新生豬骨髓間充質(zhì)干細胞衍生細胞的分離、培養(yǎng)及生物學特性分析

阮征王蓮芳胡修忠吳建英張四化代長云華娟夏瑜胡小明李杰黃海軍，4

（1.武漢市畜牧獸醫(yī)科學研究所，武漢 430208；2. 武漢市重大動物疫病防控中心，武漢 430023；3.華中農(nóng)業(yè)大學豬遺傳育種農(nóng)業(yè)部重點實驗室&農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；4.武漢市畜牧獸醫(yī)局，武漢 430023）

新生豬骨髓間充質(zhì)干細胞衍生細胞的分離、培養(yǎng)及生物學特性分析

阮征1，2王蓮芳1胡修忠1吳建英2張四化2代長云2華娟1夏瑜1胡小明3李杰1黃海軍1，4

（1.武漢市畜牧獸醫(yī)科學研究所，武漢 430208；2. 武漢市重大動物疫病防控中心，武漢 430023；3.華中農(nóng)業(yè)大學豬遺傳育種農(nóng)業(yè)部重點實驗室&農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；4.武漢市畜牧獸醫(yī)局，武漢 430023）

利用骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）治療疾病已經(jīng)逐漸成為現(xiàn)實，但是作為被移植的種子細胞，BMSCs體外傳代能力非常有限，種子細胞來源極為貧乏。本研究通過差速貼壁篩選的方法分離出一種豬BMSCs的衍生細胞株，命名為豬骨髓間充質(zhì)干細胞衍生細胞（Bone mesenchymal stem-derived cells，BMSDCs）。分別對BMSDCs與BMSCs細胞進行細胞生物學特性分析，探討其體外誘導分化特性，并應(yīng)用流式細胞術(shù)測定細胞表面標記物。結(jié)果表明，BMSC和BMSDCs細胞倍增時間分別為31.3 h和30.3 h，平均傳代時間分別為3-5 d和 2-3 d；兩種細胞均陽性表達 CD34、CD90，陰性表達CD44、CD45；經(jīng)體外誘導后均可分化為成脂細胞和成肌細胞。在傳代能力上，前者可傳代15至20次，后者可長期傳代（200次以上）且維持正常染色體特征。研究認為在適宜的實驗條件下，體外培養(yǎng)的豬骨髓間充質(zhì)干細胞的衍生細胞——BMSDCs能夠穩(wěn)定生存增殖并維持BMSCs多向分化潛能，可作為組織工程的理想種子細胞。

骨髓間充質(zhì)干細胞；衍生細胞；豬；生物學特性；組織工程

骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種存在于骨髓網(wǎng)狀間質(zhì)內(nèi)的非造血干細胞，具有分化成各種間葉組織的功能。近年來研究表明，豬BMSCs體外分離培養(yǎng)后，在一定的誘導條件下具有向成骨細胞、軟骨細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞、心肌細胞等定向分化的能力［1-3］，且取材方便，免疫耐受性、遺傳背景穩(wěn)定及易于轉(zhuǎn)染外源基因等。因此，豬BMSCs成為目前倍受關(guān)注的細胞及組織工程的干細胞材料［4-6］。將豬BMSCs誘導成上述目的細胞后，用于臨床骨損傷、肌肉損傷和基因治療以及在防治肥胖癥領(lǐng)域是一個非常有臨床應(yīng)用前景的研究課題。體外成功分離豬BMSCs及誘導成功是其應(yīng)用的前提。但是，文獻［1-3］表明，豬BMSCs在實驗室條件下培養(yǎng)傳代次數(shù)非常有限，不利于其廣泛應(yīng)用于臨床治療疾病。本研究分離了豬BMSCs并進行了體外向成骨細胞、成脂細胞及成肌細胞的定向分化研究。此外，利用差速貼壁法從第3代豬BMSCs衍生細胞群中分離出一種亞型細胞，并建立了可穩(wěn)定傳代的細胞系，經(jīng)細胞生物學分析證實其仍然具備標準BMSCs干細胞特性，可為后續(xù)研究及細胞移植治療提供充足的細胞材料。

1 材料及方法

1.1 材料

低糖 DMEM 培養(yǎng)基（GIBICO 公司）、10% 胎牛血清（GIBICO 公司）、0.125% 胰蛋白酶（Sigma 公司）、Ficoll 淋巴細胞分離液（上海士鋒生物科技有限公司，比重 1.077 g/mL）、CD29、CD34、CD44、CD105 單克隆抗體和 FITC 標記的二抗（Lab vision）、MTT（上海譜振生物科技有限公司）、熒光倒置相差顯微鏡（OLYMPUS）、細胞培養(yǎng)箱（SanYo公司）、流式細胞儀（FACSCalibur，BECTON DICKINSON 公司，美國）及超凈工作臺等、PCR儀（ABI公司）。

普通級新生長白仔豬（10頭，體質(zhì)量1.5 kg-5 kg）由武漢市畜牧獸醫(yī)科學研究所試驗豬場提供。

1.2 方法

1.2.1 豬BMSCs 的分離純化與傳代培養(yǎng) 將豬體表清洗干凈并用酒精棉充分消毒，放血致死，置于75%酒精中浸泡10 min，分離四肢皮膚及肌肉組織。無菌條件下取出股骨和脛骨，切除兩側(cè)干骺端，用滅菌鋼鋸將其鋸成兩段，再用鋼鉗鉗破骨腔，擠壓鋼鉗使骨髓液流出，收集骨髓液于無菌離心管。吸取骨髓液緩慢滴加于等量 Ficoll 淋巴細胞分離液（密度 1.077 g/mL）上，以 1 000 g 的速度離心 20 min，分離骨髓單個核細胞，收集界面上的細胞，移入另一離心管，PBS 洗滌，2 000 r/min 離心 5 min，反復2 次，棄上清，懸浮于含 15% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基（青霉素 100 U/mL，鏈霉素 100 U/mL），輕輕吹打均勻，接種到 25 cm2培養(yǎng)瓶，置 37℃，5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4-6 d 首次換液，以后每3 d 或 4 d 換液 1 次，14-21 d 細胞生長融合達 80%以上，以 0.25% 胰蛋白酶消化，按 1∶3 比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 BMSCs衍生細胞的分離與培養(yǎng) BMSCs生長融合達 80% 以上，以 0.25% 胰蛋白酶消化細胞，利用差速貼壁法從中分離出一種短梭形的亞型細胞，命名為豬骨髓間充質(zhì)干細胞衍生細胞（Bone mesenchymal stem-derived cells，BMSDCs）。

1.2.3 BMSCs和BMSDCs細胞倍增時間的確定 取第3代生長良好的細胞，用 0.25% 胰蛋白酶消化后用含 10% FBS 的 DMEM培養(yǎng)基制備細胞懸液，以每孔 103-104個細胞于不同時相分別接種于 8 塊 96 孔板中的 8 孔，每孔體積 200 μL，置于 37℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。于第 2 天起行 MTT 比色法，每孔加入 MTT 溶液（5 mg/mL）20 μL，37℃ 繼續(xù)孵育 4 h 后，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，振蕩 10 min 后選擇 490 nm 波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，以時間為橫軸，光吸收值 A（OD）為縱軸繪制細胞生長曲線。根據(jù)計算公式：DT = t ×［lg2/（lgNtlgN0）］確定BMSCs和BMSDCs細胞的倍增時間。

1.2.4 BMSCs和BMSDCs細胞的鑒定

1.2.4.1 化學染色 堿性磷酸酶（ALP）染色：細胞接種于蓋玻片上培養(yǎng)，待長滿后，細胞爬片用體積分數(shù)4%多聚甲醛固定細胞，進行ALP染色，即先用PBS洗細胞3遍，加入ALP染液，室溫孵育20-30 min，鏡下觀察，檢測成骨細胞，陽性細胞呈紫紅色，每張載玻片隨機選擇3個視野計數(shù)500個細胞，計算陽性率。

PAS染色：細胞接種于蓋玻片上培養(yǎng)，待長滿后，細胞爬片用0.5%高碘酸水溶液氧化10 min。流水沖洗數(shù)分鐘蒸餾水換洗兩次。雪夫試劑暗處浸染15-30 min。流水沖洗10 min。蘇木素復染核1-2 min。95%乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

瑞氏-姬姆薩染色：吸取瑞氏-姬姆薩染液滴至玻片蓋滿標本，靜置30 s，再加入PBS 2-3倍體積，染色1-3 min，傾去染液，水洗，封片。

1.2.4.2 PCR鑒定 選擇生長狀態(tài)良好的豬BMSCs和BMSDCs細胞，參考文獻［7］的方法，分別提取細胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA進行PCR檢測。PCR反應(yīng)體系為50 μL體系，其中包括ddH2O 10 μL，dNTPs 8 μL（濃度為10 mmol/L），2×Buffer 25 μL，cDNA模板4 μL，上下游引物分別添加1 μL KOD DNA聚合酶1 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預變性2 min；98℃變性10 s，退火30 s，68℃延伸1 kb/30 s，35個循環(huán)。PCR反應(yīng)的引物和條件見表1。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR 擴增產(chǎn)物，加0.5 μL上樣緩沖液（10×Loading Buffer），混勻后小心點樣于0.7%的瓊脂糖凝膠膠孔中，同時點5 μL DL1k Marker作為參照，在150 V電壓條件下，電泳40 min。電泳結(jié)束后，在加有EB的緩沖液中染色15 min，取出用干凈的水洗去表面的EB，然后利用G-BOX凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

表1 PCR引物

1.2.4.3 細胞免疫化學 于超凈工作臺內(nèi)，打開6孔板，放置滅菌蓋玻片。將細胞懸液滴加至蓋玻片上，置于CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)至細胞固著（約2 h）。加入2 mL細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)約6 h。倒去培養(yǎng)基，用PBS洗3次，每次5 min。4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，每次5 min。爬片稍甩干后用組化筆在蓋玻片中間細胞分布均勻的位置畫圈（防止抗體流走），加50-100 μL破膜工作液，室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min。去除PBS，用PBS按一定比例稀釋好的一抗（CD34，rabbit，1∶50；CD44，mouse，1∶100；CD90， mouse，1∶100）覆蓋組織。爬片平放于冰箱內(nèi)4℃孵育過夜。爬片用PBS（pH7.4）洗滌3次，每次5 min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的熒光二抗（cy3標記山羊抗兔1∶100；cy3標記山羊抗小鼠1∶100）覆蓋組織，避光室溫孵育50 min。PBS（pH7.4）洗滌3次，每次5 min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。用PBS（pH 7.4）洗滌3次，每次5 min。爬片稍甩干后將有細胞的一面朝下用抗熒光淬滅封片劑將玻片封固在載玻片上封片。切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.4.4 流式細胞術(shù)測定細胞表面標記 取第3代BMSCs，用 0.25% 胰蛋白酶消化，2 000 r/min 離心5 min，PBS 洗滌 2 次，調(diào)節(jié)細胞濃度為 1×106/mL，分為 4 份，分別滴加人抗兔 CD34、CD44、CD45、CD90的一抗（以 PBS 代替一抗作為陰性對照），室溫反應(yīng) 30 min 后，PBS 洗滌 2 次，滴加CY3標記的抗兔 IgG，避光反應(yīng) 15 min 后，經(jīng)流式細胞儀檢測細胞表面 CD34、CD44、CD90 陽性細胞的表達。1.2.4.5 體外誘導分化 選擇生長狀態(tài)良好的豬BMSCs和BMSDCs細胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化3 min，制成單細胞懸液，以1×10 mL 密度接種于5個培養(yǎng)皿中，每皿預置3張載玻片，待細胞長至50%匯合時進行細胞誘導。成肌誘導：10%FBS+10 μmol/L 5-氮胞苷誘導21 d。成脂誘導：10%FBS+1 μmol/L 地塞米松+0.5 mmol/L IBMX+10 μg/mL胰島素+200 μmol/L吲哚美辛（2 d），10%FBS+1 μmol/L 地塞米松+0.5 mmol/L IBMX+10 μg/mL胰島素（2 d），10%FBS+10 μg/mL胰島素（2 d），10%FBS培養(yǎng)基。肉眼可見明顯脂滴，用油紅O進行染色［7］。

2 結(jié)果

2.1 豬原代BMSCs的形態(tài)及培養(yǎng)特征

原代培養(yǎng)中，可見細胞以分散、克隆集落方式增殖（圖1-A1）；第 1-3 天細胞大部分呈圓形、橢圓形生長；第 3-7 天貼壁細胞增多，并逐漸延展生長為多角形、星形或梭形；7-21 d 貼壁細胞明顯增多，并有集落形成，相鄰集落融合成片達 80% 以上，細胞排列呈漩渦狀，細胞間界限不清，細胞呈長梭形；14-21 d 后，原代細胞生長匯合。

2.2 豬BMSCs的傳代培養(yǎng)及細胞生物學特性

傳代后豬BMSCs 2-4 h迅速貼壁，8 h大部分貼壁，10 h細胞全部貼壁，并開始分裂增殖。細胞呈均勻分布，形態(tài)呈細長梭形，并沿一定方向排列（圖1-A2）。細胞倍增時間為31.3 h，2-5 d細胞鋪滿瓶底，即可消化傳代。開始時大多為細長梭形，增殖速度快，細胞傳代周期縮短，待傳至第7-8代時，細胞鋪展得寬大而扁薄，增殖速度減慢，細胞傳代周期延長，細胞內(nèi)顆粒物質(zhì)增多。

PCR檢 測 表 明，BMSCs表 達Sox2、Nanog、CD90和CD29基因，Pou5f基因表達較弱，不表達Lin28（圖1-D）。細胞ALP、PAS和Gimsa染色陽性（圖1-B）。細胞免疫熒光化學分析，BMSC細胞表達CD44和CD90，不表達CD34、CD45（圖1-C）。流式檢測，CD44和CD90的表達比例分別達到89.77%和89.53%，CD34、CD45的表達分別為0.9%和1.3%（圖1-E）。體外適當誘導可分化為成肌細胞和脂滴（圖1-F）。

2.3 豬BMSDCs細胞系的建立及細胞生物學特性

在我們分離的豬BMSCs的培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)了兩種主要形態(tài)的細胞（圖2-A1）。利用差速貼壁法我們純化了短梭狀生長的細胞，命名為豬BMSDCs細胞（圖2-A2）。細胞倍增時間為30.3 h，2-3 d細胞鋪滿瓶底，即可消化傳代。

PCR檢測結(jié)果表明，BMSDCs細胞表達Sox2、Pou5f、CD90和CD29基因，Nanog基因表達較弱，不表達Lin28（圖2-D）。細胞ALP、PAS和Gimsa染色陽性（圖2-C）。細胞免疫熒光化學分析，BMSDCs細胞表達CD44和CD90，不表達CD34、CD45（圖2-B）。流式檢測，CD44和CD90的表達比例分別達到88.92%和81.47%，CD34、CD45的表達分別為1.9%和1.1%（圖2-E）。體外適當誘導可分化為成肌細胞和脂滴（圖2-F）。

3 討論

BMSCs 體外培養(yǎng)的生長特點和生物學特性已有較多相關(guān)文獻 報道。BMSCs 在骨髓中的含量極少，約占有核細胞的 0.001%-0.01%［8］，如何獲得高純度、足量的 BMSCs，成為 BMSCs 應(yīng)用研究的關(guān)鍵。目前常用于BMSCs 分離方法有貼壁篩選法［9］、密度梯度離心法［10，11］、免疫磁珠法［12］、流式細胞儀分離法［13］及 Hung等［14］研究的特制微孔培養(yǎng)板篩選法。特制微孔培養(yǎng)板篩選法，可以快速有效獲取相對同質(zhì)的BMSCs，利用這種方法可以不用考慮去除紅細胞，但是結(jié)果不穩(wěn)定，目的細胞不易大量獲?。?5］。免疫磁珠分離和流式細胞術(shù)篩選的方法，優(yōu)點是可以獲得純度較高的細胞，但對細胞活性影響較大，而且操作復雜，成本較高，獲得的細胞數(shù)目又非常少［16］。密度梯度離心法主要是根據(jù)骨髓中各細胞成分比重的不同，利用淋巴細胞分離液提取單核細胞，操作上較貼壁篩選法煩瑣，得到的細胞數(shù)也比后者少，但此方法可排除大量紅細胞對BMSCs貼壁的影響，因而被廣泛采用［17］。在本研究中，我們也采用過全骨髓法成功分離出目的細胞。全骨髓法操作簡便，將獲得的骨髓直接培養(yǎng)，骨髓中的造血干細胞能分泌生長因子和促貼壁物質(zhì)，可促進BMSCs貼壁生長，同時根據(jù)BMSCs的貼壁生長特性，通過更換培養(yǎng)液逐步去除漂浮生長的造血干細胞，獲得純度較高的BMSCs。

圖1 豬BMSCs細胞生物學特性

BMSCs 在生物醫(yī)學領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，然而 BMSCs 表面標志物由于細胞分離、培養(yǎng)方法和培養(yǎng)時間等的不同而有差異。Pittenger 等［18］認為人BMSCs 陽性表面標志物是 SH2（CD105）、SH3、SH4、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD124，陰性表面標志物是 CD45、CD34 和 CD14等造血細胞標志。Hung 等［14］采用帶孔培養(yǎng)板的裝置培養(yǎng)分離得到人BMSCs，培養(yǎng)至第 2 代時陽性表面標志是 CD90、CD44、CD29、CD51，陰性表面標志是 CD45、CD34、CD7、AC133 等。研究者們應(yīng)用不同的分離擴增方法及不同的方式表達細胞特性，使得對一些研究結(jié)果的比較變得困難，阻礙了其在這些領(lǐng)域的應(yīng)用［19］。因此在 2005 年，ISCT（the International Society for Cellular Therapy）定義了BMSCs 的最低標準：首先，BMSCs 在標準培養(yǎng)條件下必須具備貼壁生長的特點；其次，BMSCs 表達CD105、CD73 和 CD90，而 CD45、CD34、CD14 或CD11b、CD79a、或 CD19 及 HLA-DR 表面分子表達陰性；第三，BMSCs 在體外能分化為成肌細胞或脂肪、成骨等多種細胞［20］。本研究結(jié)果表明，獲得的BMSCs和BMSDCs細胞均符合骨髓間充質(zhì)干細胞的特點。

圖2 豬BMSDCs細胞生物學特性

實驗中還發(fā)現(xiàn)，獲取的BMSCs開始貼壁生長時，呈短梭形或多角形，具有長短不等的數(shù)個細胞突起；在細胞密集區(qū)表現(xiàn)為渦旋狀，隨著培養(yǎng)時間的延長，相互重疊成多層。但是BMSCs的傳代次數(shù)非常有限，最高傳代至18代。值得高興的是，我們最終獲得了由BMSCs衍生而來的亞型細胞，其生長形態(tài)類似于成纖維細胞，也具備標準BMSCs的特性，而且可以長期傳代培養(yǎng)，生物學性狀穩(wěn)定（至發(fā)稿前該細胞已經(jīng)傳代超過200次），為后期基因工程細胞移植在動物疫病防控領(lǐng)域的應(yīng)用提供了試驗材料。關(guān)于本研究獲得的BMSCs和BMSDCs兩者之間的細胞生物學特性存在差異，可以理解為衍生細胞BMSDCs是BMSCs向成體細胞分化的中間型分化產(chǎn)物，但是BMSCs細胞具體的分化機制還有待于進一步研究。

4 結(jié)論

本研究從第3代豬BMSCs衍生分化的細胞群中分離出一種亞型細胞，并建立了可長期穩(wěn)定傳代的細胞系，經(jīng)細胞生物學分析證實其仍然具備標準BMSCs細胞特性，可為后續(xù)研究BMSCs細胞分化機制及細胞移植治療提供充足的細胞材料。

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（責任編輯 李楠）

Isolation，Culture and Characterization of Derived Cells from Neonatal Porcine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

Ruan Zheng1，2Wang Lianfang1Hu Xiuzhong1Wu Jianying2Zhang Sihua2Dai Changyun2Hua Juan1Xia Yu1Hu Xiaoming3Li Jie1Huang Haijun1，4
（1. Wuhan Institute of Animal and Veterinary Science，Wuhan 430208；2. Wuhan Animal Disease Prevention and Control Center，Wuhan 430023；3. Key Laboratory of Swine Breeding and Genetics of Ministry of Agriculture & Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics，Breeding and Reproduction of Ministry of Education，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070；4. Wuhan Bureau of Animal Husbandry and Veterinary，Wuhan 430023）

Recently it has become possible to use bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）in the clinical treatment of certain diseases. However， BMSCs， the seed cells used in transplantation， are limited in vitro proliferation capability and can only be obtained from very few sources. In order to acquire a substitute for BMSCs， the method of differential velocity adherent screening was used in this study to isolate a derived strain of porcine BMSCs， named bone marrow mesenchymal stem-derived cells（BMSDCs）. The biological characteristics of BMSDCs and BMSCs cells were compared by continuous morphological imaging by inverted microscope， and the growth curves of both cells were monitored by the MTT method. Furthermore， their characteristics of differentiation in vitro were examined， and flow cytometry was used to measure cell surface markers. Our results suggest that the doubling times of BMSCs and BMSDCs are 31. 3 h and 30. 3 h， respectively， and the average passaging time is 3-5 d and 2-3 d， respectively. Cultured BMSCs and BMSDCs are both positive for CD34 and CD90 and negative forCD44 and CD45. Both BMSCs and BMSDCs can differentiate into adipocytes and myoblasts by induced differentiation in vitro. Concerning their passaging abilities， the former can have 15 to 20 passages in vitro， whereas latter can have a longer period of time（more than 200 passages）while normal karyotypes are still maintained. We conclude that， under certain experimental circumstances， cultured porcine BMSDCs in vitro can survive and proliferate while maintaining multi-directional differentiation potential of BMSCs， and potentially it can be an ideal type of seed cell for tissue engineering.

bone marrow mesenchymal stem cell；derived cell；porcine；biological characteristics；tissue engineering

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.027

2014-09-19

國家自然科學基金項目（31201938），武漢市晨光計劃（201150431078），武漢市農(nóng)科院英才計劃（YC201101）

阮征，男，高級獸醫(yī)師，研究方向：動物疫病防控；E-mail：paper2006@sina.cn并列第一作者：王蓮芳，女，畜牧師，研究方向：動物科學技術(shù)與推廣；E-mail：hygene@qq.com

黃海軍，男，博士，副研究員，研究方向：動物生物技術(shù)與疫病防控；E-mail：hhj@stemcell8.com