超長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸的生物合成和代謝工程

田德雨王士安王立昊王家林李福利

（1.青島科技大學(xué)化工學(xué)院 發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室，青島 266061；2.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所 青島市單細(xì)胞油脂工程實(shí)驗(yàn)室，青島 266101）

超長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸的生物合成和代謝工程

田德雨1，2王士安2王立昊1王家林1李福利2

（1.青島科技大學(xué)化工學(xué)院 發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室，青島 266061；2.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所 青島市單細(xì)胞油脂工程實(shí)驗(yàn)室，青島 266101）

超長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸（Very long chain monounsaturated fatty acid，VLCMFA）是指主碳鏈上碳原子數(shù)大于或等于20，有且只有一個(gè)不飽和雙鍵的脂肪酸。VLCMFA較多的存在于各種油料植物及少數(shù)微藻中，目前發(fā)現(xiàn)的有鱈油酸（C20∶1）、芥酸（C22∶1）、神經(jīng)酸（C24∶1）和西門木烯酸（C26∶1）。VLCMFA具有獨(dú)特的工業(yè)用途和潛在藥用保健功效。主要綜述VLCMFA的生物合成和代謝工程研究進(jìn)展，旨為應(yīng)用開發(fā)提供參考。

脂肪酸；超長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸；芥酸；神經(jīng)酸；代謝工程

脂肪酸（Fatty acid）是由一條長(zhǎng)的烴鏈和一個(gè)末端羧基組成的羧酸，是生物體的重要儲(chǔ)能物質(zhì)和細(xì)胞組分，根據(jù)烴鏈上雙鍵的有無，分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸。人體過量攝取飽和脂肪酸，容易導(dǎo)致心腦血管疾病。而某些不飽和脂肪酸具有保護(hù)血管、預(yù)防心血管疾病和糖尿病、促進(jìn)嬰兒腦部發(fā)育等保健功效，如多不飽和脂肪酸二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA，C20∶5）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA，C22∶6），這一類屬于超長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，這方面的綜述已經(jīng)較為全面［1］。在不飽和脂肪酸中，超長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸（Very long chain monounsaturated fatty acid，VLCMFA）是主鏈碳原子數(shù)≥20并且只有一個(gè)不飽和鍵的類別，目前發(fā)現(xiàn)的有鱈油酸（Eicosenoic acid，C20∶1△11c）、芥酸（Erucic acid，C22∶1△13c）、神經(jīng)酸（Nervonic acid，C24∶1△15c）和西門木烯酸（Ximenic acid，C26：1△17c）（圖1）。與多不飽和脂肪酸相比，雖然VLCMFA受到的關(guān)注較少，但是這類不飽和脂肪酸具有獨(dú)特的藥效、保健功效和工業(yè)用途。本文主要綜述VLCMFA的生物合成和代謝工程進(jìn)展，以期為其應(yīng)用研發(fā)提供參考。

圖1 超長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸的分子結(jié)構(gòu)

1 超長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸的生理功能和應(yīng)用

在超長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸中，芥酸（22∶1△13c）和神經(jīng)酸（24∶1△15c）與人類健康和生活關(guān)系密切（表1）。芥酸在十字花科植物種子有豐富積累，其中在油菜籽油中芥酸的含量能夠占到總油量的30%-60%，旱金蓮屬（Tropaeolum）植物中，芥酸的含量甚至能達(dá)到80%。這種大量的脂肪酸已經(jīng)證實(shí)對(duì)一些哺乳動(dòng)物的心血管會(huì)造成較為嚴(yán)重的損害［2，3］。雖然現(xiàn)在仍然沒有直接證據(jù)證明芥酸對(duì)人體的極大害處，但據(jù)推測(cè)因?yàn)榻嫠岵荒軌虮蝗梭w有效的代謝，可使腎、肝等中毒，造成結(jié)締組織出現(xiàn)裂縫，冠狀血管纖維化。世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定作為食用菜油的芥酸含量必須低于5%，2003年，澳大利亞食品標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定人體每天攝入的芥酸的上限是500 mg/d［4］。

雖然攝取一定量芥酸存在健康風(fēng)險(xiǎn)，但芥酸在工業(yè)生產(chǎn)中具有重要用途，它是一種重要化工原料，通常用于制備人造纖維、聚酯類紡織助劑、PVC穩(wěn)定劑、油漆干性劑、表面涂料樹脂，以及加工山萮酸、芥酸酰胺等。芥酸及其甘油酯可應(yīng)用于食品工業(yè)或化妝品制造業(yè)，還可用于生產(chǎn)表面活性劑（洗滌劑）。鑒于在食用和工業(yè)上的不同要求，芥酸基因工程改造有兩個(gè)不同的方向——對(duì)于用于食用植物油的作物的改造方向是降低芥酸含量，而用于工業(yè)品應(yīng)用的作物的改造方向是提高芥酸含量。

神經(jīng)酸是另一種重要的單不飽和脂肪酸。1927年由Tsujimoto等在軟骨魚（Elasmobranch fishe）的脂肪中發(fā)現(xiàn)。碎米芥（Cardamine hirsuta L.）、遏藍(lán)菜（Thlaspi caerulescens）、蒜頭果（Malania oleifera）、元寶楓（Acer truncatum Bunge）等植物和微藻（Mychonastes afer）中神經(jīng)酸含量較高［5］。對(duì)于神經(jīng)酸的研究由來已久，早在20世紀(jì)，英國神經(jīng)學(xué)教授Sinclar等研究發(fā)現(xiàn)，鯊魚腦組織在受到重創(chuàng)后的短時(shí)期內(nèi)能夠自行修復(fù)，該現(xiàn)象被證明是因?yàn)轷忯~腦組織中的神經(jīng)酸在修復(fù)大腦神經(jīng)信息傳遞通道——神經(jīng)纖維上發(fā)揮作用，這一發(fā)現(xiàn)隨即引起世界多國科學(xué)家的高度重視［6］。Yumazaki等［7］在對(duì)日本40歲男性進(jìn)行大量調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)酸在血漿中的含量比例與血液磷脂水平和代謝綜合癥有十分密切的聯(lián)系。

神經(jīng)酸是大腦神經(jīng)纖維和神經(jīng)細(xì)胞的核心天然成分。隨著年齡的增長(zhǎng)，身體中的神經(jīng)酸缺乏將會(huì)引起腦中風(fēng)后遺癥、老年癡呆、腦癱、腦萎縮、記憶力減退及失眠健忘等腦疾病［8］。因此，近年來神經(jīng)酸受到制藥、營養(yǎng)等行業(yè)的關(guān)注。在國內(nèi)，對(duì)于神經(jīng)酸的保健功能開發(fā)還有待提升。另外，日本等國科學(xué)家研究證明，神經(jīng)酸對(duì)艾滋病逆轉(zhuǎn)錄酶有很強(qiáng)的抑制作用［9］。這一研究成果為幫助尋找抗艾滋病的有效藥物開辟了一條新的途徑，展示了VLCMFA廣闊的應(yīng)用前景。

2 超長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸的生物合成途徑

脂肪酸生物合成途徑是生物體基礎(chǔ)的新陳代謝途徑之一。其中，VLCMFA的生物合成是很重要的一個(gè)分支?！俺L(zhǎng)鏈”和“單不飽和”是VLCMFA具有的兩個(gè)性質(zhì)，這也決定了它們的合成過程有別于超長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸。以植物VLCMFA的合成為例，從時(shí)間和邏輯上可以分為3個(gè)階段：（1）脂肪酸鏈的基本合成（在質(zhì)體基質(zhì)進(jìn)行）；（2）油酸的形成（發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）；（3）單不飽和脂肪酸鏈的延長(zhǎng)（發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）。

圖2 脂肪酸合成代謝途徑

表1 植物果實(shí)總油量及芥酸、神經(jīng)酸含量

形成單不飽和脂肪酸的前提是C18鏈的脂酰胺鏈（主碳鏈）的從頭合成。在動(dòng)物和酵母中，該反應(yīng)主要在細(xì)胞質(zhì)中完成，而植物細(xì)胞脂肪酸合成主要發(fā)生在質(zhì)體的基質(zhì)當(dāng)中［14］，由脂肪酸合酶復(fù)合體催化，脂肪酸合酶復(fù)合體（Fatty acid synthase complex，F(xiàn)AS）包含有7種酶活性和一個(gè)酰基載體蛋白（ACP）。植物在質(zhì)體中合成的脂肪酸要通過轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制將其運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞的其他部位。乙酰-CoA是脂肪酸生物合成的前體，在脂酰鏈的延伸過程中，首先由ACP轉(zhuǎn)移酶催化下實(shí)現(xiàn)將乙酰-CoA的乙?；D(zhuǎn)移到ACP上，形成乙酰-ACP。隨后，在丙二酸單酰-CoA-ACP轉(zhuǎn)酰酶的催化下，合成丙二酸單酰-ACP。有了這兩個(gè)底物之后，在可溶性的脂肪酸合成酶復(fù)合體的作用下進(jìn)行（圖2）4步循環(huán)反應(yīng)［15］。調(diào)節(jié)脂肪酸合成的途徑可以分成兩類：脂肪酸的合成是由一個(gè)多功能蛋白質(zhì)起催化作用的，稱為I型合成；如果是由4個(gè)單獨(dú)的單功能蛋白質(zhì)催化合成，則稱為II型合成。一般的植物脂肪酸合成是II型合成。一般植物的飽和脂肪酸的合成在C18以下時(shí)分為3個(gè)不同的階段：C2-C4；C4-C16；C16-C18。之所以這樣將其分成3個(gè)階段，是由于催化這3個(gè)階段的3-酮脂酰-ACP合酶（3-ketoacyl-ACP synthase，KCS）不同，分別為KCSI型、KCSII型和KCSIII型［16］。KCSIII負(fù)責(zé)將乙酰-CoA和甲酯酰-CoA縮合成為4碳單位；接著KCSI負(fù)責(zé)將4碳單位延長(zhǎng)到C16；最后KCSII負(fù)責(zé)將C16延長(zhǎng)到C18。

植物中大多數(shù)的脂肪酸為C16和C18脂肪酸。其中C18∶1，C18∶2，C18∶3，C16∶0，C18∶0這5種脂肪酸幾乎構(gòu)成了植物膜上甘油酯類的90%。油酸合成發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是通過脂肪酸去飽和酶（Fatty acid desaturatase）的催化，以硬脂酸（C18∶0）為底物氧化形成的，此過程需要以O(shè)2為電子受體，NADPH為電子供體，通過定向酶促反應(yīng)合成［17］。

VLCMFA的合成是以細(xì)胞溶液中的單不飽和脂肪酸（主鏈碳原子數(shù)小于C20）為底物，通過多酶復(fù)合體系進(jìn)行脂肪酸鏈的延長(zhǎng)而合成的［18］。在超長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)的過程中，植物和酵母有很多相似之處。大量研究表明，超長(zhǎng)鏈脂肪酸的延長(zhǎng)與原始的合成是完全不同的兩種方式［19］。在原始合成過程中，延長(zhǎng)酶是利用丙二酰-CoA和乙酰-CoA作為底物［20］，利用NADPH作為還原力［21］。而第三階段的VLCMFA（＞C20）的合成是以第一階段的油酸為底物，通過超長(zhǎng)鏈脂肪酸鏈延長(zhǎng)循環(huán)（Very long chain fatty acid elongation cycle）進(jìn)行碳鏈的延長(zhǎng)，每次循環(huán)能夠使原有脂肪酸的碳鏈延長(zhǎng)兩個(gè)碳原子，從而相繼形成：鱈油酸（20∶1△9c），芥酸（22∶1△13c），神經(jīng)酸（24∶1△15c）。這個(gè)延長(zhǎng)過程受4個(gè)酶形成的酶復(fù)合體的組合催化和調(diào)控，它們分別是（圖3）：①3-酮酯酰-CoA合酶（3-ketoacyl-CoA synthase），②3-酮酯酰-CoA還原酶（3-ketoacyl-CoA reductase），③3-羥酯酰-CoA脫水酶（3-hydroxyacyl-CoA dehydrase）和④羥酯酰-CoA還原酶（enoyl-CoA reductase）。最終形成比之前多兩個(gè)C原子的脂肪酸鏈。

圖3 超長(zhǎng)鏈脂肪酸的延長(zhǎng)循環(huán)機(jī)制

3 超長(zhǎng)鏈單不飽和脂肪酸延長(zhǎng)循環(huán)的關(guān)鍵酶

參與VLCMFA延長(zhǎng)循環(huán)反應(yīng)主要包括4個(gè)酶復(fù)合體，都是膜蛋白，均在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）［22，23］。其中對(duì)3-酮脂酰-CoA合酶（3-ketoacyl-CoA synthase，KCS）和3-酮脂酰-CoA還原酶（3-ketoacyl-CoA reductase，KCR）的研究較為深入，目前被認(rèn)為是關(guān)鍵催化步驟。

3.1 3-酮脂酰-CoA合酶

3-酮脂酰-CoA合酶（KCS）屬于轉(zhuǎn)移酶（Transferase），在整個(gè)超長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶復(fù)合體（Very long fatty acid elongase complex）中起到了極其重要的作用，是限速酶［12］。通常，KCS氨基酸序列有一個(gè)“組氨酸box”屬于保守序列，N端存在兩個(gè)膜結(jié)合位點(diǎn)［24］。在Vitis vinifera、C. graeca、L. annua等植物中都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了KCS，并克隆了相關(guān)基因，進(jìn)行了外源表達(dá)。擬南芥中的KCS基因與查爾酮合酶、葡萄芪合成酶以及酮乙酰-ACP合酶II都有一定的同源性［25］。Ketoacyl-ACP合成酶III、多肽合成酶和KCSs這3種酶被認(rèn)為擁有同樣的3步催化反應(yīng)。

隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中存在3種不同的KCS-like基因家族：FAE-like家族；ELO-like家族和 CER2-like家族。其中FAE是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)，并且只在種子中特異催化的縮合酶，在C20和C22脂肪酸的合成中起作用。另外，CER6也是FAE-like家族成員，被認(rèn)為是C24脂肪酸合成所必須的KCS［26］。除了FAE和CER6之外，其他的FAE-like家族成員的功能尚不清楚。ELO-like家族由4個(gè)成員組成（AtELO1、AtELO2、AtELO3和AtELO4），其中，AtELO1、AtELO3和AtELO4特異的在葉片的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表達(dá)，而AtELO2幾乎在擬南芥所有組織器官中皆有表達(dá)［27］。AtELO4能夠使敲除了ELO2和ELO3基因的酵母仍能生長(zhǎng)，而且敲除了AtELO4基因的擬南芥，C26脂肪酸含量明顯下降，C22和C24脂肪酸含量明顯增加，說明AtELO4在C26脂肪酸的延長(zhǎng)中起到了重要作用［28］。2013年，Pascal等［29］發(fā)現(xiàn)了CER2-like家族，能夠參與擬南芥的大于C28脂肪酸的延長(zhǎng)，但是根據(jù)序列的同源性，它應(yīng)屬于乙酰CoA依賴型的乙酰轉(zhuǎn)移酶蛋白家族（BAHD），這與其在脂肪酸延長(zhǎng)中表現(xiàn)出的活性完全不同。

KCS基因的表達(dá)調(diào)節(jié)與十字花科（Brassicaceae）植物產(chǎn)芥酸存在直接關(guān)聯(lián)。2013年，Sun等［30］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AE1基因的表達(dá)調(diào)節(jié)差異而不是序列變異導(dǎo)致了不同植物芥酸的產(chǎn)量不同。他們發(fā)現(xiàn)在高和低芥酸產(chǎn)量的十字花科植物中，F(xiàn)AE1基因保守的4個(gè)組氨酸殘基和6個(gè)半胱氨酸的保守位點(diǎn)都存在，說明并非是保守位點(diǎn)的異同導(dǎo)致芥酸的高低。

3.2 3-酮脂酰-CoA還原酶

3-酮脂酰-CoA還原酶（3-ketoacyl-CoA reductase）催化3-酮脂酰-CoA還原成3-羥脂酰-CoA。

植物與酵母在脂肪酸合成方面存在不少相同點(diǎn)。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的3-酮脂酰-CoA還原酶1（KCR1）與酵母的YBR159有較高的同源性。雖然在擬南芥當(dāng)中還有另外一個(gè)KCR2基因（與KCR1具有45%的相似性），但是酵母表達(dá)驗(yàn)證表明，只有KCR1在擬南芥的脂肪酸延長(zhǎng)當(dāng)中起作用［31，32］。不過這種現(xiàn)象并不普遍，在玉米（Zea mays）中也存在兩個(gè)KCR同源基因（GL8A和GL8B），其不僅相似性達(dá)到了97%，而且兩者都在超長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成當(dāng)中起作用［33］。雖然，KCS被認(rèn)為是整個(gè)VLCMFA合成復(fù)合酶的限速酶，但是，Puyaubert等［34］的研究發(fā)現(xiàn)，KCR基因同F(xiàn)AE1的共表達(dá)（co-expression）在“高芥酸油菜籽”和“低芥酸油菜籽”中存在著明顯的不同，說明KCR基因同KCS基因有著直接或者間接的聯(lián)系。

4 芥酸和神經(jīng)酸的代謝工程

在油料作物的育種方面，降低芥酸在總油中的含量，可以提高食用油的質(zhì)量。同時(shí)由于芥酸是很多工業(yè)產(chǎn)品的必不可少的原料，所以近些年關(guān)于芥酸的生物合成和生物工程改造也越來越多（表2）。倘若植物種子芥酸的含量能夠提高到總油脂的90%，那么就可以直接用于化工產(chǎn)業(yè)中［35］。

表2 芥酸和神經(jīng)酸的代謝工程

Mietkiewska等［36］克隆得到T. majus的脂肪酸延長(zhǎng)酶1（Fatty acid elongase 1，F(xiàn)AE1）發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AE1對(duì)于C20∶1延長(zhǎng)合成C22∶1具有較高的酶學(xué)特異性。將FAE1基因分別導(dǎo)入到酵母、煙草和擬南芥中進(jìn)行異源表達(dá)，使得擬南芥的芥酸產(chǎn)量提高了8倍，并發(fā)現(xiàn)C20∶1所占比例明顯的下降（18%下降到8%）。Rossak等［37］注意到，擬南芥中的FAE1基因的轉(zhuǎn)錄水平在其胚芽中最高，且在胚芽生長(zhǎng)4 d后即開始表達(dá)，14 d后，F(xiàn)AE1的表達(dá)量達(dá)到最高值。據(jù)此，研究者們發(fā)現(xiàn)FAE1所特有的啟動(dòng)子在植物體外和體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)效果都比普通的napin啟動(dòng)子好，且FAE1的轉(zhuǎn)錄高峰期與油脂的積累在時(shí)間上十分吻合，從而給利用FAE1作為目的基因進(jìn)行代謝工程改造的工作提供了很好的參考。

Jadhav等［38］的研究從另外一種思路提高芥酸含量：他們發(fā)現(xiàn)，在伊索比亞芥（B. carinata）中，芥酸合成的一個(gè)重要限制因素是C18∶1的含量不足，而油酸去飽和酶，F(xiàn)AD2和FAD3是以C18∶1為底物的脂肪酸脫飽和酶，使得C18∶1發(fā)生氧化形成C18∶2和C18∶3，消耗超長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶特異底物C18∶1，導(dǎo)致芥酸的合成量較少。因此，他們利用共抑制法（Co-suppressed）和反義抑制法對(duì)于FAD2基因進(jìn)行抑制，從而減少C18：1的去飽和，相應(yīng)的C22∶1所占比例也有了較為明顯的提高（提高27%），同時(shí)總產(chǎn)油量也有提高（12%）。Li等在此基礎(chǔ)上，結(jié)合Cao等［39］的研究得出溶血磷脂酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（Lysophosphatidic acid acyltransferase，LPAAT）在植物中的功能失活很可能是油料植物合成C22∶1的又一個(gè)重要限制因素，（LPAAT能夠?qū)⒔嫠嵫b配到三?；视偷膕n-2位置，從而能夠完成一次脂肪酸的延長(zhǎng)）并進(jìn)行了一系列的油料植物的基因工程。將LPAAT和BnFAE1（BnFAE1是來自B. napus的3-酮脂酰-CoA合酶，主要負(fù)責(zé)將C18∶1延長(zhǎng)形成C20∶1［40］）兩個(gè)基因進(jìn)行了過表達(dá)，并下調(diào)了FAD2基因，從而使得油料植物C. abyssinica的產(chǎn)芥酸量從野生型的28%提高到了73%［41］。

在確定C. abyssinica是一種理想的產(chǎn)芥酸植物之后，Li等［42］開發(fā)出一套高效的轉(zhuǎn)化和檢測(cè)方法，利用潮霉素（10 mg/L）作為篩選標(biāo)記，并對(duì)Southern和qRT-PCR分析方法進(jìn)行改進(jìn)，更好的適合轉(zhuǎn)化后C. abyssinica的分析。甘油二酯（Diacylglycerol，DAG）在甘油三酯（TAG）和膜結(jié)合脂類（Membrane lipids）起到了重要的分支點(diǎn)作用（Branch point）［43］。同位素標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)證實(shí)在大豆的磷脂和甘油三酯合成過程中，DAG起到了不同的動(dòng)力學(xué)作用［44］。據(jù)此，2014年，Guan等［45］發(fā)現(xiàn)DAG和PC（卵磷脂）之間較低的相互作用是C. abyssinica產(chǎn)芥酸的主要瓶頸。神經(jīng)酸的化學(xué)合成自20世紀(jì)30年代就已實(shí)現(xiàn)，但這種方法得率低且難提純，無法進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)，因此亟待發(fā)掘更成熟和安全有效的方法。

雖然很多研究表明KCS基因?qū)τ诘孜餂]有很強(qiáng)的選擇特異性，但是有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)KCS利用的底物為C22∶1時(shí)，神經(jīng)酸的產(chǎn)量比其他底物高數(shù)倍。例如，Guo等［12］的研究表明，將L. annua的KCS基因?qū)氲綌M南芥（富含C20∶1）和B. carinaca（富含C22∶1）之中，經(jīng)過異源表達(dá)，B. carinaca所產(chǎn)神經(jīng)酸量遠(yuǎn)高于擬南芥，使最高的神經(jīng)酸含量達(dá)到了30%，但同時(shí)芥酸的含量仍然維持在25%的高水平。隨后他們又進(jìn)行了深入研究：從含有高達(dá)54%神經(jīng)酸的C. graeca中克隆得到其KCS基因，在酵母中對(duì)基因功能進(jìn)行驗(yàn)證，得到神經(jīng)酸，并將其在“種子特異啟動(dòng)子”的調(diào)控下，在產(chǎn)油植物B. carinaca中異源表達(dá)，最終使得神經(jīng)酸產(chǎn)量達(dá)總油脂的44%，并將其芥酸含量降低到了6%［46］，這對(duì)后續(xù)利用代謝工程手段改造神經(jīng)酸生產(chǎn)菌株提供了重要的思路及參考。

總之，目前對(duì)芥酸和神經(jīng)酸的代謝工程研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，包括找到了延長(zhǎng)酶體系，基本了解延長(zhǎng)機(jī)制，并對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行了克隆和異源表達(dá)。但是目前的認(rèn)識(shí)還不滿足理性設(shè)計(jì)提升產(chǎn)量的要求，主要存在以下問題：（1）雖現(xiàn)在當(dāng)前認(rèn)為KCS基因是延長(zhǎng)循環(huán)過程的關(guān)鍵基因，但是，單一KCS基因?qū)φ麄€(gè)過程的調(diào)控機(jī)制尚不清楚；（2）還沒有找到特別好的目標(biāo)載體，對(duì)其進(jìn)行高效、系統(tǒng)和有目的的改造。

5 展望

VLCMFA具有獨(dú)特的藥效、保健功效和工業(yè)用途。目前，VLCMFA的生物合成路徑已基本清楚，但是，對(duì)催化碳鏈延長(zhǎng)的關(guān)鍵酶及其調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)還不足，如KCS、KCR的底物選擇性、協(xié)同作用等。應(yīng)用代謝工程方法提高植物的芥酸或神經(jīng)酸含量已有嘗試，但是產(chǎn)量有待提高。除植物組織，產(chǎn)油微生物是開發(fā)VLCMFA的潛在細(xì)胞工廠，如產(chǎn)油酵母Y. lipolytica具有產(chǎn)油量高、易培養(yǎng)、繁殖快等特點(diǎn)，并且該酵母屬于 “生物安全性第一級(jí)微生物（Biosafety class 1 microorganism）”［47］。美國杜邦公司已經(jīng)將Y. lipolytica產(chǎn)超長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸EPA產(chǎn)業(yè)化［48］。當(dāng)前，芥酸和神經(jīng)酸的代謝工程改造還沒有達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求，VLCMFA生物合成的深入研究將推動(dòng)相關(guān)的應(yīng)用開發(fā)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

The Biosynthesis and Metabolic Engineering of Very Long-chain Monounsaturated Fatty Acid

Tian Deyu1，2Wang Shian2Wang Lihao1Wang Jialin1Li Fuli2
（1. Laboratory of Fermentation Engineering，College of Chemical Engineering，Qingdao University of Science and Technology，Qingdao 266061；2. Qingdao Engineering Laboratory of Single Cell Oil，Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology，Chinese Academy of Sciences，Qingdao 26601）

Very long-chain monounsaturated fatty acids（VLCMFA）are fatty acids with aliphatic tail of≥ 20 carbons and a sole unsaturated double bond. VLCMFA has been discovered in a variety of plants and a few of microalgae. Up to now， four VLCMFAs have been identified， they are gadoleic acid（C20∶1）， erucic acid（C22∶1）， nervonic acid（C24∶1）， and ximenic acid（C26∶1）. VLCMFA shows great potentials in pharmaceutical and chemical industries. This review focuses on the research progress on biosynthesis and metabolic engineering of VLCMFA， which aims at providing the reference for its applications.

fatty acid；very long-chain monounsaturated fatty acid；erucic acid；nervonic acid；metabolic engineering

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.006

2015-03-24

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（U1232126）

田德雨，男，碩士，研究方向：代謝工程；E-mail：tdyqust@hotmail.com

王家林，男，教授，研究方向：發(fā)酵工程；E-mail：wangjialin5518@sina.com李福利，男，研究員，研究方向：微生物的生理生化；E-mail：lifl@qibebt.ac.cn