高、TIMP-l的降低預示著粥樣斑塊的不穩(wěn)定或破裂。在急性冠狀動脈綜合征（ACS）的發(fā)生過程中，MMP-9表達增加大于TIMP-1表達增加，使冠狀AS斑塊纖維帽的膠原降解大于合成，導致斑塊脆性增加并最終破裂［14］。因此，MMPs和TIMPs之間的平衡性將決定著斑塊的穩(wěn)定性［15］。George［16］研究證實用TIMP-l或調(diào)節(jié)其與MMP-9之間的比例可起到治療AS的作用。

表2　各組ApoE（-/-）小鼠心肌組織內(nèi)MMP-9與TIMP-1 mRNA相對表達水平±s）

表2　各組ApoE（-/-）小鼠心肌組織內(nèi)MMP-9與TIMP-1 mRNA相對表達水平±s）

組別nMMP-9 mRNATIMP-1 mRNA正常對照組81.00±0.081.02±0.06模型組84.57±0.18**1.38±0.05**阿托伐他汀組81.91±0.14△△2.22±0.14△△天香丹組81.85±0.16△△2.14±0.16△△

新疆地區(qū)AS的發(fā)生與新疆特殊的寒冷干燥氣候環(huán)境以及居民喜食肥甘厚膩辛辣之品的飲食習慣密切相關(guān)。安冬青教授及其所帶領(lǐng)的科研團隊在繼承并發(fā)展前人學術(shù)思想的基礎(chǔ)上，結(jié)合臨床經(jīng)驗，針對新疆特殊氣候和飲食生活特點，首次提出穢濁痰阻證是新疆地區(qū)乃至整個西北地區(qū)AS的主要證型［17］，并成功研制出臨床上治療AS穢濁痰阻證用之有效的一系列方劑，天香丹是其代表性的方劑之一。天香丹具有益氣補虛、和血通絡(luò)、化痰散結(jié)之功效，以補開塞，通補結(jié)合，標本同治。在前期研究中發(fā)現(xiàn)天香丹能夠改善冠心病患者癥狀［18］，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝［19］，減少炎性細胞浸潤，具有抗炎作用［20］；改善血管內(nèi)皮損傷，促進血管新生［21-23］；改善缺血心肌能量代謝，減輕心肌細胞損害，保護心肌細胞［24］；抗自由基［25］，在臨床防治動脈粥樣硬化性疾病方面取得了良好療效。

本實驗利用高脂飼料喂養(yǎng)ApoE（-/-）小鼠模擬新疆居民飲食特點，并通過人工氣候箱進行干預來模擬新疆特殊的氣候環(huán)境。在成功復制AS穢濁痰阻證動物模型的基礎(chǔ)上，給予不同干預，研究顯示：與正常對照組比較，模型組小鼠血清MMP-9含量及心肌組織MMP-9 mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.01），提示斑塊內(nèi)基質(zhì)降解活躍，斑塊易損性增加；血清TIMP-1含量及心肌組織TIMP-1 mRNA表達水平亦相應(yīng)升高（P＜0.01），相關(guān)研究顯示MMP-9與TIMP-1呈正相關(guān)，TIMP-1的升高可能是MMP-9升高時的一種代償性反應(yīng)，MMP-9的過度升高，以致代償性增高的TIMP-1不能抑制其活性，從而導致ECM的降解和斑塊的破裂［26］。與模型組比較，天香丹組、阿托伐他汀組小鼠血清MMP-9含量及心肌組織MMP-9 mRNA表達水平均明顯降低（P＜0.01），血清TIMP-1含量及心肌組織TIMP-1 mRNA表達水平均繼續(xù)升高（P＜0.01），天香丹組與阿托伐他汀組之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示天香丹可能通過抑制MMP-9的表達，促進TIMP-1的表達，維持MMP-9與TIMP-1之間的動態(tài)平衡狀態(tài)，以增強粥樣斑塊的穩(wěn)定性。研究表明在AS病理形成過程中，始終存在炎癥反應(yīng)，相關(guān)信號通路如核因子-κB（NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，可以通過調(diào)控炎癥因子介導的炎癥反應(yīng)參與AS的病理形成過程。課題組后續(xù)將繼續(xù)從炎性信號通路角度研究天香丹對相關(guān)基因蛋白表達的影響，進一步探討天香丹抗AS、穩(wěn)定斑塊的作用及其機制。

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The Effect of Tianxiangdan on the Expression of Matrix Metalloproteinases-9 and Tissue Matrix Metallo-proteinase Inhibitor-1 of Atherosclerotic in ApoE（-/-）Mice

SUN Longfei，AN Dongqing，MA Wenhui，et al.
College of Traditional Chinese Medicine of Xinjiang Medical University，Xinjiang，Urumqi 830011，China

Objective：To observe the effect of Tianxiangdan on the expression of matrix metalloproteinase-9（MMP-9）and tissue inhibitor of metalloproteinase 1（TIMP-1）in serum and myocardial tissue in apolipoproteinE gene knock-out［ApoE（-/-）mice］，and to explore the effect of this medicine on plaque stability and its possible mechanism.Methods：50 ApoE（-/-）mice 8-week old were divided into two groups：12 in the normal control group were fed with normal diet，38 in the group with high fat diet in artificial climate box.After 12 weeks，having duplicated the model of atherosclerosis huizhuotanzu syndrome，they were randomized into three groups：Tianxiangdan［2.7 g/（kg·d）］group，Atorvastatin［6.1 mg/（kg·d）］group，and Model group.After 12 weeks of treatment，serum MMP-9 and TIMP-l levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The gene expressions of MMP-9 and TIMP-1 were determined by Real time fluorescent quantitative PCR technology.Results：The level of serum MMP-9 and the expression of myocardial tissue MMP-9 mRNA in model group were significantly higher than the normal control group（P＜0.01）；Compared with model group，serum MMP-9 level and myocardial tissue MMP-9 mRNA expression in Tianxiangdan group were reduced obviously（P＜0.01），Meanwhile The level of serum MMP-9 and the expression of myocardial tissue MMP-9 mRNA in Tianxiangdan group were significantly higher（P＜0.01）.Conclusion：Tianxiangdan may strengthen the plaque stability possibly by inhibiting MMP-9 expression，promoting TIMP-1 expression and regulating the imbalance of MMP-9/TIMP-1.

Tianxiangdan；Atherosclerosis；Stability of plaque；Matrix metalloproteinase-9；Tissue inhibitor of metalloproteinase-1臨床研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化（AS）易損斑塊的破裂及其導致血栓形成是造成急性心血管事件發(fā)生的重要原因之一［1］，斑塊的穩(wěn)定性與炎癥介質(zhì)基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子關(guān)系密切。天香丹由薔薇紅景天、唇香草等組成，具有益氣補虛、和血通絡(luò)、化痰散結(jié)之功效，臨床上治療冠心病取得了良好療效。本實驗在成功復制ApoE（-/-）小鼠AS穢濁痰阻證模型的基礎(chǔ)上，研究天香丹對ApoE（-/-）小鼠血清及心肌組織中相關(guān)炎癥介質(zhì)基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP-1）表達的影響，探討天香丹穩(wěn)定AS斑塊的作用及其可能機制。

R285.5

A

1004-745X（2015）09-1505-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.001

2015-04-27）

國家自然科學基金項目（81160428；81360571）

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