水產(chǎn)品中霍亂弧菌可視化環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的建立及應(yīng)用

胡興娟 沈飚 周秀錦 邵宏宏 張靜 朱應(yīng)偉

（舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局 浙江舟山 316000）

水產(chǎn)品中霍亂弧菌可視化環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測方法的建立及應(yīng)用

胡興娟 沈飚 周秀錦 邵宏宏 張靜 朱應(yīng)偉

（舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局 浙江舟山 316000）

利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)建立一種快速檢測水產(chǎn)品中霍亂弧菌的方法。針對霍亂弧菌ctxA基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，利用鈣黃綠素建立可視化環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增檢測體系，研究其特異性與靈敏性。結(jié)果表明，含ctxA基因的霍亂弧菌可得到特異性擴(kuò)增，而其他與霍亂弧菌（含ctxA基因）共存于海產(chǎn)品中的7種細(xì)菌均未得到擴(kuò)增，DNA檢測下限為81 fg/μL。用建立的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法對150份水產(chǎn)品進(jìn)行檢測，檢出2份陽性樣本，與PCR結(jié)果一致。該方法對實(shí)驗(yàn)儀器和操作人員的要求低，具有良好的實(shí)用性，可用于水產(chǎn)品中霍亂弧菌的檢測。

霍亂弧菌；環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法（LAMP）；可視化；ctxA；檢測

1 前言

霍亂弧菌（vibrio cholera，vc）是一類重要的食源性致病菌，能引起急性腸道傳染病，在全球爆發(fā)了多次大規(guī)模的疫情，直接危害人類的健康。霍亂弧菌檢測已成為食品安全的重要指標(biāo)，目前國內(nèi)外霍亂弧菌的檢測方法有：經(jīng)典的培養(yǎng)生化鑒定法、PCR-凝膠電泳法、實(shí)時熒光PCR法、基因指紋圖譜分析法等［1］。盡管檢測方法有很多，但各種方法都存在其自身的優(yōu)勢和局限性。因此，開發(fā)一種簡便、特異、靈敏度好、價廉，適用于基層推廣的檢測方法，對霍亂弧菌的監(jiān)控將起到積極作用。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是近年來發(fā)展出的一種敏感、特異、方便快捷的核酸擴(kuò)增技術(shù)。目前，該技術(shù)在食源性致病菌的檢測中已有研究應(yīng)用報道［2］。但大多數(shù)的研究者依然采用電泳法對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測［3］，或采用核酸染料SYBR Green進(jìn)行顯色［4］，都需開蓋檢測，這就不可避免的造成氣溶膠污染。鈣黃綠素（Calcein）是一種熒光螯合劑，Tomita等［5］將該試劑作為反應(yīng)指示劑首次應(yīng)用于LAMP技術(shù)，該方法不需后續(xù)的電泳或顯色，反應(yīng)結(jié)束后就可直接通過反應(yīng)產(chǎn)物的顏色變化判斷檢測結(jié)果，操作更簡單，結(jié)果更可靠，有效避免了產(chǎn)物污染及假陽性問題。

為此，本研究針對霍亂弧菌ctxA基因設(shè)計(jì)LAMP引物，利用鈣黃綠素的熒光顯色指示劑作用，建立了可視化的霍亂弧菌LAMP檢測體系。為快速檢測霍亂弧菌，有效預(yù)防及控制霍亂弧菌感染奠定基礎(chǔ)。

2 材料和方法

2.1材料

2.1.1菌株

大腸桿菌（E.coli，ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 6538）、副溶血弧菌（V.Parahaemolyticus，ATCC 17802）：購自廣東環(huán)凱微生物研究所；非O1/O139霍亂弧菌分離株H4-3（V.choerae non-O1/O139，H4-3）、溶藻弧菌分離株（V.alginolyticus，V.alg）、擬態(tài)弧菌分離株（V.minicus，V.m）、創(chuàng)傷弧菌分離株（Vibrio vulnificus，V.v）：均由舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局水產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)室保存。

2.1.2試劑

營養(yǎng)瓊脂、緩沖蛋白胨水（BPW）、堿性蛋白胨水（APW）：購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒：購自invitrogen公司；DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000：寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；10× Thermopol reaction buffer、Bst DNA polymerase 8U：購自New England Biolab；甜菜堿（Betaine）、氯化錳：購自sigma公司；dNTPs：購自TaKaRa公司；瓊脂糖（Agarose）、溴化乙錠（EB）染料：購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

2.1.3主要儀器

NanoDrop ND-100分光光度計(jì)：美國NanoDrop科技公司；恒溫震蕩金屬浴：杭州博日科技有限公司；PCR擴(kuò)增儀：美國ABI公司；凝膠成像系統(tǒng)：美國GE公司；電泳儀：Bio-Rad公司。

2.2方法

2.2.1細(xì)菌基因組DNA的提取

將供試菌株于增菌培養(yǎng)基（弧菌以堿性蛋白胨水培養(yǎng)，其他菌株以緩沖蛋白胨水培養(yǎng)）中培養(yǎng)，按照試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA，建立參考菌株DNA模板庫，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2引物的設(shè)計(jì)與合成

針對霍亂弧菌ctxA基因，設(shè)計(jì)特異性引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1　擴(kuò)增ctxA基因的LAMP引物序列

2.2.3LAMP反應(yīng)體系

LAMP擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25 μL：內(nèi)引物（FIP和BIP）各1.6 μmol/L，外引物（F3和B3）各0.2 μmol/L，1×Thermopolreaction buffer的成分為20 mmol/L Tris-HCl（pH8.8），10 mmol/L KCl2，10 mmol/L（NH4）2SO4，2 mmol/L MgSO4，0.1%Triton X-100；Bst DNA polymerase 8U；4 mmol/L的MgCl2；0.8 mol/L的Betaine；1.4 mmol/L的dNTPs；0.5 mmol/LMnCl2；0.05 mmol/L Calcein；Template DNA2 μL，其余用雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。檢測體系在65℃反應(yīng)60 min，最后在80℃加熱10 min，滅活Bst DNA polymerase終止反應(yīng)。

2.2.4陽性與陰性判定

肉眼觀察產(chǎn)物顏色變化，出現(xiàn)明顯綠色判定為陽性，橙色為陰性，橙綠色則再次取LAMP擴(kuò)增，觀察顏色變化；或通過2%瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶是否出現(xiàn)，電泳條帶明顯者判定為陽性，不明顯者判定為陰性。

2.2.5特異性試驗(yàn)

采用建立的可視化LAMP檢測體系分別對霍亂弧菌O139、副溶血弧菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、擬態(tài)弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌H4-3菌株DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，根據(jù)顯色反應(yīng)觀察結(jié)果，檢驗(yàn)方法的特異性。

2.2.6靈敏度試驗(yàn)

應(yīng)用Nano DropND-100分光光度計(jì)測定霍亂弧菌O139基因組DNA含量，10倍倍比稀釋基因組DNA原液至稀釋為10-1～10-7，分別取10-2～10-7的基因組DNA 2 μL作為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，分析其靈敏度。

2.2.7樣品檢測

將150份各類水產(chǎn)品前處理預(yù)增菌后，提取細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增和檢測，同時被檢水產(chǎn)品樣品按照PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證，以驗(yàn)證LAMP方法的可靠性和實(shí)用性。

3 結(jié)果與分析

3.1LAMP擴(kuò)增特異性試驗(yàn)結(jié)果

特異性檢測結(jié)果見圖1a，霍亂弧菌O139基因組LAMP擴(kuò)增出ctxA靶基因，反應(yīng)管顏色變?yōu)榫G色，其余7株其他菌株均未檢測出ctxA基因，顏色沒有發(fā)生變化，仍為淡橙色。電泳圖見圖1b。

圖1　ctxA基因的LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果

3.2LAMP擴(kuò)增靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

基因組DNA含量檢測結(jié)果顯示，霍亂弧菌0139基因組DNA含量為8.1 ng/μL。10倍倍比稀釋DNA原液進(jìn)行LAMP檢測，結(jié)果如圖2a所示，隨著菌液濃度的降低，生成顏色逐漸變淡（圖2a），其特異性條帶亮度也逐漸變?nèi)酰▓D2b），至稀釋度10-5時仍能快速有效地擴(kuò)增，10-5表明霍亂弧菌LAMP方法可擴(kuò)增稀釋至約81 fg/μL。

圖2　ctxA基因的LAMP靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

3.3樣品檢測應(yīng)用

利用建立的LAMP檢測方法對150份各類海產(chǎn)品進(jìn)行檢測，其中2份樣品檢出霍亂弧菌陽性（檢出率1.3%），該結(jié)果與PCR結(jié)果一致，明顯高于傳統(tǒng)方法。

表2　霍亂弧菌在樣品中的檢出情況

4 討論

目前國內(nèi)外霍亂弧菌的檢測方法盡管有很多，但各種方法都存在其自身的優(yōu)勢和局限性。常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定普及度廣，但是操作既耗時又繁瑣，同時由于細(xì)菌的生化特征相對不穩(wěn)定，給鑒定帶來了很大的困難和不確定性，易發(fā)生漏檢現(xiàn)象；PCR技術(shù)雖具有特異性強(qiáng)，靈敏度高等優(yōu)勢，但成本較高、需要PCR儀等諸多不足而限制了其在現(xiàn)場和基層單位的應(yīng)用；基因指紋圖譜分析法所使用的檢測試劑盒非常昂貴。微生物學(xué)檢測工作者都不斷地致力于建立簡便、快捷、低廉的檢測分析方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)是由Notomi T［6］等人開發(fā)出來的一種新的核酸擴(kuò)增方法，它依賴于能夠識別靶DNA上6個特定區(qū)域的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下高效擴(kuò)增核酸，一般60 min內(nèi)完成檢測，大大提高檢測工作效率［7，8］，具有高特異性、快速靈敏、高效、操作簡便等特點(diǎn)［9］，最大的優(yōu)勢依然在于其擺脫了對貴重儀器設(shè)備的依賴［10］，僅僅依靠金屬浴或者水浴鍋即可完成檢測。國內(nèi)學(xué)者建立的霍亂弧菌LAMP檢測體系，在結(jié)果上或無法實(shí)現(xiàn)可視化，或釆用的可視化方法（幵蓋加顯色指示劑）容易造成污染的問題［11］。利用鈣黃綠素進(jìn)行顯色，可在體系反應(yīng)前加入，不需開蓋，是LAMP法中較好的DNA染料物質(zhì)［12］，可直接在白光下通過肉眼觀察是否產(chǎn)生綠色的鈣錳復(fù)合物來判斷靶基因存在與否，它比以往在白光下通過肉眼觀察是否有白色的焦磷酸鎂沉淀更易于判斷。

霍亂弧菌的致病因子主要是霍亂腸毒素（CT），由產(chǎn)毒型霍亂弧菌霍亂毒素基因（Cholera toxin gene，ctx）所編碼的，是目前已知的致瀉性毒素中最為強(qiáng)烈的毒素，是腸毒素的典型代表?；魜y毒素基因（ctx）被認(rèn)為具有相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦?。因此本文通過針對霍亂毒素基因的其中一個亞單位ctxA基因設(shè)計(jì)了特異性的引物。結(jié)果表明，通過對不同細(xì)菌DNA模版進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，只有霍亂弧菌O139反應(yīng)管顏色變?yōu)榫G色，其余7種細(xì)菌反應(yīng)管顏色均未發(fā)生變化，仍為淺橙色，同電泳試驗(yàn)結(jié)果一致。通過靈敏度試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，最低檢測濃度可達(dá)81 fg/μL，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報道的檢測下限36.1 fg/μL［13］的基因組DNA基本相符。為進(jìn)一步評價該方法的可行性及效果，對150份水產(chǎn)樣本進(jìn)行檢測，霍亂弧菌檢出率1.3%，檢出率與PCR結(jié)果一致，比傳統(tǒng)生化方法高。這是由于霍亂弧菌在某些不適合生長的條件下，可形成不可培養(yǎng)狀態(tài)［14］，利用LAMP檢測方法比傳統(tǒng)的富集培養(yǎng)法更具有優(yōu)勢。

5 結(jié)論

本研究建立的可視化LAMP方法，不依賴任何專門的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，操作簡單、所需模板量少、特異性強(qiáng)及可以快速獲得大量特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果觀察結(jié)合顯色反應(yīng)，直觀準(zhǔn)確，整個檢測費(fèi)用低，適合在廣大基層實(shí)驗(yàn)室開展應(yīng)用。

［1］紀(jì)惠玲，郭燕.霍亂弧菌分子生物學(xué)檢測方法概述［J］.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜，2007，17（1）：181-183.

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Establishment and Application of Visual Loop-mediated Amplification Assay on Vibrio Cholera in Aquatic Product

Hu Xingjuan,Shen Biao,Zhou Xiujin,Shao Honghong,Zhang Jing,Zhu Yingwei
（Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Zhoushan，Zhejiang，316000）

In order to rapidly detect vibrio cholera in aquatic product,a visual loop-mediated isothermal amplification（LAMP）assay was developed with calcein/Mn2+.A set of primers was selected and the specificity and sensitivity was tested.The results showed that V.cholera with ctxA gene was amplified with typical color,and 7 strains of other bacteria concurred with V.cholera was not amplified.The detection limitation of this method was 81 fg/μL for purified genomic DNA.Furthermore,a total of 150 samples were tested by the established method and the virulence ctxA gene was detected from 2 samples, which was accordant with the PCR.This assay was lowered requirement for instrument and operator, suggesting good practical applicability,and suitable for detecting vibrio cholera in aquatic product.

Vibrio cholera；Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）；Visual；ctxA Gene；Detection

R446.5

E-mail：hxj@zs.ziq.gov.cn

浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（ZK201337）

2015-01-27