缺血性腦卒中與4—羥基壬烯醛的相關(guān)性研究

常靜　馬明　林莉莉

[摘要] 目的 探討缺血性腦卒中與4-羥基壬烯醛（4-HNE）的相關(guān)性。 方法 選擇腦卒中傾向的自發(fā)性高血壓大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠，檢測(cè)4-HNE在大腦皮層和血清中的表達(dá)水平，觀察其與大鼠生存時(shí)間的關(guān)系；同時(shí)檢測(cè)缺血性腦卒中患者和對(duì)照人群血漿4-HNE水平及其在急性期和慢性期的變化。 結(jié)果 與自發(fā)性高血壓大鼠相比，腦卒中傾向的自發(fā)性高血壓大鼠大腦皮層和血清的4-HNE表達(dá)明顯升高（P < 0.01），且4-HNE水平與大鼠生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.602 08，P < 0.01）；腦卒中患者血漿4-HNE水平較正常人群升高（P < 0.01），且慢性期患者較急性期患者有降低的趨勢(shì)（P < 0.05）。 結(jié)論 缺血性腦卒中時(shí)4-HNE升高，4-HNE水平與缺血性腦卒中具有相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞] 4-羥基壬烯醛；缺血性腦卒中；腦卒中傾向自發(fā)性高血壓大鼠

[中圖分類號(hào)] R363 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）09（c）-0026-04

[Abstract] Objective To investigate the correlation between ischemic stroke and 4-hydroxynonenal （4-HNE）. Methods Stroke prone spontaneously hypertensive rat （SHR-SP） and spontaneously hypertensive rat （SHR） were observed in this research. 4-HNE was detected in cerebral cortex and serum， and the relationship between 4-HNE level and lifespan was observed. Also the changes of plasma 4-HNE in patient with ischemic stroke in acute-period and chronic-period and control person were detected. Results Compared to SHR rats， the cortex and serum 4-HNE levels were significantly higher in SHR-SP rats （P < 0.01）. Serum 4-HNE level significantly and inversely correlated with the survival time of SHR-SP （r=-0.602 08，P < 0.01）. Stroke patients in acute period and chronic period had significantly elevated levels of 4-HNE than the control subjects （P < 0.01）. 4-HNE in chronic stroke patients was lower than acute stroke patients （P < 0.05）. Conclusion 4-HNE increases in ischemic stroke and there is a correlation between ischemic stroke and 4-HNE.

[Key words] 4-hydroxynonenal； Ischemic stroke； Stroke prone spontaneously hypertensive rat

腦缺血時(shí)病理過程極為復(fù)雜，缺血損傷后腦組織發(fā)生能量代謝紊亂、中樞神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、氧化應(yīng)激損傷、炎性反應(yīng)等改變，使神經(jīng)元發(fā)生復(fù)雜病理生理改變而凋亡[1-3]。近年來，氧化應(yīng)激學(xué)說已成為缺血性卒中研究的熱點(diǎn)，缺氧可使組織生成大量氧自由基，作用于細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸，使膜脂質(zhì)產(chǎn)生過氧化反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，并形成脂質(zhì)過氧化物。4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)醛基產(chǎn)物中最具代表性的物質(zhì)[4]，在腦缺血時(shí)4-HNE如何變化，其是否是腦缺血損傷的危險(xiǎn)因素？目前研究甚少，本課題就缺血性腦卒中與4-HNE的相關(guān)性進(jìn)行了基礎(chǔ)和臨床研究，對(duì)臨床采取有效的防治措施有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

雄性京都種大鼠（Wistar Kyoto rat，WKY rat），體重250～300 g，購自上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，清潔級(jí)，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（滬）2007-0005；自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat，SHR）以及腦卒中傾向的自發(fā)性高血壓大鼠（stroke prone spontaneously hypertensive rat，SHR-SP）均由第二軍醫(yī)大學(xué)藥理教研室贈(zèng)予。4-HNE標(biāo)準(zhǔn)品和人4-HNE一抗購自Sigma公司，大鼠4-HNE酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒購自WEIAO生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按種屬不同分為WKY組、SHR組和SHR-SP組。

1.2 人群選擇

以無錫市人民醫(yī)院腦梗死發(fā)生后0～3 d為腦卒中急性期患者（23例），腦梗死發(fā)生后3～6個(gè)月為慢性期患者（13例），以年齡、性別等基本社會(huì)特征及健康信息相匹配人群為對(duì)照（30名），觀察腦梗死患者及對(duì)照人群血漿4-HNE水平。

1.3 Western blot分析

取6月齡WKY、SHR和SHR-SP大鼠的大腦皮層組織，提取蛋白定量后，各組取等量蛋白加入上樣緩沖液并變性，行SDS-PAGE垂直電泳、轉(zhuǎn)膜、牛奶封閉，分別加4-HNE一抗（內(nèi)參照為GAPDH抗體），4℃孵育過夜，二抗孵育，奧德賽紅外掃膜儀掃描定量，觀察4-HNE在WKY、SHR和SHR-SP大鼠大腦皮層中的表達(dá)。

1.4 大鼠血清4-HNE檢測(cè)

3、6月齡大鼠眼眶取血約1.5 mL，3000 r/min離心15 min，取上清。每孔加入底物工作液100 μL和酶標(biāo)抗體工作液10 μL，各孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品20 μL。振蕩混勻后將反應(yīng)板置37℃ 15 min后，每孔加入100 μL終止液，混勻，30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)品4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0 ng/mL為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品OD值計(jì)算出相應(yīng)4-HNE含量。

1.5 人血漿中4-HNE檢測(cè)

BCA測(cè)定血漿蛋白濃度，用PBS調(diào)整濃度至10 μg/mL。每孔加入100 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，4℃過夜，PBS清洗3次，甩干；每孔再加入200 μL Assay Diluent，搖床搖晃1～2 h，Wash Buffer 清洗3次，甩干；每孔加入100 μL抗4-HNE抗體，室溫孵育1 h，PBS清洗3次，每孔加入100 μL二抗HRP conjugate，室溫孵育1 h，PBS清洗3次；每孔加入100 μL底物反應(yīng)液，孵育10 min。密切觀察顏色變化，當(dāng)顏色變化很快時(shí)，立即加入100 μL反應(yīng)終止液。立即置于酶標(biāo)儀上，450 nm處讀取吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品4-HNE濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4-HNE在WKY、SHR和SHR-SP大鼠大腦皮層中的表達(dá)

雄性SHR-SP一般在8～12月齡內(nèi)會(huì)發(fā)生腦卒中而死亡，其中75%是缺血性腦卒中。利用Western blot的方法測(cè)定6月齡的WKY、SHR、SHR-SP大鼠大腦皮層4-HNE的表達(dá)，結(jié)果顯示，與WKY相比，SHR-SP大鼠大腦皮層4-HNE表達(dá)增高[（1.000±0.093）比（1.180±0.125）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與SHR相比，SHR-SP大鼠大腦皮層4-HNE表達(dá)顯著增高[（0.910±0.113）比（1.180±0.125）]，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），而SHR與WKY相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1。

2.2 WKY、SHR和SHR-SP大鼠血清4-HNE水平比較

本研究分別檢測(cè)了3月齡和6月齡的WKY、SHR、SHR-SP三種大鼠外周血清中4-HNE的含量，結(jié)果顯示，不管是3月齡還是6月齡，SHR-SP大鼠的血清4-HNE水平較SHR與WKY大鼠均顯著升高[3月齡SHR-SP、SHR、WKY大鼠4-HNE水平分別為（963.8±144.7）、（318.6±55.7）、（330.9±40.9）ng/mL，P < 0.01；6月齡SHR-SP、SHR、WKY大鼠4-HNE水平分別為（1392.1±200.9）、（444.5±178.1）、（330.9±40.9）ng/mL，P < 0.01]，而SHR與WKY大鼠血清4-HNE水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。隨著SHR-SP大鼠月齡的增長，血清4-HNE的水平也逐漸升高，6月齡大鼠較3月齡相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2。

2.3 4-HNE水平與SHR-SP大鼠生存時(shí)間的相關(guān)性

27只8月齡雄性SHR-SP大鼠眼眶取血，測(cè)定血清4-HNE水平，動(dòng)物放回動(dòng)物房繼續(xù)飼養(yǎng)，記錄死亡情況。統(tǒng)計(jì)4-HNE與SHR-SP大鼠生存時(shí)間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，SHR-SP大鼠的生存時(shí)間與血漿4-HNE水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.602 08，P=0.0009）。見圖3。

2.4 缺血性腦卒中患者血漿4-HNE水平

通過臨床進(jìn)一步觀察4-HNE與腦卒中的關(guān)系，以年齡、血壓、血脂等基本信息相匹配人群為對(duì)照，測(cè)定缺血性腦卒中急性期（0～3 d，23例）和慢性期（3～6個(gè)月，13例）患者及對(duì)照人群血漿4-HNE水平。結(jié)果顯示，各人群組間總膽固醇及肌酐差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），但總膽固醇與肌酐水平均在正常范圍內(nèi)。見表1。不管是急性期還是慢性期，腦卒中患者血漿4-HNE水平均高于對(duì)照人群[（14.9±2.5）、（12.9±2.6）比（9.6±2.0）mg/mL]，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；慢性期患者血漿4-HNE水平較急性期低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖4。

3 討論

氧化應(yīng)激是腦缺血的基本病理生理改變之一，腦缺血缺氧時(shí)，體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與抗氧化之間失衡，導(dǎo)致活性氧在體內(nèi)蓄積，并引起一系列生物反應(yīng)的過程。過多的氧自由基攻擊生物膜磷脂中的多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，ω-6多不飽和脂肪酸，如亞油酸和花生四烯酸可以分解為4-HNE[6]，與自由基相比，醛基產(chǎn)物更穩(wěn)定，醛基還可與親核性物質(zhì)（如DNA、蛋白質(zhì)和磷脂）反應(yīng)，干擾細(xì)胞的正常功能，損傷細(xì)胞組分，從而引發(fā)疾病[7-9]。

多項(xiàng)研究證實(shí)，過多的4-HNE通過多種途徑對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的生物毒性，如4-HNE能對(duì)含巰基蛋白質(zhì)相關(guān)的位點(diǎn)進(jìn)行修飾，引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，抑制蛋白、DNA合成，或改變酶活性[10-11]；4-HNE也可以作為內(nèi)源性凋亡誘導(dǎo)因子，抑制AKP等信號(hào)通路而誘發(fā)細(xì)胞凋亡作用[12-13]；4-HNE與細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的巰基結(jié)合，造成谷胱甘肽消耗性降低，使細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力減弱，進(jìn)一步并加重細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激[14-15]；4-HNE作為脂質(zhì)過氧化的終末產(chǎn)物，能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞聚集活化，誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)，促進(jìn)炎癥的發(fā)生[16-17]。上述機(jī)制使4-HNE參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展。近年來尚有研究表明，在心肌缺血的病理情況下，血漿4-HNE明顯升高，提示4-HNE與缺血性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[18-19]。

SHR-SP和SHR大鼠均來自WKY大鼠，雄性的SHR-SP大鼠在5～12周齡時(shí)血壓快速上升，形成嚴(yán)重的高血壓，75%左右的SHR-SP大鼠因缺血性腦卒中而死亡[20]。通過對(duì)比6月齡的SHR-SP、SHR和WKY大鼠發(fā)現(xiàn)，SHR-SP大鼠大腦皮層4-HNE水平明顯高于SHR和WKY大鼠，但SHR和WKY大鼠無明顯區(qū)別，血漿中4-HNE水平也呈現(xiàn)同樣趨勢(shì)，且隨年齡增長而升高。4-HNE僅在SHR-SP大鼠中升高，這意味著4-HNE的改變與血壓無明顯關(guān)系，4-HNE的增加可能會(huì)促進(jìn)腦卒中發(fā)生。

腦缺血后，腦內(nèi)氧化應(yīng)激增加，代謝紊亂，4-HNE、丙二醛（MDA）等物質(zhì)大量增加，被認(rèn)為是缺血性腦卒中的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，SHR-SP大鼠血清4-HNE水平在腦卒中發(fā)生前就開始升高，一直到卒中后恢復(fù)期逐漸下降，但短期內(nèi)難以降至正常水平；大腦皮層的4-HNE也在腦卒中發(fā)生前表達(dá)上調(diào)，較SHR和WKY大鼠均有顯著差異，且與SHR-SP大鼠生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中患者，無論急性期還是慢性期，血漿4-HNE水平均高于正常人群，即使在卒中發(fā)生后幾個(gè)月仍維持在較高的水平；隨時(shí)間推移，4-HNE逐漸下降，慢性期患者血漿的4-HNE水平比急性期患者低?；谶@些可以認(rèn)為，血漿4-HNE可能是缺血性腦卒中發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一。當(dāng)然，這還有待更廣泛和深入的研究，下一步研究將通過檢測(cè)志愿者血漿4-HNE水平，隨訪志愿者腦卒中的發(fā)生率，觀察是否高水平4-HNE的人群更容易發(fā)生腦卒中。對(duì)于腦卒中的高危人群（高血壓、腦卒中家族史及60歲以上老年人）監(jiān)測(cè)其血漿4-HNE具有積極的臨床意義，可以作為預(yù)測(cè)腦卒中發(fā)生的一個(gè)指標(biāo)。

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（收稿日期：2015-06-03 本文編輯：程 銘）