BMP—7抑制H22荷瘤小鼠腫瘤組織PCNA表達并上調(diào)E—cadherin的表達

潘玉　丁芹　王莉娜　宋正霞　顏學(xué)兵

[摘要] 目的 探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（bone morphogenetic protein-7， BMP-7）對H22荷瘤小鼠的抑制作用。 方法 該實驗時間為2014年9月—2015年1月，選擇清潔級昆明小鼠建立H22荷瘤小鼠模型，隨機分成3組：生理鹽水組、環(huán)磷酰胺組、BMP-7組。HE染色觀察腫瘤組織病理學(xué)變化；免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織內(nèi)增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）的表達；逆轉(zhuǎn)錄-PCR檢測組織內(nèi)E-cadherin的表達。 結(jié)果 HE染色顯示BMP-7組有大片壞死，有明顯的核碎裂、核溶解；環(huán)磷酰胺組細胞排列疏松，核質(zhì)比例減小，瘤內(nèi)有大片壞死。免疫組化顯示BMP-7及環(huán)磷酰胺組PCNA的表達均低于生理鹽水組 （F=34.78， P<0.05）。逆轉(zhuǎn)錄-PCR顯示環(huán)磷酰胺組E-cadherin的表達最高，其次是BMP-7組，生理鹽水組最低 （F=7.63，P<0.05）。 結(jié)論 BMP-7能下調(diào)H22荷瘤小鼠PCNA表達，并有上調(diào)E-cadherin表達的趨勢。

[關(guān)鍵詞] H22細胞；肝癌模型；BMP-7；PCNA

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2015）09（b）-0007-03

[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of bone morphogenetic protein-7（BMP-7） on H22 tumor-bearing mice. Methods The experiment time is from September 2014 to January 2015. H22 tumor bearing mice model was established， and randomly divided into 3 groups： normal saline group， cyclophosphamide group and the BMP-7 group. The pathological histomorphology of transplanted tumor was observed under a light microscope after hematoxylin-eosin （HE） staining. The expressions of proliferating cell nuclear antigen （PCNA） were detected by immunohistochemistry. The expressions of alpha smooth muscle actin （alpha-SMA）， E-cadherin were detected by reverse transcription-PCR. Results It was found that BMP-7 group had large areas of necrosis and obvious karyorrhexis and karyolysis. The tumor cells of cyclophosphamide group arranged loosely， nucleo cytoplasmic ratio decreased， and the tumor tissue had large areas of necrosis. It was found that the expressions of PCNA in BMP-7 group and cyclophosphamide group were lower than those in normal saline group， the differences were statistically significant （F=34.78， P<0.05） by the immunohistochemistry. The expression of E-cadherin in the cyclophosphamide group was the highest， followed by the BMP-7 group， the normal saline group was the lowest（F=7.63， P<0.05）. Conclusion BMP-7 can decrease the expression of PCNA in H22 tumor-bearing mice， with the trend of upregulating the expression of E-cadherin.

[Key words] H22 cell； Hepatocellular carcinoma model； BMP-7； PCNA

骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（bone morphogenetic protein-7，BMP-7）可通過拮抗轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）/Smad信號通路發(fā)揮抗炎、抗纖維化作用，并有多項研究證實其抗腫瘤作用[1-3]。已有研究顯示[4-5]BMP-7可通過拮抗TGF-β信號通路抗肝纖維化，而肝纖維化是由慢性肝炎發(fā)展至肝硬化、肝細胞癌的中間過程，因此BMP-7可能通過拮抗TGF-β信號通路，發(fā)揮抗肝細胞癌的作用。該實驗時間為2014年9月—2015年1月。選擇清潔級昆明小鼠建立H22荷瘤小鼠模型，探討B(tài)MP-7對H22荷瘤小鼠的抑制作用， 現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 動物及瘤株 清潔級昆明小鼠，雄性，20～26 g，購自徐州醫(yī)學(xué)院動物中心。小鼠肝癌細胞株H22由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所腫瘤實驗室惠贈。

1.1.2 主要試劑 重組人BMP-7購自美國Pepro Tech公司，HE染色試劑盒購自江蘇碧云天公司，增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen， PCNA）一抗購自武漢三鷹生物工程有限公司，兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，TIAN Script cDNA第一鏈合成試劑盒和2×PCR Master MIX購自天根生物科技有限公司。環(huán)磷酰胺購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立腫瘤模型、分組、給藥 H22肝癌細胞采用小鼠腹水方式傳代培養(yǎng)。無菌操作取H22小鼠腹水，臺盼藍染色，光鏡下瘤細胞計數(shù)，活瘤細胞>95%，調(diào)整細胞濃度為l×107細胞/mL，分別取0.2 mL接種于小鼠右前肢外側(cè)皮下，制成實體型荷瘤小鼠模型。將24只小鼠隨機分成3組，分別是生理鹽水組、環(huán)磷酰胺組、BMP-7組。各組于造模第二天開始給藥。生理鹽水組：生理鹽水0.2 mL；環(huán)磷酰胺組：環(huán)磷酰胺25 mg/kg，約0.2 mL；BMP-7組：rhBMP-7 3 ng/kg，約0.2 mL，分別尾靜脈注射，1次/d，連續(xù)14 d。

1.2.2 處死、取材 停藥第二天，頸椎脫臼處死小鼠，完整剝離瘤體。各組腫瘤標本分別于4%多聚甲醛固定、RNA Store液處理。

1.2.3 荷瘤小鼠移植瘤組織病理形態(tài)學(xué)觀察 肉眼觀察各組小鼠的移植瘤大體形態(tài)。然后，取部分荷瘤小鼠移植瘤組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制備4 μm厚切片，HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察各組織的形態(tài)，以及腫瘤細胞生長、壞死及對周圍組織的浸潤情況。

1.2.4 荷瘤小鼠移植瘤組織中增殖細胞核抗原（PCNA）的表達 操作按兔超敏二步法免疫組化染色試劑盒說明書進行，一抗PCNA抗體用0.01 M磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） l：200稀釋后使用。陰性對照以PBS代替PCNA抗體。以細胞核染成棕黃色或棕褐色為陽性反應(yīng)，染色的強弱代表組織中PCNA蛋白表達水平的高低。每個標本選取5個高倍視野（×400倍），應(yīng)用Image-Pro Plus軟件分析，計算每個視野下陽性染色的積分光密度（IOD）值及平均光密度（IOD/area）。

1.2.5 腫瘤組織總RNA提取及RT-PCR檢測 按Trizol說明書抽提總RNA，紫外分光光度計測吸光度值（A值），吸光度比值（A260/A280） 1.8～2.0之間，RT-PCR按TIAN Script cDNA第一鏈合成試劑盒和2×PCR Master MIX說明書操作。采用Primer 5.0分析設(shè)計引物序列（表1），引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察電泳結(jié)果，并用凝膠成像系統(tǒng)掃描照相，Image J軟件對圖像進行分析。

1.3 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析處理，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示；樣本方差齊性采用levene法檢驗，方差齊時采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法；方差不齊時采用Kruskal-Wallis法檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 荷瘤小鼠的一般情況

在實驗過程中，生理鹽水組荷瘤小鼠活動減少，步態(tài)不穩(wěn)，毛發(fā)稀疏，進食、進水量少，形體消瘦呈惡病質(zhì)，其中2只小鼠在用藥期間死亡，而環(huán)磷酰胺及BMP-7組小鼠病情相對于生理鹽水組較輕，用藥期間各有1只死亡。

2.2 荷瘤小鼠移植瘤組織病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

肉眼可見荷瘤小鼠H22移植瘤體呈結(jié)節(jié)狀，質(zhì)嫩，剖面呈魚肉狀。HE染色顯示腫瘤組織為未分化腺癌，生理鹽水組腫瘤細胞排列紊亂，細胞密度大，核質(zhì)比例大，核染色深且異型性明顯，可見較多瘤巨細胞，腫瘤實質(zhì)和間質(zhì)分界不清；環(huán)磷酰胺及BMP-7組腫瘤細胞排列疏松，有纖維組織包裹，瘤細胞大小不一，核質(zhì)比例減小，核呈圓形淡染，核仁小而不明顯，瘤內(nèi)出現(xiàn)片狀壞死，腫瘤細胞周圍可見淋巴細胞和巨噬細胞浸潤（圖1）。

2.3 BMP-7對腫瘤組織內(nèi)PCNA表達的影響

PCNA蛋白表達定位于腫瘤細胞核內(nèi)，呈棕黃色顆粒狀。各組腫瘤組織均有陽性表達，其中生理鹽水組PCNA表達最高，其次是環(huán)磷酰胺組，BMP-7組表達最低。環(huán)磷酰胺及BMP-7組PCNA的表達低于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.4 半定量RT-PCR檢測腫瘤組織內(nèi)E-cadherin的表達水平

分別抽提各組腫瘤組織的總RNA，半定量RT-PCR檢測E-cadherin的表達水平。結(jié)果使用Image J軟件進行半定量分析，E-cadherin與β-actin的灰度值進行對比，得到E-cadherin電泳條帶的相對灰度值。

從圖2可以看出環(huán)磷酰胺組E-cadherin的表達最高，其次是BMP-7組，生理鹽水組最低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.63，P<0.05），其中環(huán)磷酰胺組E-cadherin的表達與生理鹽水組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

肝癌的治療首選手術(shù)治療，也可采用放射介入治療，但是對于沒有條件進行手術(shù)或者介入的患者沒有確切有效的全身化療方案。環(huán)磷酰胺雖然在體內(nèi)實驗中有明顯的抑瘤作用，但在實際的臨床應(yīng)用中環(huán)磷酰胺對肝細胞癌的治療效果基本上是否定的，且能產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)，一般不用于肝細胞癌的治療，因此在該研究中環(huán)磷酰胺僅僅作為抗腫瘤藥物的陽性對照。

BMP-7的基因工程產(chǎn)品早在2004年被FDA批準應(yīng)用于臨床脊柱融合手術(shù)，這說明rhBMP-7已進入臨床應(yīng)用階段。已經(jīng)有研究證實BMP-7能夠通過拮抗TGF-β信號通路，發(fā)揮抗腫瘤作用[1-3]。同時，研究證實BMP-7可通過拮抗TGF-β信號通路抗肝纖維化[4-5]，而肝纖維化是由慢性肝炎發(fā)展至肝硬化、肝細胞癌的中間過程。有研究指出肝纖維化促進了致癌作用是由于成纖維細胞分泌gremlin阻斷了BMP的功能，從而促進干細胞活化和增殖，導(dǎo)致肝細胞癌進展[6]。若能證實BMP-7拮抗肝細胞癌的作用，有廣泛臨床應(yīng)用前景。

PCNA作為一項評估細胞增殖狀態(tài)的指標，與惡性腫瘤的增長活性、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有密切關(guān)系。檢測惡性腫瘤組織PCNA表達對判斷腫瘤的惡性程度、預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移趨勢、指導(dǎo)臨床的治療方案，以及改善患者預(yù)后均有重要意義。Lai JP等[7]研究顯示在134例肝細胞癌中103例（77%）PCNA免疫組化染色為彌漫性強陽性，但是33例肝細胞腺瘤中僅2例（6%）陽性，而40例灶性結(jié)節(jié)性增生和77例大再生結(jié)節(jié)中，沒有1例有此表現(xiàn)，提示PCNA可作為鑒別肝細胞癌與良性肝結(jié)節(jié)性病變的現(xiàn)有標志物的補充。還有研究[8]發(fā)現(xiàn)非編碼反義RNA PCNA-AS1通過形成RNA雜交增加PCNA RNA穩(wěn)定性，從而調(diào)節(jié)PCNA，進而促進肝細胞癌的腫瘤生長。該研究中BMP-7組H22荷瘤小鼠腫瘤組織中PCNA的表達明顯低于生理鹽水組，并低于環(huán)磷酰胺組，且實驗過程中BMP-7組小鼠病情相對于生理鹽水組較輕，提示BMP-7可下調(diào)PCNA表達，并有抑制H22荷瘤小鼠移植瘤組織增長的趨勢。

臨床觀察發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)惡性腫瘤患者均死于腫瘤轉(zhuǎn)移，而上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）被認為是上皮來源的惡性腫瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的重要原因，其主要特征有細胞黏附分子，如E-cadherin表達的減少，同時上調(diào)肌成纖維細胞標志物如波形蛋白、-SMA、纖連蛋白等。例如，宮頸癌患者[9]的腫瘤一旦轉(zhuǎn)移至身體其他部位，預(yù)后明顯變差，研究顯示癌基因AEG1、Sam-68、FTS及miR-361-5p誘導(dǎo)宮頸癌的EMT，而腫瘤抑制因子LMX-1、SFRP1、klotho及 miR-155抑制宮頸癌的EMT，從而影響患者預(yù)后。EMT對卵巢癌[10]的腹膜轉(zhuǎn)移以及無進展生存期和總生存期有至關(guān)重要的影響。在膀胱癌，Shh信號可通過激活EMT促進腫瘤發(fā)生。另外，EMT在乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等多種癌癥的原發(fā)性浸潤與繼發(fā)性轉(zhuǎn)移中也起著非常重要的作用。

Duangkumpha K研究指出，BMP-7可以通過拮抗TGF-β誘導(dǎo)的EMT過程，抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移[1]。另有研究顯示，在膽管癌細胞中，BMP-7可以抑制N-cadherin的表達，上調(diào)E-cadherin表達，抑制EMT過程，從而抑制膽管細胞癌的轉(zhuǎn)移[5]。Dorail T等[2]人發(fā)現(xiàn)姜黃素通過上調(diào)BMP-7的表達可以抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移。該研究結(jié)果顯示給予BMP-7后細胞黏附分子E-cadherin的表達略高于生理鹽水組，雖然差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是提示BMP-7有上調(diào)E-cadherin的表達，進一步提示BMP-7可能逆轉(zhuǎn)H22肝癌細胞的EMT過程，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

該研究者先前研究[11]指出BMP-7在癌周組織中呈彌漫性或灶性表達，但在癌結(jié)節(jié)中表達甚少，這提示BMP-7表達減少可能是肝細胞發(fā)生癌變的重要因素之一。另外，體外研究[12]顯示rhBMP-7可能通過磷酸化的Smad1/5/8信號通路明顯減弱肝癌細胞株Huh7的遷移能力。結(jié)合該研究結(jié)果，進一步探討B(tài)MP-7在肝細胞癌中的作用及其機制，可能尋找到肝細胞癌預(yù)防和治療的新靶點。

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（收稿日期：2015-06-10）