色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在N-亞硝胺類物質(zhì)分析中的應(yīng)用

梁旭鋒 黃杰 李宗芮 張雪琰 孫志廣

（山東出入境檢驗(yàn)檢疫局 山東青島 266002）

色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在N-亞硝胺類物質(zhì)分析中的應(yīng)用

梁旭鋒 黃杰 李宗芮 張雪琰 孫志廣

（山東出入境檢驗(yàn)檢疫局 山東青島 266002）

介紹了N-亞硝胺類物質(zhì)的分析技術(shù)現(xiàn)狀，并按照不同基質(zhì)，對近年來色質(zhì)聯(lián)用（主要是液相色譜-質(zhì)譜和氣相色譜-質(zhì)譜）技術(shù)在N-亞硝胺類物質(zhì)分析中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；N-亞硝胺；應(yīng)用；綜述

1 前言

N-亞硝胺（N-Nitrosamines）是含有-N-N=O官能團(tuán)物質(zhì)的總稱，它們的化學(xué)通式為：R1（R2）=NN=O。當(dāng)R1=R2=烷基時(shí)，稱為亞硝胺；當(dāng)R1（或R2）=酰基時(shí)，稱為亞硝酰胺。在人類接觸的很多生活用品中，如橡膠制品、乳膠制品、食物、化妝品等，都能發(fā)現(xiàn)N-亞硝胺及其前體。N-亞硝胺的強(qiáng)致癌作用早已被確認(rèn)，自20世紀(jì)50年代，國內(nèi)外便開始研究N-亞硝胺類物質(zhì)的危害性，研究表明N-亞硝胺不僅可以通過呼吸道、消化道進(jìn)入人體，也可以通過皮膚的吸收進(jìn)入體內(nèi)誘發(fā)癌癥，還能通過遺傳導(dǎo)致后代畸變。為了去除這些環(huán)境污染物，就需要研究建立針對不同基質(zhì)中N-亞硝胺類物質(zhì)的檢測技術(shù)。本文主要介紹了N-亞硝胺類物質(zhì)在不同基質(zhì)中的來源及檢測方法。

2 N-亞硝胺物質(zhì)分析技術(shù)現(xiàn)狀

近年來，國內(nèi)外報(bào)到了大量用于N-亞硝胺類物質(zhì)檢測的技術(shù)，如熱能分析儀（TEA）、氮磷檢測器（NPD）、氫火焰離子化檢測器（FID）、電子捕獲檢測器（ECD）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC/MS）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC/MS）等。由于痕量揮發(fā)性N-亞硝胺的測定是一項(xiàng)困難而又耗時(shí)的工作，目前常規(guī)的檢測手段難以全面鑒別各種N-亞硝胺，因此建立和完善N-亞硝胺類物質(zhì)的檢測方法已成為分析界的熱點(diǎn)之一。

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是將色譜的高分離能力和質(zhì)譜的定性功能相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定量和定性分析，它充分體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜的優(yōu)勢互補(bǔ)。隨著儀器的發(fā)展，色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在分析測試領(lǐng)域中發(fā)揮著越來越重要的作用，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS），液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）逐漸成為應(yīng)用最多的檢測手段。GC-MS具有操作條件穩(wěn)定、使用方法成熟、分析速度快、檢測靈敏度高的特點(diǎn)，可同時(shí)完成待測組分的分離和鑒定，特別適用于多組分混合物未知組分的定性和定量分析，適用于小分子、易揮發(fā)和熱穩(wěn)定的化合物分析。LC-MS融合了LC的高分離能力和MS的高靈敏度、極強(qiáng)的定性專屬性，幾乎能檢測所有的化合物，包括強(qiáng)極性、低揮發(fā)度、高分子量或熱不穩(wěn)定性的化合物，且大大縮短了分析時(shí)間，提高了分析的靈敏度和準(zhǔn)確性，實(shí)現(xiàn)了定性分析和定量檢測的完美結(jié)合，能廣泛應(yīng)用于N-亞硝胺類物質(zhì)的分析。目前國內(nèi)外針對N-亞硝胺類物質(zhì)的研究主要有如下幾類。

表1　已確定檢出的N-亞硝胺類物質(zhì)

3 色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在N-亞硝胺類物質(zhì)分析中的應(yīng)用

目前，色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在市場常規(guī)檢測及實(shí)驗(yàn)室研究領(lǐng)域的運(yùn)用越來越廣泛和重要，它既發(fā)揮了現(xiàn)代色譜對復(fù)雜樣品的高分離能力，又應(yīng)用了質(zhì)譜具有的高選擇性、高靈敏度以及能夠準(zhǔn)確提供化合物分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)［1］。

3.1橡膠制品分析

橡膠制品，尤其是與人體直接接觸的家用橡膠制品，對健康的影響已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，對其可能產(chǎn)生的有毒有害物質(zhì)，特別是致癌性很強(qiáng)的N-亞硝胺的研究、檢測以及相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的制定非常重要。橡膠制品中的N-亞硝胺主要來自以仲胺（如嗎啉、二異丙胺等）為基礎(chǔ)的硫化促進(jìn)劑和硫磺給予體，這些物質(zhì)與空氣或配合劑中的氮氧化物（NOX）反應(yīng)生成穩(wěn)定的N-亞硝胺［2］；大部分橡膠制品中檢出的N-亞硝胺主要來自添加或回收使用含有N-亞硝胺的橡膠原料。

日本學(xué)者M(jìn)otoh Mutsuga等［3］對橡膠奶嘴及安慰品中的NDMA、NDEA、NDiPA、NDPA、NDBA、NPIP、NPYR、NMOR、NEPhA、NMPhA、NDBzA、NDi-NA等多種N-亞硝胺遷移量進(jìn)行了檢測分析，建立的GC-MS方法操作簡單、耗時(shí)短、靈敏度高，滿足現(xiàn)行法規(guī)要求，可實(shí)現(xiàn)橡膠制品中N-亞硝胺類化合物的定性和定量，方法的檢出限為1.0-1.5 μg/kg，用該方法對橡膠樣品進(jìn)行測試，檢出NDMA、NDEA、NPIP、NMOR、NEPhA共5種N-亞硝胺，檢出量在2.1-15 μg/kg之間，NDBA、NDBzA及不溶于水和人工模擬液的N-亞硝胺沒有檢出。國家標(biāo)準(zhǔn)方法［4］采用GC-MS測定橡膠及彈性體材料中的NDMA、NMEA、NDEA、NPYR、NMPhA、NMOR、NDPA、NPIP、NEPhA、NDBA、NDPhA、NDBzA共12種N-亞硝胺含量，樣品于甲醇中超聲提取，經(jīng)旋轉(zhuǎn)、蒸發(fā)濃縮后過C18固相萃取小柱，加入甲醇洗脫，方法的檢出限為0.5 mg/kg。

陳婷等［5］建立了橡膠制品中NDMA、NMOR、NPYR、NMEA、NPIP、NDIP、NMPhA、NDPA、NEPhA、NDBA、NDEA、NDPhA、NDBzA共13種N-亞硝胺的LC-MS/MS測定方法，樣品在密閉萃取瓶中于60℃下用甲醇超聲萃取30 min，C18固相萃取小柱對萃取液進(jìn)行凈化，經(jīng)C18色譜柱分離，最后用電噴霧正離子（ESI+）和多重反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）對13種N-亞硝胺進(jìn)行定性、定量測定。各組分的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=7）小于10%，在實(shí)際樣品中的加標(biāo)回收率為70.7%-117.0%，方法的檢出限（LOD）為0.5-500 μg/kg。該方法的樣品前處理簡單，后續(xù)分離、測定時(shí)間短，適于橡膠制品中多種N-亞硝胺的同時(shí)測定。通過對橡膠鞋（鞋底）、抗震墊、奶嘴等樣品進(jìn)行測定，結(jié)果表明，雖然樣品中所含N-亞硝胺的化學(xué)組分有差異，但所有測試樣品中均檢出N-亞硝胺，且含量均高于歐盟或我國對橡膠、彈性體材料中N-亞硝胺的限量。

3.2乳膠制品分析

乳膠由于其優(yōu)良的物理性能，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療及工業(yè)領(lǐng)域，是世界上廣泛使用的原材料之一。1980年，Preussmann發(fā)現(xiàn)嬰兒奶嘴含有揮發(fā)性的N-亞硝胺，可遷移到唾液中。近年來隨著儀器發(fā)展和分析方法的改進(jìn)，醫(yī)用手套、避孕套等乳膠制品中也檢測到N-亞硝胺。歐盟2012/160/EU號決議要求，供6個月以下兒童使用或可放入口內(nèi)的玩具，其亞硝胺及亞硝基物質(zhì)遷移限制分別＜0.05 mg/kg及≤1 mg/kg。

GC-MS是乳膠制品中N-亞硝胺物質(zhì)監(jiān)測的主要手段。鮮啟明等［6］使用GC-MS法檢測了市場常見的奶嘴、醫(yī)用手套、避孕套等乳膠制品中NDEA、NDPA、NPIP、NDBA、NDPhA共5種N-亞硝胺析出物，樣品經(jīng)二氯甲烷萃取，用Rtx-5MS石英毛細(xì)管柱分離，采用十二烷作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行檢測計(jì)算，NDEA、NDPA、NPIP、NDBA的方法檢出限分別為2.0、5.0、10.0、1.0、112.0 μg/L，試驗(yàn)樣品中NDPA、NPIP、NDBA、NDPhA都有檢出。

李丕等［7］建立了同時(shí)測定乳膠兒童用品中NDMA、NMEA、NDEA、NDiPA、NMPhA、NMOR、NDPA、NPIP、NEPhA、NDiBA、NDBA、NDPhA、NDCHA、NDBzA、NdiNA共15種N-亞硝胺及其前體物遷移量的SPE-GC-MS/MS分析方法。以人工唾液作為遷移模擬物，以Chromabond Easy固相萃取柱對遷移液中的N-亞硝胺分析物進(jìn)行凈化，采用HP-5MS UI色譜柱分離，MS/MS在多反應(yīng)監(jiān)測模式下進(jìn)行定性及定量分析，方法的靈敏度滿足相關(guān)產(chǎn)品法規(guī)的要求。在低、中、高3個添加水平的回收率為53.8%-116.2%、52.7%-105.1%和49.5%-102.9%。對10件奶嘴實(shí)際樣品分析中，有4件檢出N-亞硝胺，其中3件含量超過0.05 mg/kg；分析的7件氣球樣品均檢出N-亞硝胺，且含量遠(yuǎn)超過0.05 mg/kg的限量要求。

3.3水質(zhì)分析

在給水處理和污水處理中，氯化消毒是傳統(tǒng)的有效方法，但消毒過程中，鹵素元素（主要是氯）會和水中一些天然有機(jī)物反應(yīng)生成一些有害環(huán)境和人體的物質(zhì)。NDMA就是水處理領(lǐng)域新發(fā)現(xiàn)的一種氯化消毒副產(chǎn)物，是一種極具代表性的N-亞硝胺類物質(zhì)［8］。作為一種低濃度高致癌風(fēng)險(xiǎn)的消毒副產(chǎn)物，近年來這類化合物在水環(huán)境中的高檢出率引起人們的廣泛重視。

水中低濃度的N-亞硝胺檢測是目前環(huán)境分析研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，目前大都使用GC-MS聯(lián)用方法。臺灣學(xué)者Ssu-Chieh Fu等［9］研究了NDMA、NDEA、NMEA、NDPA、NDBA共5種N-亞硝胺的GC-MS檢測技術(shù)。樣品采用微固相萃取技術(shù)，提取條件是以CarboxenTM 1003作為吸附劑，在50 mL水樣中（pH=7.0）加入5%的氯化鈉溶液，振蕩提取20 min，用150 mL二氯甲烷洗脫收集N-亞硝胺。方法定量限＜0.9 ng/L，樣品平均回收率為62%-109%。優(yōu)化的方法應(yīng)用于實(shí)際樣品的篩查，對游泳池中的水樣分析顯示，NDMA的濃度最高，濃度達(dá)到100 ng/L。

日本學(xué)者Suchul Yoon等［10］建立了污水、最終排放廢水等一系列污水中NDMA、NDEA、NMEA、NMOR、NDPA、NPYR、NPIP、NDBA共8種N-亞硝胺的GC-MS/MS檢測方法。樣品經(jīng)過固相萃取和凈化后能有效分離目標(biāo)化合物，該法可避免前處理過程中N-亞硝胺的丟失，提高回收率。方法檢出限為0.1-1.0 ng/L，定量限為0.4-3.3 ng/L，回收率為80%-131%。采用SPE前處理方法對二級污水進(jìn)行測試，除了NMEA和NDPA外，其余6種N-亞硝胺都被檢出，濃度為1-1057 ng/L。

UPLC-MS/MS可以檢測飲用水和污水中NDMA等熱不穩(wěn)定的N-亞硝胺類化合物，彌補(bǔ)GC/ MS的不足。羅茜等［11］建立了UPLC-MS/MS快速測定飲用水中NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NMOR、NPYR、NPIP、NDBA、NDPhA共9種N-亞硝胺的新方法。以N-二甲基亞硝胺-d6為貯存和回收率內(nèi)標(biāo)，N-亞硝基二丙胺-d14為定量內(nèi)標(biāo)，采用直接進(jìn)樣方法對N-二甲基亞硝胺（NDMA）定性和定量檢測限分別為0.1和1.0 ng/L，N-亞硝基二丙胺為2.5和10 ng/L，其他7種N-亞硝胺的定性和定量檢測限均為0.5和2.0 ng/L，方法中N-亞硝胺的檢測限低于美國環(huán)保局規(guī)定的水中的最大允許濃度。檢測數(shù)據(jù)表明，在自來水廠處理后出廠水中，3種具有高致癌風(fēng)險(xiǎn)N-亞硝胺化合物中NDMA的濃度為3.5 ng/L，NMEA和NDEA均未檢出。

3.4肉制品分析

亞硝酸鹽和硝酸鹽廣泛應(yīng)用于肉制品加工過程中，它們能賦予肉制品理想的顏色、紋理、脂質(zhì)過氧化，特別是在預(yù)防肉毒梭菌毒素形成方面發(fā)揮作用。亞硝酸鹽能夠與胺和氨基酸反應(yīng)生成N-亞硝胺，可誘發(fā)有機(jī)體突變，對神經(jīng)和腎臟有害，是致癌、致突變、致畸物質(zhì)。GC-MS和LC-MS均可用于肉制品中N-亞硝胺的分析。

臺灣學(xué)者M(jìn)an-Chun Huang等［12］建立了熏肉、火腿、豬肉香腸等肉制品中NDMA、NMEA、NDEA、NPYR、NDPA、NPIP、NDBA共7種N-亞硝胺的GC-MS檢測方法，樣品采用微波輔助萃取與微固相萃取相結(jié)合。取5 g均質(zhì)的肉制樣品放在30 mL濃度為0.025 mol/L的氫氧化鈉溶液中，在100℃下微波萃取10 min；萃取液過100 mg的CarboxenTM固相萃取柱，洗脫液振蕩30min，用200μL二氯甲烷溶液洗脫，取10 mL上樣。方法定量限為0.03-0.36 ng/g。

敘利亞學(xué)者M(jìn)ohammad Al-Kaseem等［13］建立了貝類罐頭、鹽腌肉、午餐肉、熏制肉等肉制品中NDMA、NMEA、NDEA、NPYR、NDPA、NPIP、NDBA

共7種揮發(fā)性N-亞硝胺的GC-MS檢測方法，將樣品放入高壓滅菌鍋中于121℃條件處理10 min，用二氯甲烷液液萃取。方法檢出限為0.077-0.18 ppb，定量限為0.26-0.60 ppb，采用高壓滅菌法為肉制品前處理分析研究提供重要的借鑒。Mohammad Al-Kaseem等［14］在快餐店中的肉類樣品里檢出上述7種N-亞硝胺的總含量在2.60-13.28 μg/kg之間。

丹麥學(xué)者S.S.Herrmann等［15］采用LC-（APCI/ESI）MS/MS測定意大利香腸、培根等肉制品中NHPRO、NSAR、NMDA、NPRO、NMOR、NMEA、NPYR、NDEA、NPIP、NDPA、NMA、NDBA、NDBzA、NTCA、NMTCA共15種亞硝胺，方法回收率在50%-130%，8種揮發(fā)性N-亞硝胺和6種非揮發(fā)性N-亞硝胺的定量限為0.1-36.8 μg/kg。該方法具有較普遍的實(shí)用性，可以滿足肉制品中N-亞硝胺物質(zhì)分析，在對市場銷售的亞硝胺鹽腌制肉制品進(jìn)行檢測中發(fā)現(xiàn)NDMA、NPYR、NMA、NPRO、NTCA、NMTCA等N-亞硝胺，而在非亞硝胺鹽腌制的肉制品中沒有檢出。

3.5化妝品分析

化妝品中的N-亞硝胺一部分來自原料，另一部分則是在制作和放置過程中由前體物質(zhì)經(jīng)亞硝化形成。皮膚接觸含有N-亞硝胺的化妝品后，在尿液中能夠檢出該成分，說明化妝品中的N-亞硝胺可對人體健康構(gòu)成潛在危害，因此嚴(yán)禁在化妝品中添加N-亞硝胺。

化妝品中N-亞硝胺物質(zhì)的檢測主要采用GCMS方法。馬強(qiáng)等［16］建立了GC-MS/MS法檢測膏霜、水劑、散粉、香波、唇膏等不同類型的化妝品樣品中NDMA、NDEA、NDPA、NMOR、NPYR、NPIP、NDBA、NDPhA、NDCHA、NDBzA共10種N-亞硝胺類物質(zhì)。不同樣品經(jīng)適宜的提取溶劑超聲提取，用DB-624石英毛細(xì)管色譜柱分離，MRM模式檢測。10種揮發(fā)性N-亞硝胺的方法定量限為2.5-10 mg/kg。

4 結(jié)束語

綜上所述，色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在N-亞硝胺類物質(zhì)分析中以GC/MS方法為主，LC/MS方法相對較少。前處理方法主要采用有機(jī)溶劑配合超聲提取，凈化方法以SPE為主，在檢測中，多采用串聯(lián)質(zhì)譜方法。隨著色譜分離技術(shù)和質(zhì)譜檢測能力的提高，色質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在定量分析及未知物篩查等研究領(lǐng)域會有更廣泛的應(yīng)用。

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Application of Chromatography-Mass Spectrometry Technique in N-nitrosamines Analysis

Liang Xufeng，Huang Jie，Li Zongrui，Zhang Xueyan，Sun Zhiguang
（Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao，Shandong，266002）

This study introduces the current situation of N-nitrosamines analysis.According to the different substrates,the application of chromatography-mass spectrometry technique which mainly includes liquid chromatography-mass spectrometry and gas chromatography-mass spectrometry in the N-nitrosamines analysis were reviewed in recent years.

Chromatography-Mass Spectrometry；N-Nitrosamines；Application；Review

O657.63

E-mail：liangxf_100@163.com

山東出入境檢驗(yàn)檢疫局科研計(jì)劃項(xiàng)目（SK201312）

2015-02-04