睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后生精功能損傷的分子機(jī)制研究

歐瓔瓔　吳遠(yuǎn)鵬　韋思明　楊淑嬌

睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后生精功能損傷的分子機(jī)制研究

歐瓔瓔吳遠(yuǎn)鵬韋思明★楊淑嬌

目的 探討睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后過量產(chǎn)生的活性氧是否通過調(diào)控TATA結(jié)合蛋白相關(guān)因子2（TRF2）的表達(dá)導(dǎo)致生精功能損傷。方法 60只成年雄性SD大鼠分為3組，各20只。對(duì)照組左側(cè)睪丸假手術(shù)。扭轉(zhuǎn)復(fù)位組接受左側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)，1h后復(fù)位。清除活性氧組承受與扭轉(zhuǎn)復(fù)位組相同的手術(shù)，但在復(fù)位時(shí)給予活性氧清除劑超氧化物歧化酶和過氧化氫酶靜脈注射。復(fù)位后4h或3個(gè)月切除睪丸術(shù)，其標(biāo)本測(cè)定丙二醛水平（活性氧標(biāo)記），TRF2表達(dá)和生精功能。結(jié)果 單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位明顯增加同側(cè)睪丸（即左側(cè)扭轉(zhuǎn)復(fù)位睪丸）丙二醛水平，降低TRF2表達(dá)和生精功能。相反，靜脈注射活性氧清除劑超氧化物歧化酶和過氧化氫酶顯著降低同側(cè)睪丸的丙二醛水平，提高TRF2表達(dá)和生精功能。結(jié)論 睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后，過量產(chǎn)生的活性氧通過下調(diào)TRF2表達(dá)導(dǎo)致生精功能損傷。

睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位 活性氧 TATA結(jié)合蛋白相關(guān)因子2 生精功能

睪丸扭轉(zhuǎn)是指睪丸繞精索旋轉(zhuǎn)，導(dǎo)致睪丸缺血。睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位是一個(gè)缺血再灌注過程。睪丸缺血再灌注導(dǎo)致生精功能損傷［1］，而睪丸缺血再灌注損傷的分子機(jī)制仍然不明。TATA結(jié)合蛋白相關(guān)因子2（TRF2）調(diào)控生精細(xì)胞特異基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)精子發(fā)生必不可少［2］。本文探討TRF2在睪丸缺血再灌注損傷中的作用。

1　材料與方法

1.1材料 250～300g成年雄性SD大鼠購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和β-肌動(dòng)蛋白抗體（β-actin）購自Sigma公司。丙二醛試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。TRF2抗體由Santa Cruz公司提供。

1.2方法 60只成年雄性SD大鼠被分為3組：對(duì)照組、扭轉(zhuǎn)復(fù)位組和清除活性氧組，各20只。氯胺酮（50mg/ kg）腹腔麻醉后，在無菌條件下施行外科手術(shù)。通過左側(cè)髂腹股溝切口顯露左側(cè)睪丸。對(duì)照組：將 11/0縫線穿過睪丸白膜，然后放睪丸入陰囊，關(guān)閉切口。扭轉(zhuǎn)復(fù)位組：將左側(cè)睪丸逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)720°，用11/0縫線固定睪丸至陰囊，保持睪丸扭轉(zhuǎn)狀態(tài)。1h后拆除縫線，將睪丸順時(shí)針旋轉(zhuǎn)720°復(fù)位。清除活性氧組：大鼠承受與扭轉(zhuǎn)復(fù)位組相同的手術(shù)，但在復(fù)位時(shí)，從尾靜脈注射活性氧清除劑超氧化物歧化酶和過氧化氫酶（5mg/kg）。復(fù)位后4h，每組一半的大鼠被處死，切除睪丸，其標(biāo)本測(cè)定丙二醛水平。復(fù)位后3個(gè)月，處死剩余的大鼠，切除睪丸，測(cè)定睪丸TRF2表達(dá)和生精功能。

1.3丙二醛水平測(cè)定 用硫代巴比妥酸法測(cè)量睪丸的丙二醛水平，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4TRF2蛋白表達(dá)測(cè)定 用Western blot法測(cè)量睪丸的TRF2蛋白表達(dá)水平。TRF2與內(nèi)參照β-actin的條帶密度比值表示TRF2蛋白表達(dá)水平。

1.5睪丸生精功能評(píng)估 睪丸切下后稱重，然后做成石蠟切片、蘇木素-伊紅染色，在顯微鏡下觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)。通過測(cè)量睪丸重量、曲細(xì)精管直徑、生精細(xì)胞層數(shù)及Johnsen評(píng)分來評(píng)定睪丸生精功能。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 4.0軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析和q檢驗(yàn)，組內(nèi)比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1睪丸丙二醛水平 與對(duì)照組比較，扭轉(zhuǎn)復(fù)位組同側(cè)睪丸（即左側(cè)扭轉(zhuǎn)復(fù)位睪丸）的丙二醛水平明顯增加（P＜0.05）；與扭轉(zhuǎn)復(fù)位組同側(cè)睪丸比較，清除活性氧組同側(cè)睪丸的丙二醛水平顯著降低（P＜0.05）；3組對(duì)側(cè)睪丸（即右側(cè)睪丸）的丙二醛水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2睪丸TRF2蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較，扭轉(zhuǎn)復(fù)位組同側(cè)睪丸的TRF2表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與扭轉(zhuǎn)復(fù)位組同側(cè)睪丸比較，清除活性氧組同側(cè)睪丸的TRF2表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；3組對(duì)側(cè)睪丸的TRF2表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；見圖1。

圖1　三組睪丸的TRF2蛋白表達(dá)。（A）TRF2表達(dá)的代表性結(jié)果。β-actin作為內(nèi)參照，1L和1R表示對(duì)照組左側(cè)（即同側(cè)）和右側(cè)（即對(duì)側(cè)）睪丸，2L和2R表示扭轉(zhuǎn)復(fù)位組同側(cè)和對(duì)側(cè)睪丸，3L和3R表示清除活性氧組同側(cè)和對(duì)側(cè)睪丸。（B）TRF2表達(dá)的定量分析。有影線的長(zhǎng)條表示同側(cè)睪丸，空白長(zhǎng)條表示對(duì)側(cè)睪丸。與對(duì)照組相比★P＜0.05；與同組對(duì)側(cè)睪丸相比，#P＜0.05；與扭轉(zhuǎn)復(fù)位組同側(cè)睪丸相比，§P＜0.05。

2.3睪丸生精功能 與對(duì)照組比較，扭轉(zhuǎn)復(fù)位組同側(cè)睪丸的重量、曲細(xì)精管直徑、生精細(xì)胞層數(shù)及Johnsen評(píng)分顯著降低（P＜0.05）；與扭轉(zhuǎn)復(fù)位組同側(cè)睪丸比較，清除活性氧組同側(cè)睪丸的上述4個(gè)指標(biāo)明顯升高（P＜0.05）；3組對(duì)側(cè)睪丸的這些指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；見圖2和3。

圖2　三組睪丸的（A）重量，（B）曲細(xì)精管直徑，（C）生精細(xì)胞層數(shù)和（D）Johnsen評(píng)分。影線長(zhǎng)條表示同側(cè)睪丸，空白長(zhǎng)條表示對(duì)側(cè)睪丸。與對(duì)照組比較，★P＜0.05；與同組對(duì)側(cè)睪丸比較，#P＜0.05；與扭轉(zhuǎn)復(fù)位組同側(cè)睪丸比較，§P＜0.05

圖3　三組睪丸的組織學(xué)所見。（A）對(duì)照組雙側(cè)睪丸，扭轉(zhuǎn)復(fù)位組與清除活性氧組對(duì)側(cè)睪丸均顯示正常的曲細(xì)精管直徑﹑生精細(xì)胞層數(shù)和生精細(xì)胞分化，可見較多成熟的精子（箭頭所指處）。生精上皮在管腔中央留下一空腔。（B） 扭轉(zhuǎn)復(fù)位組同側(cè)睪丸顯示曲細(xì)精管直徑縮小，生精細(xì)胞層數(shù)減少。生精細(xì)胞僅發(fā)育到圓形精子細(xì)胞階段（箭頭所指處），未見成熟的精子。（C）清除活性氧組同側(cè)睪丸呈現(xiàn)幾乎正常的睪丸組織特征，有較多成熟精子（箭頭所指處）。但管腔中央可見脫落的生精上皮，容易堵塞管腔。圖片均蘇木素-伊紅染色，放大200倍

3　討論

本資料中，大鼠經(jīng)歷1h的睪丸扭轉(zhuǎn)，復(fù)位后仍然存活，但復(fù)位后3個(gè)月，生精功能嚴(yán)重破壞。TRF2是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控生精細(xì)胞特異基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)生精細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要［2］。缺乏TRF2基因的成年雄性小鼠睪丸重量減輕50%，曲細(xì)精管直徑縮小20%～30%，管中僅有精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞，缺乏成熟的精子［2］。本資料結(jié)果顯示：?jiǎn)蝹?cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位引起同側(cè)睪丸TRF2表達(dá)明顯降低，生精功能嚴(yán)重?fù)p傷，表現(xiàn)為睪丸重量減輕，曲細(xì)精管直徑縮小，生精細(xì)胞發(fā)育停止在圓形精子細(xì)胞階段，未見成熟的精子。因TRF2表達(dá)對(duì)精子發(fā)生必不可少，單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后同側(cè)睪丸TRF2表達(dá)降低可能是生精功能損傷的原因之一。

睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后的損傷是缺血再灌注損傷。睪丸缺血再灌注導(dǎo)致活性氧（如過氧化氫、羥自由基、超氧陰離子等）過量產(chǎn)生［1］。已有研究認(rèn)為［1］：注入活性氧清除劑超氧化物歧化酶和過氧化氫酶可以減輕睪丸的缺血再灌注損傷，表明活性氧是引起睪丸損傷的原因。但活性氧通過何種分子機(jī)制損傷睪丸生精功能仍不明確。活性氧是高反應(yīng)氧化劑，很難直接測(cè)定。丙二醛是活性氧的穩(wěn)定末端產(chǎn)物，被認(rèn)為是活性氧的可靠標(biāo)志。本資料中，扭轉(zhuǎn)復(fù)位組同側(cè)睪丸的丙二醛水平明顯升高，表明睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后活性氧過量產(chǎn)生?；钚匝蹩梢酝ㄟ^調(diào)控基因表達(dá)影響細(xì)胞分化和凋亡［3］。

單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位是否對(duì)對(duì)側(cè)睪丸產(chǎn)生不利影響，目前存在爭(zhēng)議。研究發(fā)現(xiàn)單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位通過神經(jīng)反射等機(jī)制導(dǎo)致對(duì)側(cè)睪丸損傷［4］，但另外一些研究未發(fā)現(xiàn)同樣結(jié)果［5］。本資料，單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位引起同側(cè)睪丸的丙二醛水平、TRF2表達(dá)和生精功能發(fā)生明顯變化，但對(duì)側(cè)睪丸無顯著改變。表明單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位未引起對(duì)側(cè)睪丸損傷。睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后過量產(chǎn)生的活性氧通過下調(diào)TRF2表達(dá)導(dǎo)致生精功能損傷。其可能是睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后生精功能損傷的機(jī)制之一。本資料結(jié)果也鼓勵(lì)使用活性氧清除劑減輕睪丸損傷。

1 Lysiak JJ， Nguyen QA， Turner TT. Peptide and nonpeptide reactive oxygen scavengers provide partial rescue of the testis after torsion. J Androl， 2002，23（3）：400～409.

2 Zhang D， Penttila TL， Morris PL， et al. Spermiogenesis deficiency in mice lacking the Trf2 gene. Science， 2001， 292（5519）：1153～1155.

3 Tien Kuo M， Savaraj N. Roles of reactive oxygen species in hepatocarcinogenesis and drug resistance gene expression in liver cancers. Mol Carcinog，2006，45（9）：701～709.

4 Karaguzel E， Kadihasanoglu M， Kutlu O. Mechanisms of testicular torsion and potential protective agents. Nat Rev Urol， 2014， 11（7）：391～399.

5 ?ayan S， Saylam B， Tiftik N， et al. Rho-kinase levels in testicular ischemiareperfusion injury and effects of its inhibitor， Y-27632， on oxidative stress，spermatogenesis， and apoptosis. Urology， 2014， 83（3）： 675，e13～18

Objective This study investigated whether overproduction of ROS after testicular torsion-detorsion injures spermatogenesis by regulating TRF2 expression. Methods Sixty adult male Sprague-Dawley rats were divided into three groups of 20 rats each. Control group received a sham operation of left testis. Torsion-detorsion group underwent 1 hour of left testicular torsion. Scavenging ROS group received same operation as torsion-detorsion group，but superoxide dismutase and catalase，two ROS scavengers，were given intravenously at detorsion. Testes were harvested 4 hours or 3 months after detorsion to measure malondialdehyde level（a marker of ROS），TRF2 expression and spermatogenesis. Results Unilateral testicular torsion-detorsion signifi cantly increased malondialdehyde level，and reduced TRF2 expression and spermatogenesis in ipsilateral testes，suggesting that overgeneration of ROS after testicular torsion-detorsion might down-regulate TRF2 expression，leading to spermatogenic damage. In contrast，administration of superoxide dismutase and catalase significantly decreased malondialdehyde level，and increased TRF2 expression and spermatogenesis in ipsilateral testes. These results supported the above hypothesis. Conclusion Overproduction of ROS after testicular torsion-detorsion can damage spermatogenesis by down-regulation of TRF2 expression.

Testicular torsion-detorsion Reactive oxygen species TATA box-binding protein-related factor 2 Spermatogenesis

浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（2008B05）

310053 浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校