哈蟆油發(fā)酵乳對小鼠緩解體力疲勞能力的影響

郝　潔，邱智東，朱　凱，翁麗麗

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春130117）

哈蟆油發(fā)酵乳對小鼠緩解體力疲勞能力的影響

郝潔，邱智東，朱凱，翁麗麗*

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春130117）

目的：研究哈蟆油發(fā)酵乳緩解體力疲勞的作用。方法：選用雌性昆明種小鼠，設(shè)空白對照組及低、中、高3個(gè)劑量組，通過負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)及測定小鼠血清尿素氮含量、肝糖原含量及全血乳酸含量考察哈蟆油發(fā)酵乳藥理活性。結(jié)果：負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性，血乳酸、血清尿素氮2項(xiàng)生化指標(biāo)陽性，肝糖原實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性。結(jié)論：哈蟆油發(fā)酵乳具有緩解體力疲勞的作用。

哈蟆油，血乳酸，血清尿素氮，肝糖原，體力疲勞

哈蟆油又叫雪蛤油、林蛙油，系蛙科動(dòng)物中國林蛙（Rana temporaria chensinensis David.）雌蛙的輸卵管，經(jīng)采制干燥而得［1］。其味甘、咸、平，有補(bǔ)腎益精，養(yǎng)陰潤肺之效。藥材中含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪酸、無機(jī)元素及多種天然維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有明顯緩解體力疲勞的能力［2-3］，是滋補(bǔ)佳品，亦是食品、藥品、保健品的重要原料。

益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，是定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱。目前世界上研究的功能最強(qiáng)大的產(chǎn)品主要是各類微生物組成的復(fù)合活性益生菌，其廣泛應(yīng)用于生物工程、工農(nóng)業(yè)、食品安全以及生命健康領(lǐng)域［4］。益生菌發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生許多重要的營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、短鏈脂肪酸、抗氧化劑、氨基酸等。同時(shí)益生菌在胃腸道內(nèi)可產(chǎn)生消化酶，這些酶可幫助人體更好地消化所攝入的食品及吸收食品中的營養(yǎng)成分。益生菌還可競爭性抑制有害微生物吸收營養(yǎng)物質(zhì)及進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)［5-6］。

發(fā)酵中藥的應(yīng)用在我國具有悠久的歷史，是傳統(tǒng)中藥加工炮制的重要方法之一，通過發(fā)酵，使中藥藥效提高、藥性發(fā)生改變?，F(xiàn)代中藥發(fā)酵研究開始于上世紀(jì)80年代，是隨著現(xiàn)代生物技術(shù)、生物工程技術(shù)的發(fā)展而逐漸形成的。它的特點(diǎn)是用優(yōu)選的有益菌群的一種或幾種、一株或幾株作為菌種，加入中藥中，按照現(xiàn)代生物轉(zhuǎn)化技術(shù)制成生物轉(zhuǎn)化物，然后進(jìn)行藥化、藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究的新型工藝［7］。中藥進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，一方面可以減毒增效，通過微生物在生長過程中產(chǎn)生各種酶，將藥物的成分分解轉(zhuǎn)化為新的活性成分或?qū)⒍拘猿煞址纸舛档退幬锏亩靖弊饔?；一方面使中藥產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，增強(qiáng)藥物的功能或產(chǎn)生新的功能，為活性物質(zhì)的篩選提供新的途徑。因此對哈蟆油進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化具有現(xiàn)實(shí)意義。

由于當(dāng)今社會(huì)生活節(jié)奏很快，工作學(xué)習(xí)壓力很大，免疫力低下、易疲勞等亞健康人群基數(shù)很大，如果人們長期處于亞健康狀態(tài)，會(huì)產(chǎn)生一系列的疾病。全世界約有70%以上的人處于亞健康狀態(tài)，我國有60%～70%的人處于亞健康狀態(tài)。每年產(chǎn)品的需求量很大，因此研究具有緩解體力疲勞的保健品具有重要意義［8］。哈蟆油發(fā)酵乳系實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)，以吉林省道地藥材哈蟆油為基源，采用益生菌發(fā)酵而成的液體口服制劑。具有較易口服吸收，無刺激氣味的優(yōu)點(diǎn)。解決了哈蟆油固有的口感問題，并通過益生菌的作用將哈蟆油中諸多大分子物質(zhì)分解成小分子物質(zhì)，更易被人體快速和多途徑吸收。以微生物發(fā)酵技術(shù)開發(fā)出哈蟆油發(fā)酵保健食品，結(jié)合了益生菌的優(yōu)點(diǎn)，不但擴(kuò)大了哈蟆油的應(yīng)用范圍，也為哈蟆油產(chǎn)品開發(fā)利用開辟了一個(gè)新的途徑，將為吉林省哈蟆油產(chǎn)業(yè)的發(fā)展壯大做出貢獻(xiàn)［9］。本研究考察了哈蟆油發(fā)酵乳對小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)的影響，血清尿素氮、肝糖原以及血乳酸含量的影響，為哈蟆油在緩解體力疲勞方面的保健產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

表1　對小鼠力竭游泳時(shí)間的影響（n=10）Table 1　Effect on swimming time in mice（n=10）

1　材料與方法

1.1材料與儀器

硫酸北京化工廠，分析純；氯化鈉北京化工廠，分析純；尿素氮（BUN）測試盒、全血乳酸（Lactic Acid LD）測試盒、糖元測試盒南京建成生物工程研究所有限公司；昆明種雌性小鼠長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可號(hào)：SCXK-（吉）2011-0003，體重（18±2）g；哈蟆油發(fā)酵乳口服液長春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心。

Water Purifier實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)四川沃特爾科技發(fā)展有限公司；YJ03-43-4000電動(dòng)離心沉淀機(jī)天津市醫(yī)療器械三廠；HH-2恒溫水浴鍋江蘇金壇市江南儀器廠；imark酶標(biāo)儀北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司；游泳箱50cm×50cm×60cm。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年），判定受試物具有緩解體力疲勞的作用需進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目有：動(dòng)物體重，負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)及血乳酸、血清尿素氮、肝糖原/肌糖原含量測定［10］。因此，從這幾方面考察哈蟆油發(fā)酵乳的緩解體力疲勞活性。

1.2.1動(dòng)物分組與給藥將160只昆明種雌性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，按體重隨機(jī)分為4組：哈蟆油發(fā)酵乳低、中、高劑量組、空白對照組，每組40只，組間體重?zé)o差異。各組給藥量分別為低劑量組（0.05mL/10g）、中劑量組（0.1mL/10g）、高劑量組（0.2mL/10g），分別相當(dāng)于人體推薦劑量的5、10、20倍。空白對照組給予蒸餾水（0.2mL/10g），每天灌胃1次，連續(xù)30d［11］。

1.2.2指標(biāo)測定測量體重及進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)，測定血清尿素氮、肝糖原、血乳酸含量。

1.2.3小鼠體重的測定每隔6d對各組別小鼠體重進(jìn)行測量并比較。

1.2.4負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)?zāi)┐谓o藥30min后，于小鼠尾根部負(fù)荷5%體重鉛皮，并置于游泳箱中游泳。保持水溫（25±1.0）℃，水深40cm，記錄小鼠自游泳開始至沉入水中8s不能浮起的時(shí)間即為小鼠負(fù)重游泳時(shí)間［12］。

1.2.5肝糖原測定末次給藥30min后，處死實(shí)驗(yàn)小鼠，立即取新鮮肝臟，用生理鹽水漂洗，并用濾紙吸干，精確稱取肝臟75mg，采用蒽酮法［10］測定其肝糖原含量。

1.2.6血清尿素氮測定末次給藥30min后，令小鼠在水溫30℃的游泳箱中不負(fù)重游泳90min，再休息60min，拔眼球采血，于4℃冰箱冷藏3h，待血凝固后4000r/min離心15min，取上層血清用二乙?！糠ǎ?0］測定小鼠血清尿素氮含量。

1.2.7血乳酸測定末次給藥30min后，用毛細(xì)管從小鼠眼球內(nèi)眥采血100μL，然后不負(fù)重于水溫30℃的游泳箱中游泳10min，分別于運(yùn)動(dòng)后0、20min同上方法采血100μL，分別測定血乳酸含量［10］，按如下公式計(jì)算血乳酸曲線下面積。

血乳酸曲線下面積=5×（游泳前血乳酸值+3×游泳后0min的血乳酸值+2×游泳后休息20min的血乳酸值）。

1.3數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13.0軟件，通過單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果均表示為±s。

2　結(jié)果與分析

2.1哈蟆油發(fā)酵乳對小鼠體重的影響

實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，各組小鼠間體重?zé)o差異。經(jīng)過30d的實(shí)驗(yàn)，每隔6d對各組別小鼠的體重進(jìn)行比較，與對照組相比，哈蟆油發(fā)酵乳低、中、高劑量組小鼠體重差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05），說明哈蟆油發(fā)酵乳對小鼠體重增長無明顯影響。且發(fā)酵乳低、中、高劑量組小鼠活潑，皮膚光滑，精神狀態(tài)好，未見任何不良反應(yīng)。

2.2哈蟆油發(fā)酵乳對小鼠力竭游泳時(shí)間的影響

體力疲勞的最主要表現(xiàn)是運(yùn)動(dòng)耐力的下降，運(yùn)動(dòng)耐力是反映機(jī)體體力疲勞最客觀、最直接的指標(biāo)。機(jī)體抗疲勞能力加強(qiáng)最有力的宏觀表現(xiàn)即為運(yùn)動(dòng)耐力的提高，游泳時(shí)間的長短可以反應(yīng)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)疲勞的程度，以及抗疲勞的能力［12］。在力竭游泳實(shí)驗(yàn)中，對小鼠負(fù)重游泳時(shí)間進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，與對照組相比，哈蟆油發(fā)酵乳低、中、高劑量組均能延長小鼠游泳時(shí)間，且差異極顯著（p＜0.01）。其中低劑量組作用最佳，高劑量組作用次之，皆極顯著高于中劑量組（p＜0.01），說明哈蟆油發(fā)酵乳能顯著延長小鼠力竭游泳時(shí)間，負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

2.3哈蟆油發(fā)酵乳對小鼠肝糖原含量的影響

糖原是機(jī)體高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的主要能量來源，可通過無氧酵解方式及有氧氧化方式供能。肝糖原是能量儲(chǔ)備的直接單位，因此肝糖原的含量能說明疲勞發(fā)生的快慢程度［13］。運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大量肌糖原消耗，為維持血糖水平，肝糖原儲(chǔ)備量減少。如果哈蟆油發(fā)酵乳組肝糖原含量明顯高于對照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則說明哈蟆油發(fā)酵乳能夠通過增加肝糖原儲(chǔ)備為機(jī)體提供更多的能量，達(dá)到抗疲勞的目的［14］。實(shí)驗(yàn)小鼠肝糖原含量測定結(jié)果見表2，與對照組相比，哈蟆油發(fā)酵乳低、中、高劑量組均能增加肝糖原含量，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）；低、中、高各組間比較，差異均無顯著性（p＞0.05），說明哈蟆油發(fā)酵乳不能提高小鼠肝糖原的儲(chǔ)備量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰性。

表2　對小鼠肝糖原含量的影響（n=10）Table 2　Effect on liver glycogen content in mice（n=10）

2.4哈蟆油發(fā)酵乳對小鼠血清尿素氮含量的影響

尿素氮是蛋白質(zhì)代謝的最終產(chǎn)物。長時(shí)間運(yùn)動(dòng)后，血清尿素氮含量降低表明蛋白質(zhì)參與供能的比例相對減少，糖原、脂肪在運(yùn)動(dòng)中供能得到相應(yīng)加強(qiáng)。因此，血清尿素氮的含量在一定程度上表征了機(jī)體抗疲勞的能力［13］。實(shí)驗(yàn)小鼠血清尿素氮含量測定結(jié)果見表3，與對照組相比，哈蟆油發(fā)酵乳低、中、高劑量組均能降低小鼠運(yùn)動(dòng)后血清尿素氮水平，且高劑量組有顯著性差異（p＜0.05）；低、中、高各組間比較，差異均無顯著性（p＞0.05），結(jié)果表明高劑量哈蟆油發(fā)酵乳能顯著降低小鼠運(yùn)動(dòng)后血清尿素氮含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

表3　對小鼠血清尿素氮含量的影響（n=10）Table 3　Effect on serum urea nitrogen in mice（n=10）

2.5哈蟆油發(fā)酵乳對小鼠血乳酸含量的影響

乳酸是碳水化合物糖酵解的最終產(chǎn)物，而碳水化合物是短時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)最主要的能量來源。劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，肌肉內(nèi)供能方式主要是糖的無氧氧化，導(dǎo)致乳酸濃度增高［15］。乳酸的積累是生理性運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生疲勞的重要原因之一，可通過抑制乳酸的積累和加速乳酸的清除兩種機(jī)制來產(chǎn)生抗疲勞功效［13］。因此，乳酸被作為判斷疲勞程度、有氧代謝能力、控制運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度等的重要指標(biāo)之一［16］。實(shí)驗(yàn)小鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血乳酸含量測定結(jié)果見表4，表4表明，小鼠游泳前，與對照組相比，各劑量組血乳酸含量在同一水平上，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。游泳10min后，各劑量組血乳酸水平較游泳前均明顯升高，說明游泳使小鼠體內(nèi)堆積大量乳酸；各劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05），說明哈蟆油發(fā)酵乳各劑量組未能抑制乳酸的積累。游泳結(jié)束休息20min后，各劑量組血乳酸水平較剛游泳后均明顯降低，接近游泳前水平，哈蟆油發(fā)酵乳各劑量組的降幅明顯高于對照組，說明哈蟆油發(fā)酵乳能加速乳酸的清除；其中與對照組比較，哈蟆油發(fā)酵乳中劑量組血乳酸含量有顯著性差異（p＜0.05），高劑量組血乳酸含量有極顯著性差異（p＜0.01），低、中、高各組間比較，差異均無顯著性（p＞0.05）；各劑量組乳酸曲線下面積與對照組相比，高劑量組有極顯著性差異（p＜0.01）。低、中、高各組間比較，差異均無顯著性（p＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明哈蟆油發(fā)酵乳能顯著降低實(shí)驗(yàn)小鼠運(yùn)動(dòng)后血乳酸含量，可能是通過加速乳酸的清除的機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性。

表4　對小鼠血乳酸含量的影響（n=10）Table 4　Effect on blood lactic acid content in mice（n=10）

3　結(jié)論與討論

運(yùn)動(dòng)性疲勞的發(fā)生與能量消耗、代謝物堆積和內(nèi)環(huán)境變化等因素有密切聯(lián)系。研究顯示，在長時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中，糖原的大量消耗、血糖濃度的降低、乳酸等代謝產(chǎn)物的堆積能誘發(fā)疲勞發(fā)生［17］。本研究以肝糖原、血清尿素氮及血乳酸含量為指標(biāo)，結(jié)合力竭游泳實(shí)驗(yàn)，探討哈蟆油發(fā)酵乳對小鼠緩解體力疲勞能力的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，哈蟆油發(fā)酵乳各劑量組均能顯著延長小鼠力竭游泳時(shí)間（p＜0.01），其中低劑量組作用最佳，高劑量組作用次之，皆顯著高于中劑量組（p＜0.01），這與張梅等［11］研究的哈蟆油對小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)的影響結(jié)果近似。但低劑量組在血清尿素氮、血乳酸含量等方面并未表現(xiàn)出顯著影響。查閱許多相關(guān)文獻(xiàn)，很多都存在類似問題［11，18-19］，猜測生化指標(biāo)與運(yùn)動(dòng)指標(biāo)無直接對應(yīng)關(guān)系，那么，低劑量哈蟆油發(fā)酵乳通過什么途徑發(fā)揮緩解體力疲勞作用，還有待于進(jìn)一步研究。

血糖是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要能源，也是長時(shí)間運(yùn)動(dòng)時(shí)骨胳肌可動(dòng)用的重要燃料。長時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中肝糖原的儲(chǔ)備量決定運(yùn)動(dòng)達(dá)到力竭的時(shí)間［17］。本研究中小鼠經(jīng)30d實(shí)驗(yàn)后，各劑量組肝糖原含量均為增加，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05），說明哈蟆油發(fā)酵乳未能增加小鼠肝糖原儲(chǔ)備量。血清尿素氮是體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，在運(yùn)動(dòng)時(shí)，血清尿素氮可以評(píng)定運(yùn)動(dòng)負(fù)荷量的大?。?3］。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過60min恢復(fù)，哈蟆油發(fā)酵乳低、中、高劑量組血清尿素氮水平均較空白組低，且高劑量組有顯著性差異（p＜0.05）；說明哈蟆油發(fā)酵乳可以抑制血清尿素氮的生成或促進(jìn)其的清除，促進(jìn)疲勞小鼠的恢復(fù)。高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生大量乳酸，造成乳酸堆積，影響運(yùn)動(dòng)組織和器官的功能，進(jìn)而導(dǎo)致疲勞產(chǎn)生［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各劑量組哈蟆油發(fā)酵乳對小鼠游泳前與游泳10min血乳酸含量均無明顯影響，但運(yùn)動(dòng)恢復(fù)后與運(yùn)動(dòng)后即刻比較，有不同程度的下降。說明哈蟆油發(fā)酵乳未減緩小鼠運(yùn)動(dòng)后機(jī)體乳酸堆積的程度，但加速了血乳酸的消除，其原因是通過增強(qiáng)乳酸脫氫酶活性而使乳酸得以消除，還是通過其他途徑，還有待于進(jìn)一步研究。

根據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003年），負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性，且血乳酸、血清尿素氮、肝糖原3項(xiàng)生化指標(biāo)中任意2項(xiàng)指標(biāo)陽性，即可判定該受試物具有緩解體力疲勞的作用。本實(shí)驗(yàn)負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性，同時(shí)血乳酸、血清尿素氮2項(xiàng)生化指標(biāo)也為陽性。據(jù)此，本文初步證明了實(shí)驗(yàn)室所研發(fā)的哈蟆油發(fā)酵乳具有緩解體力疲勞作用，為哈蟆油在緩解體力疲勞方面的保健產(chǎn)品開發(fā)提供了一些理論依據(jù)。

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Effect of Oviductus Ranae fermented milk on the relief of physical fatigue effectiveness in mice

HAO Jie，QIU Zhi-dong，ZHU Kai，WENG Li-li*
（Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China）

Objective:To study the relief of physical fatigue effectiveness of Oviductus Ranae fermented milk. Methods:Mice were divided into high，medium and low does groups and one control group.Loading swimming test，levels of blood urea nitrogen，liver glycogen and blood lactate were detected to test the pharmacological activity of Oviductus Ranae fermented milk.Results:The swimming test showed positive result，blood lactate，blood urea nitrogen two biochemical indicators were positive，negative test results on glycogen.Conclusion: Oviductus Ranae fermented milk had effect on physical fatigue relief，it was a good health care product for the modern family.

Oviductus Ranae；blood lactic acid；blood urea nitrogen；liver glycogen；physical fatigue

TS201.4

A

1002-0306（2015）10-0352-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.066

2014－08－29

郝潔（1990-），女，碩士研究生，研究方向：中藥制劑方向。

翁麗麗（1969-），女，教授，研究方向：中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)。

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20120921）。