純化水微生物限度檢查方法優(yōu)選

北京北大維信生物科技有限公司（100094）金寶華 姜琳 張麗梅 馬威

水在制藥工業(yè)中是應(yīng)用最廣泛的工藝原料，用做藥品的成分、溶劑、稀釋劑等。水是良好的溶劑、尤其是與自然界失去平衡的純化水和注射用水，具有極強(qiáng)的溶解能力和極少的雜質(zhì)，廣泛用于制藥設(shè)備和系統(tǒng)的清洗[1]。鑒于水在制藥工業(yè)中既作為原料又作為清洗劑，各國藥典對制藥用水的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，都有明確的定義和要求；當(dāng)前中國藥典（2010年版）、美國藥典（USP36-NF30）及歐洲藥典（7.0）中純化水微生物限度檢查方法均為薄膜過濾法，但是所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件（溫度、時(shí)間）不同。為指導(dǎo)我廠在純化水日常監(jiān)測及驗(yàn)證微生物限度檢查法的選擇，對檢查方法進(jìn)行優(yōu)選驗(yàn)證。

1 驗(yàn)證項(xiàng)目

根據(jù)本驗(yàn)證的三個(gè)主要目的，制定驗(yàn)證項(xiàng)目，見附表1。

附表1 驗(yàn)證項(xiàng)目表

2 驗(yàn)證前準(zhǔn)備

①人員培訓(xùn) 質(zhì)量管理部組織了驗(yàn)證方案的培訓(xùn)；受訓(xùn)人掌握了方案內(nèi)容；培訓(xùn)有記錄。 ②驗(yàn)證用工具及儀器設(shè)備 驗(yàn)證用工具均清潔和滅菌。驗(yàn)證用主要儀器、設(shè)備、儀表均經(jīng)過校驗(yàn)或驗(yàn)證，并在有效期內(nèi)。③驗(yàn)證用培養(yǎng)基 按驗(yàn)證方案中各方法要求制備所需培養(yǎng)基，培養(yǎng)基干粉均來自合格供應(yīng)商并在有效期，且已經(jīng)過計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查合格。詳見附表2。④驗(yàn)證用菌液制備 按方案中方法要求制備所需陽性菌液，詳見附表3。⑤驗(yàn)證用純化水取樣 按我廠《制藥用水取樣操作程序》進(jìn)行供試品的取樣。

附表2 驗(yàn)證用培養(yǎng)基列表

附表3 驗(yàn)證用菌液表

3 驗(yàn)證過程

3.1 美國藥典、中國藥典與歐洲藥典純化水微生物檢查方法 美國藥典、歐洲藥典與中國藥典純化水微生物限度檢查方法均為薄膜過濾法，但是在培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時(shí)間方面有所區(qū)別，具體見附表4。

附表4 美國藥典、中國藥典與歐洲藥典純化水微生物限度檢查方法對比

3.2 驗(yàn)證的操作環(huán)境

3.2.1 三方藥典檢查方法分析、最優(yōu)的檢查方法計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證在獨(dú)立的陽性潔凈區(qū)域的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行操作。

3.2.2 中國藥典與經(jīng)驗(yàn)證的最優(yōu)純化水微生物計(jì)數(shù)方法間差異分析實(shí)驗(yàn)在10000級潔凈區(qū)域內(nèi)100級超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行。

3.3 驗(yàn)證實(shí)施及結(jié)果

3.3.1 美國藥典、中國藥典與歐洲藥典純化水微生物檢查方法差異分析

3.3.1.1 三方藥典純化水微生物限度檢查方法差異分析概述 根據(jù)本文附表 4，美國藥典、中國藥典與歐洲藥典純化水微生物檢查方法的區(qū)別主要包括培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間，概括起來有5種不同條件。為考察此5種純化水微生物檢查方法實(shí)際檢查能力之間的關(guān)系，擬使用常見微生物的典型菌株（附表 3）分別按檢查方法的5 種不同條件進(jìn)行檢查，使用單因子方差分析的方法考察5種不同條件對各類微生物典型菌株檢查能力之間是否存在顯著性差異。

以純化水微生物檢查方法為因子（使用字母 A 表示），使用不同檢查方法（不同的因子水平，見附表5）獲得的微生物計(jì)數(shù)結(jié)果。

附表5 因子水平（Ai）與檢查方法對應(yīng)關(guān)系

附表6 大腸埃希菌檢測結(jié)果列表

3.3.1.2 分析方法 方差分析（ANOVA）：又稱變異數(shù)分析或F檢驗(yàn)，其目的是推斷兩組或多組資料的總體均數(shù)是否相同，檢驗(yàn)兩個(gè)或多個(gè)樣本均數(shù)的差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。包括單因素方差分析即完全隨機(jī)設(shè)計(jì)或成組設(shè)計(jì)的方差分析和多因素方差分析。

Tukey多重比較：對檢驗(yàn)數(shù)據(jù)使用方差分析評估統(tǒng)計(jì)差異外，還使用Tukey多重比較的實(shí)際差異性。Tukey多重比較指對于各種不同的比較樣本，給出聯(lián)合置信區(qū)間的方法，對不具有共同置信區(qū)間的樣本（組）進(jìn)行判異。Tukey多重比較可以具體找出哪個(gè)單位測試數(shù)據(jù)超出了聯(lián)合置信區(qū)間。通常當(dāng)且僅當(dāng)置信區(qū)間中不包含零時(shí)，才會否定均值之間無差異的原假設(shè)。檢測數(shù)據(jù)的差異性用“分組”表示，分組中不共享字母的因子的檢測數(shù)據(jù)之間具有顯著差異。

3.3.1.3 驗(yàn)證數(shù)據(jù) 按3.3.1.1獲得的微生物計(jì)數(shù)結(jié)果服從正態(tài)分布，檢查結(jié)果之間相互獨(dú)立，其方差相等。通過方差分析考察不同方法對各類常見微生物典型菌株的檢查結(jié)果之間是否存在顯著性差異，進(jìn)而判斷檢查方法之間是否存在顯著性差異。通過Tukey多重比較列表篩選無差異且檢出率較高的水平。以下各組均使用方差分析、Tukey多重比較2種方法評估差異性。

①革蘭氏陰性菌（大腸埃希菌，銅綠假單胞菌）檢測結(jié)果方差分析：革蘭氏陰性菌—大腸埃希菌檢測結(jié)果方差分析（見附表6、7）。在顯著性水平（α=0.05）上，P＜0.05，大腸埃希菌的5種檢驗(yàn)方法有差異。再用Tukey 多重比較法進(jìn)一步分析。使用 Tukey 方法和 95% 置信度對信息進(jìn)行分組（見附表8）。檢測數(shù)據(jù)的差異性用“分組”表示，分組中不共享字母的因子的檢測數(shù)據(jù)之間具有顯著差異。

附表7 大腸埃希菌檢測結(jié)果方差分析表

附表8 大腸埃希菌檢測結(jié)果Tukey 多重比較

②革蘭氏陰性菌—銅綠假單胞菌檢測結(jié)果方差分析（見附表9、10）。在顯著性水平（α=0.05）上，P ＜0.05，銅綠假單胞菌的5種檢驗(yàn)方法有差異。再用Tukey多重比較法進(jìn)一步分析。使用 Tukey 方法和 95% 置信度對信息進(jìn)行分組（見附表11）。檢測數(shù)據(jù)的差異性用“分組”表示，分組中不共享字母的因子的檢測數(shù)據(jù)之間具有顯著差異。

附表9 銅綠假單胞菌檢測結(jié)果列表

附表10 銅綠假單胞菌檢測結(jié)果方差分析表

附表11 銅綠假單胞菌檢測結(jié)果Tukey 多重比較

附表12 金黃色葡萄球菌檢測結(jié)果列表

③革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）檢測結(jié)果方差分析（見附表12、13）。在顯著性水平（α=0.05）上，P＜0.05，金黃色葡萄球菌的5種檢驗(yàn)方法有差異。再用Tukey多重比較法進(jìn)一步分析。使用 Tukey 方法和 95% 置信度對信息進(jìn)行分組（見附表14）。檢測數(shù)據(jù)的差異性用“分組”表示，分組中不共享字母的因子的檢測數(shù)據(jù)之間具有顯著差異。

附表13 黃色葡萄球菌檢測結(jié)果方差分析表

附表14 黃色葡萄球菌檢測結(jié)果Tukey 多重比較

④芽孢菌（枯草芽孢桿菌）檢測結(jié)果方差分析（見附表15、16）。在顯著性水平（α=0.05）上，P＜0.05，枯草芽孢桿菌的5種檢驗(yàn)方法有差異。再用Tukey多重比較法進(jìn)一步分析。使用 Tukey 方法和 95% 置信度對信息進(jìn)行分組（見附表17）。

檢測數(shù)據(jù)的差異性用“分組”表示，分組中不共享字母的因子的檢測數(shù)據(jù)之間具有顯著差異。

⑤酵母菌（白色念珠菌）檢測結(jié)果方差分析（見附表18、19）。在顯著性水平（α=0.05）上，P>0.05，白色念珠菌的5種檢驗(yàn)方法無差異。再用Tukey 多重比較法進(jìn)一步分析。使用 Tukey 方法和 95%置信度對信息進(jìn)行分組（見附表20）。

附表15 枯草芽孢桿菌檢測結(jié)果列表

附表16 枯草芽孢桿菌檢測結(jié)果方差分析表

附表17 枯草芽孢桿菌檢測結(jié)果Tukey 多重比較

附表18 白色念珠菌檢測結(jié)果列表

附表19 白色念珠菌檢測結(jié)果方差分析表

附表20 白色念珠菌檢測結(jié)果Tukey 多重比較

檢測數(shù)據(jù)的差異性用“分組”表示，分組中不共享字母的因子的檢測數(shù)據(jù)之間具有顯著差異。

⑥霉菌（黑曲霉）檢測結(jié)果方差分析（見附表21、22）。在顯著性水平（α=0.05）上，P>0.05，黑曲霉菌的5種檢驗(yàn)方法無差異。也可再用Tukey 多重比較法進(jìn)一步分析。使用 Tukey 方法和 95%置信度對信息進(jìn)行分組（見附表23）。

檢測數(shù)據(jù)的差異性用“分組”表示，分組中不共享字母的因子的檢測數(shù)據(jù)之間具有顯著差異。

3.3.1.5驗(yàn)證結(jié)論 在顯著性水平（α=0.5）上對不同水平檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，白色念珠菌、黑曲霉菌在A1～ A5水平不存在差異，其他4株（大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）均存在差異。

再使用Tukey多重比較法比較各水平的相互差異，列表篩選無差異且檢出率較高的水平見（見附表24）。

3.3.2 最優(yōu)純化水微生物限度檢查方法計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證。

QC于2014年6月19日、20日、22日，以C0041001 點(diǎn)（我廠純化水點(diǎn)編號，下同）純化水作為供試品，使用6種典型代表菌株，分別進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗(yàn)。

3.3.2.1 驗(yàn)證方法試驗(yàn)組：無菌操作，取10ml純化水樣品，加至已裝有100mlpH7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的薄膜過濾器內(nèi)， 再加入1ml含菌數(shù)50～100cfu/mL的菌液，過濾，濾干后取出濾膜菌面朝上貼于R2A瓊脂平板上。于30℃～35℃培養(yǎng)120小時(shí)，計(jì)數(shù)。

菌液組：分別取銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉驗(yàn)證用菌液各1ml，加入含100mlpH7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至濾器內(nèi)，過濾，濾干后取出濾膜菌面朝上貼于R2A瓊脂平板上。于30℃～35℃培養(yǎng)120小時(shí)，計(jì)數(shù)。

供試品對照組：無菌操作，取10ml純化水樣品，加至已裝有100mlpH7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的薄膜過濾器內(nèi)，過濾，濾干后取出濾膜菌面朝上貼于R2A瓊脂平板上。于30℃～35℃培養(yǎng)120小時(shí)，計(jì)數(shù)。

稀釋劑對照組：使用 pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替試驗(yàn)組中的純化水樣品按試驗(yàn)組操作進(jìn)行檢查計(jì)數(shù)。

回收率計(jì)算結(jié)果見附表25。

3.3.2.2 結(jié)果 計(jì)算公式見附圖；計(jì)算結(jié)果見附表26。

3.3.2.3 結(jié)論 在純化水微生物限度檢查最優(yōu)檢查法（歐洲藥典方法）的驗(yàn)證試驗(yàn)中，6種試驗(yàn)菌株的回收率均達(dá)到70%以上，證實(shí)該方法適用于純化水的微生物限度檢查。

3.3.3 中國藥典與經(jīng)驗(yàn)證的最優(yōu)純化水微生物計(jì)數(shù)方法間檢測結(jié)果差異分析 QC于2014年6月30日至7月11日， 連續(xù)10個(gè)工作日同時(shí)使用最優(yōu)檢測方法（歐洲藥典方法）與中國藥典檢測方法對純化水系統(tǒng)的送水口（C0041002 ）實(shí)施同步持續(xù)檢測，獲取 10 組檢測數(shù)據(jù)，對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，評估。

附表21 黑曲霉檢測結(jié)果列表

附表22 黑曲霉檢測結(jié)果方差分析表

附表23 黑曲霉檢測結(jié)果Tukey 多重比較

附表24 檢測方法的Tukey 多重比較法優(yōu)選表

附表25 計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的回收率列表

附表26 中國藥典方法、歐洲藥典方法檢驗(yàn)結(jié)果列表

附表27 中國藥典方法、歐洲藥典方法檢驗(yàn)結(jié)果方差分析表

附圖 計(jì)算公式

3.3.3.1 驗(yàn)證方法 無菌操作，取10ml純化水樣品，加至已裝有100mlpH7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的薄膜過濾器內(nèi)，過濾，濾干后取濾膜貼于適當(dāng)?shù)沫傊桨迳?，培養(yǎng)，檢查計(jì)數(shù)。

3.3.3.2 結(jié)果 使用單因子方差分析，不同檢測方法為不同水平，設(shè)：B1——經(jīng)驗(yàn)證的中國藥典方法，B2——經(jīng)驗(yàn)證的最優(yōu)檢測方法（歐洲藥典方法），根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算 F 比。比較2種方法的差異水平。2種方法的10次檢驗(yàn)結(jié)果見附表26；方差分析結(jié)果見附表27。

3.3.3.3 結(jié)論 驗(yàn)證結(jié)果表明，在顯著性水平α = 0.05上，P>0.05，2種檢驗(yàn)方法無差異。

4 驗(yàn)證總結(jié)論

4.1 通過在顯著性水平（α=0.5）上對不同水平檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，再使用Tukey 配對比較法比較各水平的相互差異，列表篩選無差異且檢出率較高的水平為歐洲藥典方法。

4.2 對選出的最優(yōu)純化水微生物限度檢查方法（歐洲藥典方法）進(jìn)行計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證，6種試驗(yàn)菌株的回收率均達(dá)到70%以上，證實(shí)該方法適用于純化水的微生物限度檢查。

4.3 通過對最優(yōu)純化水微生物限度檢查方法（歐洲藥典方法）與現(xiàn)行經(jīng)驗(yàn)證的中國藥典方法的比較分析，證實(shí)2種檢驗(yàn)方法無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

對優(yōu)選的方法是否可替代我公司正在使用并經(jīng)過計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證的中國藥典方法，還需按照《中華人民共和國藥典（2010年版）》第一部 附錄XVIII E藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則 “樣品中微生物定量檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證”進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。