龍眼核中多酚提取及抗氧化活性的研究

唐福才，姚敦琛，關(guān)天旺，陳亞蘭，黃思敏，潘龍，馮藝帆，梁雁，喻麗紅，*

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，廣東廣州510182；2.廣州醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院，廣東廣州510182；3.廣州醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院，廣東廣州510182；4.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510182）

龍眼核中多酚提取及抗氧化活性的研究

唐福才1，姚敦琛2，關(guān)天旺3，陳亞蘭1，黃思敏4，潘龍2，馮藝帆4，梁雁1，喻麗紅4，*

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，廣東廣州510182；2.廣州醫(yī)科大學(xué)第三臨床學(xué)院，廣東廣州510182；3.廣州醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院，廣東廣州510182；4.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510182）

采用溶劑萃取、超聲輔助萃取和微波輔助萃取提取龍眼核中的多酚，比較萃取率以及其抗氧化活性的差異。分別采用溶劑萃?。ɑ亓鞣ê徒岱ǎ⒊曒o助萃取和微波輔助萃取提取龍眼核中的多酚，采用Folin-Ciocalteus法測定多酚含量并計(jì)算提取率；測定并比較多酚的總抗氧化能力、對羥自由基和DPPH自由基的體外抗氧化能力。不同方法提取多酚含量差異明顯，微波、回流、浸提和超聲的提取率分別是（13.60±0.46）%、（9.85±0.76）%、（8.65±0.43）%、（12.04±1.69）%。不同方法提取的龍眼核多酚抗氧化活性各樣差異，但總抗氧化能力大小差異不明顯。龍眼核多酚對·OH清除能力依次為：IC50超聲

龍眼核；多酚；超聲法；微波法；抗氧化

龍眼核的重量占龍眼果實(shí)鮮重的17%，中國是世界龍眼生產(chǎn)大國［1］，全國每年被廢棄的龍眼核高達(dá)2萬t以上。龍眼核中含有多種化合物，包括萜類、脂類、脂肪酸、酚類等，其中多酚類物質(zhì)含量豐富。Soong和Barlow［2-3］證實(shí)龍眼核中含有十三種多酚物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)龍眼核多酚的抗氧化活性與含量呈正比。

多酚即多羥基苯，如苯二酚、苯三酚等，是植物及微生物中產(chǎn)生的酚類次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗凝血、與金屬離子的絡(luò)合等特性［1］。多酚作為天然抗氧化劑，具有抗衰老、抗輻射、清體自由基等功能，對心腦血管疾病的防治，如冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、腦血栓等方面具有良好功效。但目前，管理的不合理、體系的不完善、工藝的落后等對龍眼核多酚的發(fā)展仍然有著極大的制約。因此，如何能夠充分、合理、科學(xué)地利用龍眼核，對龍眼核的綜合開發(fā)與利用具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本文采用溶劑萃取、超聲輔助萃取和微波輔助萃取提取龍眼核中的多酚，測定不同萃取法提取龍眼核中多酚的含量以及其的總抗氧化能力、對羥自由基和DPPH自由基的體外抗氧化能力的差異。研究不同提取方法得到的多酚抗氧化活性的差別，為龍眼核的廢物利用及多酚的提取開辟了新的思路。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

龍眼核：（購于樂購超市，產(chǎn)地高州）無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、沒食子酸、酚試劑（均為分析純，購買于百靈威科技有限公司）、SHZD（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市英予華儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52C：鞏儀市予華儀器有限責(zé)任公司；微波發(fā)生器MAS-Ⅱ：新儀微波化學(xué)科技有限公司；KQ-500VDE型三頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；202-1A型電熱恒溫干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；BS－124S電子天平：SartoriusAG，Sartorius；722S可見分光光度計(jì)：上海菁華科技；DFT-250手提式中藥粉碎機(jī)：貴州三陽包裝設(shè)備有限公司。

1.2材料預(yù)處理

將新鮮的龍眼核放置于60℃的恒溫干燥箱中，干燥至恒重。取出后用粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，裝入棕色廣口瓶中備用。

1.3方法

1.3.1龍眼核多酚的提取

1.3.1.1微波輔助萃取法

稱取龍眼核粗粉2 g，料液比為1∶20，分別加入75%的乙醇溶液，300 W微波3 min取出攪拌均勻后抽濾，收集濾液。提取完成后，取出燒杯慢慢攪拌，放置2 min～3 min后，用真空泵將原料與溶劑減壓抽濾分離，濾餅用同樣的條件重復(fù)提取2次，收集濾液，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸餾回收乙醇，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋干，稱量。將龍眼核多酚粗提取物用75%乙醇定容至50 mL備用。

1.3.1.2超聲波輔助萃取法

稱取龍眼核粗粉2 g，料液比為1∶20，分別加入75%的乙醇溶液，在超聲清洗器功率比99%，溫度60℃，提取30 min，取出攪拌均勻后抽濾，收集濾液。用布氏漏斗減壓過濾，濾餅用同樣的條件重復(fù)提取2次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋干，稱量。將龍眼核多酚粗提取物用75%乙醇定容至50 mL備用。

1.3.1.3乙醇浸提萃取法

稱取龍眼核粗粉2 g，料液比為1∶20，分別加入75%的乙醇溶液，在溫度60℃的恒溫水浴箱中，浸提6 h，取出攪拌均勻后減壓過濾，收集濾液。同樣的條件重復(fù)提取2次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋干，稱量。將龍眼核多酚粗提取物用75%乙醇定容至50 mL備用。

1.3.1.4乙醇回流萃取法

稱取龍眼核粗粉2 g，料液比為1∶20，分別加入75%的乙醇溶液，采用蒸餾回流提取裝置，提取4 h，取出攪拌均勻后抽濾，收集濾液。用布氏漏斗減壓過濾，濾餅用同樣的條件重復(fù)提取2次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋干，稱量。將龍眼核多酚粗提取物用75%乙醇定容50 mL備用。

1.3.2龍眼核多酚提取物的含量測定

1.3.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

多酚含量采用Folin-Ciocalteus法［4］（簡稱FC法）測定，以沒食子酸為對照品。參照李靜等［5］的方法，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定樣品多酚的含量。準(zhǔn)確稱取300 mg沒食子酸，先加入少量蒸餾水待沒食子酸完全溶解后，加入蒸餾水定容至500 mL，混合均勻得濃度為0.6 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。常溫下分別移取0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL到10 mL比色管，蒸餾水補(bǔ)足2 mL，加入福林酚甲試劑5 mL搖勻，反應(yīng)10 min后再加入福林乙試劑0.5 mL，振蕩后放置在25℃條件下靜置30 min，于750 nm［6］下測定吸光度，以沒加沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液的反應(yīng)液為空白對照，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2龍眼核多酚提取物的含量測定

取龍眼核多酚提取物備用液，參照1.3.2.1方法，配制樣品液，在750 nm處測其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出樣品濃度，并按下面公式（1）計(jì)算提取率。

式中：c為樣品的濃度（根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出），（mg/ mL）；v為樣品稀釋后的體積，mL；n為稀釋的倍數(shù)；m為粗提取物質(zhì)量，mg。

1.3.3龍眼核多酚提取物的總抗氧化能力測定

將龍眼核粗提物用75%乙醇稀釋，配制濃度為：0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL，采用總抗氧化能力試劑盒測定，以VC為陽性對照，對龍眼核多酚提取物的總抗氧化能力測定?？寡趸芰挝欢x為：在37℃下，每分鐘每毫升測定液使反應(yīng)體系吸光度增加0.01為一個(gè)總抗氧化能力單位（U/mL）。

1.3.4龍眼核多酚提取物對羥自由基清除能力測定

將龍眼核粗提物用75%乙醇稀釋，配制濃度為：0、0.02、0.16、0.24、0.32、0.48 mg/mL和0.64 mg/mL，采用羥自由基測定試劑盒法，以VC為陽性對照，對龍眼核多酚提取物的羥自由基清除能力測定。

1.3.5龍眼核多酚提取物對DPPH·的清除測定［7］

將龍眼核粗提物用75%乙醇稀釋，配制濃度為：0、0.001、0.004、0.008、0.012、0.016和0.032 mg/mL的系列質(zhì)量濃度，各取2 mL分別加入2 mL無水乙醇，在517 nm波長處測定其吸光度（Aj）；另取上述系列濃度的提取液各2 mL，分別加入2×10-4mol/mL DPPH·溶液2 mL，混合均勻，30 min后在同樣條件下測定其吸光度（Ai）；并在同樣條件下測定2×10-4mol/mLDPPH·溶液的吸光度度（A0），用同樣濃度系列的VC溶液作陽性對照。根據(jù)公式（2）計(jì)算龍眼核提取液對DPPH·的抑制率。

1.3.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：利用SPSS 17統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，組間數(shù)據(jù)比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，（使用SPSS17軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。測定結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，顯著性檢驗(yàn)為t檢驗(yàn)，顯著性水平為P<0.05，極顯著性水平為P<0.01。

2結(jié)果

2.1龍眼核多酚提取物的含量測定

按1.2.1的方法制作沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的回歸方程為y=5.264 3x+0.020 8，R2=0.982 3，在1 μg/mL～7 μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)分別采用微波萃取法、超聲萃取提法、乙醇浸提法和回流法從龍眼核中提取多酚物質(zhì)，4種方法得到龍眼核多酚含量，提取率分別是（13.60±0.46）%、（9.85±0.76）%、（8.65±0.43）%、（12.04±1.69）%。微波和超聲波萃取法提取效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)浸提法和回流法，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.05。

表1　不同方法提取龍眼核多酚得率Table 1The extracted rates of polyphenol from Lengan seeds

2.2龍眼核多酚提取物的總抗氧化能力測定（FRAP法）

還原力的測定可檢驗(yàn)化合物是否為良好的電子供應(yīng)體，它所提供的電子可以使Fe3+還原為Fe2+，從而使體系溶液顏色改變，即反映出體系中氧化還原狀態(tài)的改變。體系溶液吸光值越大，則表示被測物還原力越強(qiáng)，抗氧化效果越佳。從圖1可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，微波、回流、浸提以及超聲提取的多酚的總抗氧化能力分別為：（30.03±3.72）、（35.67±1.61）、（39.75± 4.34）、（38.65±1.61）U/mg，不同方法提取的多酚總抗氧化能力無明顯差異，p>0.05。均明顯低于VC總抗氧化能力：（200.52±4.21）U/mg。

圖1　龍眼核多酚的總抗氧化能力Fig.1Total antioxidant capacity of polyphenol from Lengan seeds

2.3龍眼核多酚提取物對羥自由基清除能力測定

·OH是活性氧中最活潑的氧自由基之一，它幾乎能與活細(xì)胞中任何分子發(fā)生反應(yīng)，可介導(dǎo)機(jī)體組織脂質(zhì)過氧化，蛋白質(zhì)解聚、聚合，核酸斷裂和多糖裂解等生化過程，引發(fā)組織細(xì)胞病變、導(dǎo)致各種疾病發(fā)生、加速機(jī)體衰老。減少此類自由基可預(yù)防衰老、心血管疾病等，并具有防癌抗癌的作用。

不同方法提取的龍眼核多酚對·OH清除能力如圖2所示。

不同方法提取的龍眼核多酚對·OH表現(xiàn)出良好地清除能力，IC50VC＜IC50超聲＜IC50微波

圖2　龍眼核多酚提取物對·OH清除能力Fig.2Scavenging effect of polyphenol from Lengan seeds on hydroxyl radical

2.4龍眼核多酚提取物對DPPH·的清除測定

DPPH·自由基是一種合成的有機(jī)自由基，常用來研究酚類抗氧化劑的構(gòu)效關(guān)系，是近年來受到國內(nèi)外普遍重視的一種分析抗氧化活性的方法。它是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基，其乙醇溶液呈紫色，并在波長517 nm處有強(qiáng)烈吸收。在有自由基清除劑存在時(shí)，自由基清除劑提供1個(gè)電子與DPPH的孤對電子配對而使其褪色，褪色程度與其接受的電子呈定量關(guān)系，在波長517 nm處的吸光度變小，其變化程度與DPPH自由基清除程度呈線性關(guān)系。

表2　龍眼核多酚提取物對DPPH·的清除能力Table 2Scavenging effect of polyphenol from Lengan seeds on DPPH radical

由表2可知，四種方法提取的多酚對DPPH自由基具有良好的清除能力，微波、超聲浸提以及回流提取的多酚清除DPPH自由基的IC50分別為0.007 87± 0.000 372、0.009 68±0.000 614、0.010 7±0.000 261、0.007 92±0.000 301。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對羥自由基的清除作用呈現(xiàn)出良好的濃度效應(yīng)關(guān)系，并且濃度越大，龍眼核多酚的清除DPPH自由基能力呈上升趨勢，并逐漸達(dá)到飽和狀態(tài)，變化也逐漸趨于緩慢。

3結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)采取微波、超聲、浸提和回流提取龍眼核中多酚，結(jié)果顯示，微波萃取法較超聲萃取法提取效果好，微波和超聲波萃取法提取效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)浸提法和回流法，即W微波>W超聲>W回流>W乙醇。其原因可能在于微波提取過程中，微波輻射導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)的極性物質(zhì)吸收微波能，產(chǎn)生大量熱量，使細(xì)胞內(nèi)溫度迅速上升，液態(tài)水汽化所產(chǎn)生的壓力在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁上形成微小孔洞，使胞外溶劑容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，溶解并釋放出胞內(nèi)物質(zhì)，并且由于多酚具有一定的極性，便在微波電磁場作用下產(chǎn)生瞬時(shí)極化，從而產(chǎn)生鍵的振動(dòng)、撕裂和粒子之間的相互摩擦、碰撞，促進(jìn)分子活性部分（極性部分）更好地接觸和反應(yīng)［8-9］。這一方法有效的減少了植物多酚在高溫環(huán)境下的氧化，提高了植物多酚的提取質(zhì)量，且短時(shí)微波提取對植物多酚幾乎沒有破壞。該方法提取龍眼核多酚提取率最高。超聲波產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)和物化作用打破植物細(xì)胞壁，并利用超聲的清洗作用加快細(xì)胞內(nèi)含物的釋放，提高了提取效率，縮短了時(shí)間，避免了高溫對提取成分的影響，但純度不高，故該方法龍眼核多酚提取率次于微波法。作為傳統(tǒng)提取方法，回流和浸提法提取周期較長，提取率較低，溶劑極性、溶劑pH、料液比、提取溫度均會影響多酚活性和多酚提取率。

同時(shí)，試驗(yàn)通過測量總抗氧化能力、清除DPPH能力和羥基自由基能力來評價(jià)龍眼核多酚的抗氧化作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，四種方法提取所得龍眼核多酚均有較好的體外抗氧化能力。其作用機(jī)理可能在于多酚類化合物酚羥基中的鄰位酚羥基極易被氧化，且對活性氧等自由基有較強(qiáng)的捕捉能力，使其具有較強(qiáng)的抗氧化性和清除自由基的能力［10］。但四種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在較大差異。不同方法提取的多酚總抗氧化能力無明顯差異。龍眼核多酚對·OH清除能力為：龍眼核多酚對DPPH清除能力為：不同方法提取龍眼核多酚的抗氧化能力存在差異。這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)過程的差異及與上述方法評價(jià)抗氧化活性的機(jī)制造成［11］。因此，需同時(shí)結(jié)合此四種方法對龍眼核多酚抗氧化作用進(jìn)行客觀、全面評價(jià)。通過綜合評估，微波提取龍眼核多酚抗氧化效果最佳，能有效的清除羥自由基和DPPH自由基，在一定范圍內(nèi)清除自由基能力和濃度成線性關(guān)系。

綜上，龍眼核多酚可作為抗氧化物質(zhì)潛在資源，不同提取方法龍眼核多酚抗氧化能力具有差異，具有較高的應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)效益。本文為下一步深入研究龍眼核的抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考，并為龍眼核多酚資源的充分利用奠定基礎(chǔ)。

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Study of the Extraction and Antioxidant Capactity of Ployphenol from Longan Seeds

TANG Fu-cai1，YAO Dun-chen2，GUAN Tian-wang3，CHEN Ya-lan1，HUANG Si-min4，PAN Long2，F(xiàn)ENG Yi-fan4，LIANG Yan1，YU Li-hong4，*
（1.The First Clinical College of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，Guangdong，China；2.The Third Clinical College of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，Guangdong，China；3.The Second Clinical College of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，Guangdong，China；4.The Medicine college of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，Guangdong，China）

Polyphenols were extracted from longan seeds by using solvent extraction，ultrasound-assisted extraction and microwave-assisted extraction respectively.The content of polyphenols was detemined by the Folin-Ciocalteus method，and the extracted rates were calculated.The antioxidant activity of extracts were evaluated by total reducing power，superoxide anion radical and DPPH free radical scavenging activities.The extracted rates of polyphenol were（13.60±0.46）%，（9.85±0.76）%，（8.65±0.43）%，（12.04±1.69）% respectively.It was revealed that there were significant differences among these methods.The most radical scavenging activity against superoxide anion radical and DPPH free radical was microwave-assisted extract.In conclusion，the best result was obtained from microwave-assisted extraction.It was a linear relationship between concentrations and free radical scavenging abilities within a certain range.

longan seed；ployphenol；ultrasonic；microwave；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.12.002

2015-01-03

2012-2013年度廣州醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目2013A0008；2014年國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目201410570014；2015年度廣東大學(xué)生科技創(chuàng)新培訓(xùn)專項(xiàng)資金立項(xiàng)項(xiàng)目

唐福才（1991—），男（漢），在讀本科生，從事天然藥物、心血管方向研究。

喻麗紅，女（漢），實(shí)驗(yàn)員，主要從事藥物化學(xué)的研究工作。