RAFT一步聚合制備殼交聯(lián)藥物載體及其控釋研究

江國華，周慧婕，江騰騰，杜祥祥

（浙江理工大學(xué)，a.材料與紡織學(xué)院；b.啟新學(xué)院，杭州310018）

RAFT一步聚合制備殼交聯(lián)藥物載體及其控釋研究

江國華a，周慧婕b，江騰騰a，杜祥祥a

（浙江理工大學(xué)，a.材料與紡織學(xué)院；b.啟新學(xué)院，杭州310018）

通過可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT）一步聚合制備聚甲基丙烯酸二甲胺乙酯-b-聚苯乙烯（PDMAEMA-b-PS）殼交聯(lián)納米粒子（SCL-NPs），引入還原敏感性交聯(lián)劑雙（丙烯酰）胱胺（BAC）使得制備得到的藥物載體能在還原劑的作用下發(fā)生解聚；在制備SCL-NPs的過程中加入吲哚美辛（IND）來制備負(fù)載吲哚美辛的SCL-NPs（SCLNPs-IND）。用傅里葉變換紅外分光光度計、核磁共振波譜儀、透射電子顯微鏡、動態(tài)光散射納米粒度分析儀對SCLNPs的結(jié)構(gòu)形貌和性能進行表征，發(fā)現(xiàn)SCL-NPs具有明確的核殼結(jié)構(gòu)并且粒徑均一；并采用紫外-可見分光光度計對SCL-NPs-IND藥物釋放性能進行研究，結(jié)果表明二硫蘇糖醇（DTT）能加速SCL-NPs-IND的藥物釋放，并且在堿性條件下的釋放速度大于酸性條件下的藥物釋放速度。

RAFT；殼交聯(lián)；藥物載體；還原敏感性；可控釋放

0　引 言

20世紀(jì)60年代至今，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注藥物控制釋放體系的研究。相對于傳統(tǒng)的給藥方式，藥物的控釋不僅可以提高藥物治療的有效性、安全性和準(zhǔn)確性，同時還能減少藥物對人體的毒副作用。目前，盡管有關(guān)藥物控釋的研究已有很多，但仍沒達到理想的要求，僅有少數(shù)被應(yīng)用到臨床上，因此研發(fā)理想的藥物控釋體系成為了研究熱點。由于藥物載體是藥物控釋體系的重要組成部分，也是影響藥效的主要因素，所以，制備性能良好的藥物載體也就成為了藥物控釋技術(shù)的核心內(nèi)容［1］。

完善已有的藥物載體合成方法和研發(fā)療效更好、選擇性更強的新型藥物載體材料從而達到理想的藥物控釋效果的藥物載體是目前的研究重點［1］。隨著藥物學(xué)、生物材料科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等學(xué)科的發(fā)展與交叉，以及人類不斷的提高在藥物方面的要求，有關(guān)高分子藥物載體的研究越來越被重視。當(dāng)高分子作為藥物的載體時，藥物的作用時間將增加、選擇性會有所提高、毒性也會降低，并且藥物還能夠被運送到體內(nèi)確定的部位（靶位）。在藥物釋放之后，高分子載體能夠排出或者在水解后被吸收，并不會在體內(nèi)長時間積累［2］。另外，可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合（reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization，RAFT）具有反應(yīng)要求低和反應(yīng)條件溫和的顯著優(yōu)點。當(dāng)反應(yīng)體系中加入鏈轉(zhuǎn)移常數(shù)較大的鏈轉(zhuǎn)移劑，不可逆的自由基聚合反應(yīng)將變?yōu)榭赡?，從而使得聚合反?yīng)可控［3］。目前已報道的往往都是不具有環(huán)境敏感性的交聯(lián)劑［4-10］，這樣制得的殼交聯(lián)藥物載體在藥物傳遞后不能進行解聚，將會影響細胞的代謝。本文采用RAFT聚合技術(shù)，在不提前合成大分子鏈轉(zhuǎn)移劑PDMAEMA的情況下，以S-1-十二烷基-S＇-（α，α＇-二甲基-α＂-乙酸）三硫代碳酸酯（DMP）、偶氮二異丁腈（AIBN）為引發(fā)劑，引入還原敏感性交聯(lián)劑雙（丙烯酰）胱胺（BAC），采用RAFT一步聚合的方法制備粒徑均一且能在還原劑的作用下發(fā)生解聚的殼交聯(lián)藥物載體，并對其進行藥物控釋研究。

1　試驗

1.1實驗材料與儀器

甲基丙烯酸二甲氨乙酯（DMAEMA，99%，購自比利時Acros Organics公司）；苯乙烯（St，CP，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；偶氮二異丁腈（AIBN，AR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；環(huán)己烷（AR，杭州高晶精細化工有限公司）；S-1-十二烷基-S＇-（α，α＇-二甲基-α＂-乙酸）三硫代碳酸酯（DMP，合成方案如文獻［11］中報道）、雙（丙烯酰）胱胺（BAC，合成方案如文獻［12］中報道）和去離子水，實驗室自制。

B-260恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；FD-1A-50冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；SHZ-B水浴恒溫振蕩器（金壇市宏凱儀器廠）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；AVANCE AV 400超導(dǎo)核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；Nicolet 5700傅里葉變換紅外分光光度計（美國Nicolet公司）；LB-550V動態(tài)光散射納米粒度分析儀（日本HORIBA公司）；JSM-2100透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）；U-3010紫外-可見分光光度計（日本Hitachi公司）。

1.2試驗方法

1.2.1SCL-NPs的制備

取1 mL環(huán)己烷（0.009 mol）加入0.05 g DMP（0.14 mmol）、0.008 g AIBN（0.05 mmol）、0.7 mL DMAEMA（3.9 mmol）、0.13ml St（1.1 mol）、10 mL H2O及0.0035 g BAC（0.01 mmol）的混合溶液中，攪拌若干分鐘使上述物質(zhì)溶解，之后將其轉(zhuǎn)移入長頸瓶中。然后置于液氮中冷凍，抽真空、通氮氣3次。對長頸瓶進行真空封管，將其移入75℃的油浴中反應(yīng)24 h。反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫后將其置于透析袋中透析24h，得到液態(tài)的SCL-NPs；另外，取一部分產(chǎn)物進行冷凍干燥得到粉末狀的SCL-NPs。

1.2.2SCL-NPs-IND的制備

SCL-NPs-IND的制備和1.2.1中SCL-NPs的制備過程相似，只需將0.10 mg IND溶于環(huán)己烷后加入其它試劑的混合溶液中。反應(yīng)結(jié)束后，得到負(fù)載IND的聚合物粉末（SCL-NPs-IND）。

1.2.3SCL-NPs-IND的藥物釋放

將0.03 g SCL-NPs-IND加入3 mL一定p H值的磷酸緩沖溶液（PBS）中，接著移入透析袋，將此透析袋放入藍口瓶并加入27 mL上述PBS。然后將藍口瓶置于水浴恒溫振蕩器中振蕩，溫度維持在37℃。PBS的p H分別為5.9、6.8和7.6，各p H值下加入的二硫蘇糖醇（DTT）的量分別為0 mM和10 m M。每組實驗進行3次，取平均值。

1.3表征方法

1.3.1傅里葉變換紅外分光光度計（FT-IR）

取部分粉末狀的SCL-NPs和適量KBr于瑪瑙研缽中混合研磨均勻后，壓片，制樣。用傅里葉變換紅外分光光度計測其紅外譜圖。

1.3.2核磁共振波譜儀（1H NMR）

先取適量樣品加入核磁管中，然后加入0.5 m L CDCl3，超聲使其溶解。在核磁共振波譜儀的工作頻率為400 MHz的情況下進行測定。

1.3.3動態(tài)光散射納米粒度分析儀（DLS）

取適量的樣品用水稀釋后，即可用動態(tài)光散射納米粒度分析儀進行測定。每個樣品測試3次，數(shù)據(jù)取平均值。

1.3.4透射電子顯微鏡（TEM）

取少量樣品液體用水進行稀釋，接著超聲波分散1h，然后用毛細管吸取少量分散液，滴在涂有碳膜的銅網(wǎng)（200目）上，室溫干燥后在加速電壓為200 k V的條件下進行觀察。

2　結(jié)果與討論

2.1SCL-NPs的合成討論

RAFT一步聚合制備具有核殼結(jié)構(gòu)并且粒徑均一的藥物載體。此制備過程中，略去合成大分子鏈轉(zhuǎn)移劑PDMAEMA的步驟，直接在合成SCLNPs的乳液體系中通過鏈轉(zhuǎn)移劑DMP引發(fā)DMAEMA均聚合成PDMAEMA穩(wěn)定劑；其中AIBN作為引發(fā)劑，引發(fā)St和BAEDS發(fā)生共聚，最終制得SCL-NPs。合成路線如圖1所示。

2.2樣品的核磁表征

圖2為SCL-NPs的1H NMR譜圖。如圖所示：-S-CH2-C-CH3基團上的亞甲基和甲基的質(zhì)子峰在δ=1.42 ppm和0.91 ppm處；-SCH-CH2-基團上亞甲基的質(zhì)子峰在δ=1.6 ppm處；在δ=2.0 ppm和2.3 ppm處各有一個單峰，分別對應(yīng)于（CH3）2-C-COOH基團和-CH2-N-（CH3）2基團上甲基的質(zhì)子峰；δ=3.68 ppm和2.54 ppm處各有一個單峰，對應(yīng)于-CH2-CH2-N-基團上亞甲基的質(zhì)子峰［13-14］。相比于PDMAEMA-b-PS的1H NMR譜圖［11］，SCL-NPs的1H NMR譜圖上δ=6～8 ppm處無特征峰，表明已成功制備SCL-NPs。原因在于：St和BAC可以通過共聚鍵連接在PDMAEMA穩(wěn)定劑上，則PDMAEMA-b-PS納米粒子的殼層將會發(fā)生交聯(lián)，從而阻礙PS鏈段的運動，這樣其鏈鍛上質(zhì)子氫的信息就無法被核磁檢測。由于CDCl3是PS的良溶劑，所以當(dāng)PS殼層未進行交聯(lián)時，核磁譜圖上就會出現(xiàn)PS的質(zhì)子氫的信息［14］。

圖1　殼交聯(lián)納米粒子的合成路線

圖2　SCL-NPs的氫核磁共振譜圖

2.3樣品的紅外表征

圖3為SCL-NPs的紅外譜圖。從圖中可以看出：3400 cm-1處的吸收峰歸屬于羧酸中-OH的伸縮振動，1125 cm-1處的特征吸收峰對應(yīng)于C-N的伸縮振動，1749 cm-1處的吸收峰屬于C=O的伸縮振動，波數(shù)位于1508和1486 cm-1處的特征吸收峰為苯環(huán)的伸縮振動，750和708 cm-1處的吸收峰為苯環(huán)的單取代的面外C-H的彎曲振動［13-15］，表明SCL-NPs已被成功制備。

圖3　SCL-NPs的紅外譜圖

2.4樣品的DLS表征

圖4為標(biāo)準(zhǔn)樣品SCL-NPs和SCL-NPs-IND的粒徑大小和粒徑分布曲線。在25℃的溫度下測試出該SCL-NPs的平均粒徑為90.44 nm，其分布系數(shù)PDI為26.3%；而負(fù)載IND后的SCL-NPs的平均粒徑為198.2 nm，其分布系數(shù)PDI為30.21%。從以上數(shù)據(jù)可看出SCL-NPs-IND的粒徑有所增加，約為SCL-NPs粒徑的兩倍。

圖4　SCL-NPs和SCL-NPs-IND在環(huán)己烷中分散的水動力直徑分布圖

2.5樣品形貌

圖5為SCL-NPs-IND（a）和SCL-NPs（b）的透射電子顯微鏡圖。由圖5可知：所有的樣品均為橢球形并且都具有明顯的核-殼結(jié)構(gòu)，且SCL-NPs的粒徑約為90 nm；負(fù)載IND之后，其粒徑增加至195 nm左右。與圖4中DLS表征結(jié)果基本吻合。

圖5　SCL-NPs-IND和SCL-NPs的透射電子顯微鏡圖

2.6SCL-NPs-IND的藥物釋放

SCL-NPs-IND的藥物釋放機理如圖6所示。DTT作為還原劑可以打開SCL-NPs的雙硫鍵，其交聯(lián)殼層發(fā)生解聚，從而促進藥物的釋放。當(dāng)p H＜7時，PDMAEMA鏈段被質(zhì)子化從而帶正電，由于同種電荷相互排斥，PDMAEMA鏈段將會處于舒展?fàn)顟B(tài)，IND需要經(jīng)過較長路程才能從SCL-NPs的核層遷移出來，即SCL-NPs在酸性條件下具有較小的藥物釋放速度。當(dāng)p H≥7時，在去質(zhì)子化的作用下PDMAEMA鏈段將塌縮在PS的交聯(lián)核層上并在一定程度上擠壓核層，則IND經(jīng)過相對較短的路程從SCL-NPs的核層遷移出來，即堿性條件下SCL-NPs具有較大的藥物釋放速度［16-18］。此外，IND在堿性條件下具有較強的溶解性，易于從SCLNPs的核層遷移出來［19］。

圖6　SCL-NPs-IND的藥物釋放機制示意圖

在SCL-NPs-IND的降解過程中，用紫外-可見分光光度計測試溶液在λ=320 nm處的吸光度，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出IND的釋放量。根據(jù)文獻報道［20］，IND的濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)方程為：

其中：A為紫外分光光度計在320 nm處測得的吸光度；C為溶液中IND的濃度（mg/mL）。

圖7為SCL-NPs-IND在不同緩釋條件下的藥物釋放曲線。從A、B、C圖中可以看出，藥物的釋放具有p H敏感性并且DTT可以促進其釋放。經(jīng)過55 h的藥物釋放，在緩釋介質(zhì)中無DTT存在的情況下，SCL-NPs-IND在不同p H值時的藥物釋放率分別為：37%（p H=5.9）、42%（p H=6.8）、51%（p H=7.6）；向緩釋介質(zhì)中加入10 mM DTT后，SCL-NPs-IND隨p H值的增大不僅緩釋速度顯著加快，而且藥物釋放率也有所增加，分別為：55%（p H=5.9）、63%（p H=6.8）、72%（p H=7.6）。其中，在p H=7.6且緩釋介質(zhì)中含DTT的條件下的SCL-NPs-IND具有最快的藥物釋放速度和最大的藥物釋放率。從以上數(shù)據(jù)可以看出，DTT能夠促進藥物的釋放，并且堿性條件下的藥物釋放速度大于酸性條件下的釋放速度。

圖7　SCL-NPs-IND的藥物累積釋放曲線

3　結(jié) 論

本實驗通過無皂乳液RAFT一步聚合制備得到粒徑均一、具有明確核殼結(jié)構(gòu)并且能可控釋放藥物的SCL-NPs，其中引入還原敏感性交聯(lián)劑BAC使所制SCL-NPs可發(fā)生解聚，并采用一步聚合的方法來簡化實驗流程。還考察了SCL-NPs-IND在不同緩釋條件下的藥物釋放性能，結(jié)果顯示DTT可以促進藥物的釋放，并且堿性條件下的釋放速度明顯大于酸性條件下的釋放速度。因此，SCL-NPs作為藥物載體可以進行細胞內(nèi)藥物可控釋放。

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Preparation of Shell Cross-linked Drug Carriers by One-step RAFT Polymerization and Study on Controlled Release

JIANGGuo-huaa，ZHOU Hui-jieb，JIANG Teng-tenga，DU Xiang-xianga
（a.School of Material and Textiles；b.Qixin School，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

PDMAEMA-b-PS shell nano particles（SCL-NPs）were prepared by one-step RAFT polymerization using N，N’-bis（acryloyl）cystamine（BAC）as cross-linked agent.Indometacin-contained SCL-NPs（SCL-NPs-IND）was prepared by adding indometacin（IND）in SCL-NPs preparation process. The morphology，structure and properties of SCL-NPs were characterized by fourier transform infrared spectroscopy（FTIR），nuclear magnetic resonance spectrometer（NMR），transmission electron microscope（TEM）and dynamic light scattering analyzer（DLS）.It was found that SCL-NPs had explicit core-shell structure and their shapes are rand；The drug release property of SCL-NPs-IND was investigated by ultraviolet-visible spectrophotometer（UV）.The results indicated that the drug release rate could be accelerated with assistant of dithiothreitol（DTT）.Thus，release rate under alkaline condition was greater than that under acidic condition.

RAFT；shell cross-linked；drug carriers；reduction sensitivity；controlled release

O631.3

A

1673-3851（2015）06-0800-05

（責(zé)任編輯：許惠兒）

2014-11-14

國家自然科學(xué)基金項目（51373155）；國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201410338004）

江國華（1975-），男，浙江建德人，教授，主要從事功能高分子材料方面的研究。