秈稻不育系花藥培養(yǎng)誘導條件探討

李三和　陳志軍　劉凱等

摘要：以7個秈稻不育系的花藥為材料，探討了秈稻不育系花藥培養(yǎng)誘導的條件。結果表明，材料品種對誘導效率的影響最為明顯；誘導培養(yǎng)基中激素濃度處理對秈稻花藥的愈傷誘導率的影響有顯著差異，KT濃度以1 mg/L為宜，碳源以蔗糖50 g/L相對較好，但替換成50 g/L的麥芽糖后誘導效率相對穩(wěn)定；取材后以8 ℃低溫預處理12 d達到最好效果。

關鍵詞：花藥培養(yǎng)；誘導效率；秈稻不育系

中圖分類號：S511.2+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）19-4868-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.19.056

Abstract： The effects of variety， phytohormone KT， carbon source and days of pretreatment on anther culture were studied with seven Indica rice male sterile lines. The results showed that the variety had the most obvious influence on induction efficiency and the phytohormone KT had difierent effect on the callus induction rate. The proper concentration of KT in medium for callus induction was 1.0 mg/L. Sucrose was the best carbon source with whose concentration was 50 g/L， but maltose with the same dose in medium had a stable efficiency. The best day of cold pretreatment was 12 days in 8 ℃ for most male sterile lines for anther culture.

Key words： anther culture； induction efficiency； Indica rice male sterile line

花藥培養(yǎng)是目前生物技術育種中一項較為成熟、實用而有效的技術，大量應用于粳稻育種和水稻的提純復壯[1-4]，并育成了中花系列、龍粳系列的粳稻品種。花藥培養(yǎng)誘導產生的單倍體，表現(xiàn)出雙親性狀的各種重組類型，通過自然加倍或人工處理加倍，可以在當代獲得穩(wěn)定的純合二倍體?；ㄋ幣囵B(yǎng)與常規(guī)育種技術相結合，可以快速純合有益基因，提高選擇效率，縮短育種周期[5，6]。但在實際操作過程中，由于受培養(yǎng)基組分、材料的差異性以及培養(yǎng)環(huán)境的影響，往往獲得的再生植株群體較小，使選擇受到較大的限制。因此，提高花藥培養(yǎng)的誘導效率，增大花培后代群體，是水稻花藥培育種成敗的關鍵。粳稻的花藥培養(yǎng)已經相對比較成熟，但基本局限于常規(guī)粳稻的培養(yǎng)。秈稻的花培效率一直低下，秈稻不育系更低。關于如何提高花藥培養(yǎng)的效率，國內外許多學者在基本培養(yǎng)基成分、激素種類和配比、低溫預處理等對培養(yǎng)效率的影響方面進行了大量的研究[7-12]，但專門針對多種育種中間材料，尤其是秈稻不育系材料的花藥培養(yǎng)研究報道并不多見。本研究通過對不同的秈稻不育系材料、同一材料的培養(yǎng)基中不同激素濃度、不同碳源、同一碳源不同用量等條件下進行誘導培養(yǎng)，探討了秈稻不育系花藥培養(yǎng)誘導階段的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 所用水稻材料均為中稻秈型不育系，具體品種如表1所示。

1.1.2 培養(yǎng)基 以N6為誘導培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基如表2所示，pH均為5.8。

1.2 方法

1.2.1 幼穗取材及低溫預處理 幼穗取材一般于晴天上午10點前或下午5點后進行。選取劍葉與下一葉的葉枕距約5～10 cm的帶苞葉稻穗，此時幼穗的穎殼寬度已接近成熟時的大小，穎殼呈現(xiàn)淡綠色，雄蕊伸長達到穎殼的1/3～1/2，花藥發(fā)育處于單核中晚期。將帶苞葉稻穗用濕潤紗布包裹，裝入保鮮袋后置于冰箱中8 ℃進行低溫預處理8～12 d。

1.2.2 花藥接種 無菌臺上剝除稻穗苞葉，選取合適的小穗剪下，用3%的次氯酸鈉溶液浸泡25 min，用無菌水沖洗4～5次，用無菌濾紙吸干水后，用剪穎抖藥法將花藥接至誘導培養(yǎng)基上，每個三角瓶約接種100個花藥。

1.2.3 不同因素對誘導效率的影響 7種不同基因型的材料分別設置不同KT用量、不同碳源及濃度、不同預處理時間等處理，分析培養(yǎng)基成分、預處理時間及基因型對誘導效率的影響。誘導階段均采取31 ℃黑暗培養(yǎng)。試驗均在誘導培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計愈傷誘導情況。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分對誘導效率的影響

本試驗中所用誘導培養(yǎng)基均以N6培養(yǎng)基為基礎，添加不同濃度的KT或碳源。從表3可以看出，不同培養(yǎng)基成分對每個材料的誘導效率都有明顯的差別。以低溫預處理12 d為例，I3培養(yǎng)基與I2培養(yǎng)基相比，KT用量由1.5 mg/L減至1.0 mg/L，除1924外的6個材料中誘導效率均有所升高，有的材料升高幅度還很大，說明高濃度的KT不利于花藥培養(yǎng)愈傷組織的誘導。

與I1培養(yǎng)基相比，I3培養(yǎng)基增加了蔗糖的用量，由30 g/L增加到50 g/L，但從誘導效率上來看，7個材料除1924未用I1誘導外，其余6個材料有5個是I3培養(yǎng)基明顯優(yōu)于I1培養(yǎng)基，提高蔗糖的用量能增加秈稻不育系的花培誘導效率，用量為3%～6%。endprint

與I3培養(yǎng)基相比，I7培養(yǎng)基將碳源由蔗糖變?yōu)辂溠刻?，用量相同。?個材料的誘導效果來看，1440和1924效率有所提高，其余都有所降低。從表3還可看出，培養(yǎng)基使用相同含量的蔗糖時，不同的材料之間誘導效率會有較大的差異，但用麥芽糖作為碳源時，出愈率相對比較平穩(wěn)。

4種培養(yǎng)基中，I1、I2、I3培養(yǎng)基對不同的材料的誘導效率都有較大的差異，I7則表現(xiàn)出相對穩(wěn)定的出愈率，基本處于12%～24%之間。對于未知誘導效率的秈稻不育系材料來說，想要獲得比較穩(wěn)定的誘導效果，I7培養(yǎng)基是比較理想的選擇。

2.2 預處理時間對誘導效率的影響

預處理時間對誘導效率的影響如表4所示。以I3培養(yǎng)基為例，秈稻不育系材料預處理時間低于8 d，花培誘導效率都非常低，隨著時間延長，誘導效率明顯提高。本試驗中預處理時間最長達12 d，這些材料誘導率達到了最高值，超過12 d后，誘導效率反而下降。

2.3 基因型對誘導效率的影響

7個不同材料除1924未使用I1培養(yǎng)基外，其余都使用了I1、I2、I3、I7 4種培養(yǎng)基配方。從表3可以看出，對于使用同一種培養(yǎng)基而言，不同試驗材料誘導效率有很大的差別。在1925、1926和1929 3個材料的試驗中，4種誘導培養(yǎng)基都有相對較高的平均誘導效率，在10%以上，1926使用I3培養(yǎng)基可以達到33.93%；對1927來說，4種培養(yǎng)基的誘導率明顯偏低很多，均低于5%。每個材料不同預處理時間和不同誘導培養(yǎng)基情況下的平均出愈率見表5。從表5也可以看出，不同材料的平均誘導率也存在較大差異，材料基因型對花培誘導效率的影響是最主要的。

3 小結與討論

秈稻花藥培養(yǎng)一直是被認為是各種水稻類型中培養(yǎng)力最低的[13，14]，秈稻不育系的花藥培養(yǎng)則由于不育系材料受氣候的影響在某些地域會出現(xiàn)花藥發(fā)育不正常的情況更加難以成功。本研究試圖在普通秈稻材料的基礎上探討適合秈稻不育系花藥培養(yǎng)的合適條件，結果表明，對于不育系材料而言，增加KT用量至1.5 mg/L會降低花培誘導效率，這與向發(fā)云的研究結果一致[12]。有研究表明，花培誘導過程僅使用生長素類激素2，4-D和NAA，而不使用KT[9]，能得到較好的誘導效果，但張艷敏等[15]的對3個粳稻的試驗表明，花藥愈傷組織誘導的最佳激素組合中含有1 mg/L的KT。

在花藥培養(yǎng)中，蔗糖一直是最常用的碳源，同時在培養(yǎng)基中起著調節(jié)滲透壓的作用。水稻培養(yǎng)基中蔗糖濃度為一般為3%～6%，也有文獻報道誘導階段使用麥芽糖作為碳源有較好的效果[3，16]，這些與本研究的結果有差異。本研究認為大部分秈稻不育系材料用蔗糖誘導效果較為理想，但使用麥芽糖作為培養(yǎng)基的碳源，對秈稻不育系有相對穩(wěn)定的誘導效率。研究結果表明對于秈稻常規(guī)材料，麥芽糖的效果遠遠高于蔗糖（本文未列）。

低溫預處理對水稻花培有較大的影響，從羅瓊等[17]對偏秈材料的低溫預處理看來，9 ℃處理7～10 d有利于提高花藥愈傷組織誘導頻率，本研究采用8 ℃處理12 d則能達到普遍較好的誘導效果。

材料（即不同基因型）對愈傷誘導效率的影響是最重要的。本研究中1924的平均誘導效率不到1925的1/6，各個其他材料之間差異也很大，這是幾乎所有花培研究者公認結果。因此，為了提高培養(yǎng)效率，建議通過基因型篩選，積累培養(yǎng)力較高的花培資源，用培養(yǎng)力較高的粳稻品種作為橋梁親本，配制優(yōu)異的組合來獲得較大量的花培苗[18]，或者通過測定分析親本及外植體的花藥培養(yǎng)力，把高培養(yǎng)力基因導入到優(yōu)良親本或雜種中，改善花藥適應離體培養(yǎng)的遺傳背景來提高花培育種效果[19]。事實上，這些方法雖然切實可行，但由于實際育種過程中，秈稻培養(yǎng)力高的品種數(shù)量不多，秈粳交也因存在不親和性等原因，應用起來也存在一定的困難。

參考文獻

[1] 葛美芬，白和盛，王保和，等.秈型雜交稻三系花培提純的技術途徑及其在生產上的應用[J].雜交水稻，1989（S1）：65-68.

[2] 張家宏，張永新.應用花培技術提純不同質源不育系取得成效[J].雜交水稻，1995（2）：27.

[3] 張承妹，陸家安，袁 勤，等.粳稻BT型三系花藥培養(yǎng)提純復壯[J].上海農業(yè)學報，2002，18（3）：7-12.

[4] 馬鎮(zhèn)榮，凌定厚，王昌虎.花藥培養(yǎng)對秈稻兩用核不育系培矮64 S進行提純與改良[J].熱帶亞熱帶植物學報，2000，8（4）：308-314.

[5] 朱旭東，曾大力，斯華敏，等.標記兩用核不育水稻M2S的花藥培養(yǎng)及遺傳分析[J].中國水稻科學，2002，16（2）：24-128.

[6] 曾千春，吳 茜，馮德江，等.轉修飾cryAc基因秈稻明恢81經花藥培養(yǎng)獲得抗蟲DH系[J].生物工程學報，2002（4）： 442-445.

[7] 孫宗修，斯華敏，程式華.麥芽糖提高水稻花培效率的研究[J].中國水稻科學，1993，7（4）：227-231.

[8] RAINA S K，IRFAN S T.High frequency embryogenesis and plantlet regeneration from isolated microspores of rice[J]. Plant Cell Reports，1998，17：957-962.

[9] GABRIELA TREJO-TAPIA， URIEL M A，GUADALUPE S M. The effects of cold –pretreatment， auxins and carbon source on anther culture of rice[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture，2002，71：41-46.

[10] 馮雙華，趙 森，郭家源，等.不同培養(yǎng)基和激素對超級雜交稻花藥培養(yǎng)力的影響[J].西南農業(yè)大學學報（自然科學版），2006，28（4）：523-525，565.

[11] 王伍梅，臺德衛(wèi)，張效忠，等.水稻高效花藥培養(yǎng)技術體系的構建[J].中國農學通報，2009，25（16）：65-68.

[12] 向發(fā)云，宋志紅，吳金平，等.秈稻材料特性和激素配比對花藥培養(yǎng)效率的影響[J].湖北農業(yè)科學，2008，47（12）：1380-1384.

[13] 沈錦驊，李梅芳，陳銀全，等.花藥培養(yǎng)在水稻品種改良上的應用[J].中國農業(yè)科學，1982（2）：15-19.

[14] 趙成章.水稻試管苗正?；{控技術的研究[M].北京：北京工業(yè)大學出版杜，1990.

[15] 張艷敏，高潤紅，郭桂梅，等.不同優(yōu)質粳稻花藥對低溫和激素處理的培養(yǎng)響應[J].上海農業(yè)學報，2011，27（2）：121-124.

[16] 馮雙華，侯海軍，廖江林，等.不同因素對水稻溫敏核不育系香125S花藥培養(yǎng)的影響[J].農業(yè)現(xiàn)代化研究，2007，28（3）：358-360.

[17] 羅 瓊，曾千春，周開達，等.水稻花藥培養(yǎng)及其在育種中的應用[J].雜交水稻，2000，15（3）：1-2.

[18] 葛勝娟.水稻花藥培養(yǎng)及其在遺傳育種上的應用[J].種子，2013，32（8）：45-50

[19] 遲 銘，方兆偉，李 健，等.花藥培養(yǎng)在水稻育種中的應用研究進展[J].江蘇農業(yè)科學，2011，39（6）：111-113.endprint