低聚半乳糖對腸道益生菌產(chǎn)胞外多糖作用的研究

辛躍強(qiáng) 梁榮榮 王瑞明

（齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點實驗室，濟(jì)南 250353）

低聚半乳糖對腸道益生菌產(chǎn)胞外多糖作用的研究

辛躍強(qiáng) 梁榮榮 王瑞明

（齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點實驗室，濟(jì)南 250353）

旨在研究低聚半乳糖對腸道益生菌產(chǎn)胞外多糖的作用。以低聚半乳糖、葡萄糖、半乳糖和乳糖4種碳源作比較，分別從碳源的利用、胞外多糖的產(chǎn)量和種類及其對有害菌的黏附作用進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，低聚半乳糖不僅能促進(jìn)長雙歧桿菌和植物乳桿菌的增殖，而且有利于胞外多糖的產(chǎn)生，其含量分別為208.78 μg/mL和192.78 μg/mL，產(chǎn)生的胞外多糖種類較其他3種碳源更多，對腸道有害菌大腸桿菌具有明顯黏附作用。結(jié)果證明，與其他3種碳源相比，低聚半乳糖能促進(jìn)植物乳桿菌和兩歧雙歧桿菌生成更多的胞外多糖。

低聚半乳糖；胞外多糖；益生菌

低聚半乳糖（Galactooligosaccharide，GOS）作為功能性低聚糖的一種，因其獨(dú)特的生理功能受到大眾的青睞。低聚半乳糖是在乳糖分子的半乳糖基側(cè)以β-1，4糖苷鍵的形式連接了1-4個半乳糖分子形成的混合雜聚糖［1］。腸道益生菌在利用低聚半乳糖進(jìn)行大量增殖的同時，產(chǎn)生對人體大有益處的胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）。腸道益生菌產(chǎn)的胞外多糖分為兩種，一種是形成莢膜多糖，黏附于細(xì)胞表面；另一種是形成黏液多糖，分泌于細(xì)胞外［2］。胞外多糖的分泌，不僅發(fā)揮了自身的生物活性如免疫、抗?jié)兒涂鼓[瘤活性；而且促進(jìn)了腸道益生菌在人體腸道的長久定植。

低聚半乳糖作為益生元被人體攝入后，在發(fā)揮降低齲齒、不被消化、改善人體礦物質(zhì)吸收等生理功能的同時［3］，又促進(jìn)了腸道益生菌產(chǎn)生新的益生元——胞外多糖。兩種益生元的結(jié)合，既改善了腸道內(nèi)環(huán)境，又促進(jìn)了腸道的健康，從而達(dá)到兩全其美的功效。本文著重研究了以長雙歧桿菌和植物乳桿菌為代表的益生菌，在低聚半乳糖的作用下產(chǎn)益生菌胞外多糖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及試驗藥品 腸道益生菌：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）和長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）均由本實驗室保存。低聚半乳糖由保齡寶生物股份有限公司提供（純度≥95%），4℃冰箱保存。

1.1.2 儀器與設(shè)備 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司LDZX-SOKB型），超凈工作臺（上海博訊科技有限公司SW-CJ-2FD型），精密pH計（上海佐科有限公司PSH-3C型），厭氧培養(yǎng)箱（美國Thermo公司Forma1029型），高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司5804R型），分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司UV-7200型），恒溫數(shù)控超聲波清洗器（上海超聲儀器有限公司JQ-A10000OE型），高效液相色譜儀（日本島津LC-20A型，色譜柱：Inertsil NH2（250 mm×4.6 mm）。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑 種子培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基：改良MRS培養(yǎng)基，將碳源由2%葡萄糖分別替換為2%半乳糖、2%乳糖和2%低聚半乳糖；培養(yǎng)基皆121℃滅菌20 min；色譜乙腈（天津科密歐），雙蒸水（上海生工），純凈水（杭州娃哈哈），三氯乙酸、PEG-4000（Sigma），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 生長曲線的測定 取甘油管保藏的長雙歧桿菌和植物乳桿菌接種到種子培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)18 h。后按10%的比例轉(zhuǎn)接到碳源分別為2%葡萄糖、2%半乳糖、2%乳糖、2%低聚半乳糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，每種碳源設(shè)3個平行，置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，此時記為0 h，此后每隔2 h取樣用分光光度計測定600 nm吸光度值變化并繪制生長曲線，比較不同碳源對腸道益生菌生長影響的差異性。

1.2.2 胞外多糖的測定 采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線［4-6］。

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8 mL，各以蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，搖勻冷卻，室溫放置30 min后，于490 nm測定吸光值。以2.0 mL蒸餾水按同樣顯色操作為空白，橫坐標(biāo)為葡萄糖毫克數(shù)，縱坐標(biāo)為吸光值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 胞外多糖的提?。?，8］取10 mL培養(yǎng)液，沸水浴10 min，冷卻至室溫，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的三氯乙酸至終濃度為4%，4℃靜置過夜，以除去蛋白；10 000 r/min，4℃冷凍離心10 min，收集上清液于透析袋中，雙蒸水透析6次，收集透析袋內(nèi)液體，雙蒸水定容至10 mL。移取0.2 mL的樣品液，以蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，采用上述苯酚-硫酸法進(jìn)行胞外多糖的測定。以葡萄糖（mg/L）標(biāo)準(zhǔn)曲線計算益生菌胞外多糖含量。

1.2.4 胞外多糖生產(chǎn)曲線的測定 按照1.2.1的方法，每隔3 h取樣放置于4℃冰箱中，以備測定胞外多糖含量。

1.2.5 培養(yǎng)基中糖類物質(zhì)的液相色譜檢測 以碳源分別為2%葡萄糖、2%半乳糖、2%乳糖和2%低聚半乳糖配置的，pH6.0的改良MRS液體培養(yǎng)基，8 000 r/min離心10 min，取上清液500 μL，過0.22 μm濾膜，液相色譜檢測初始培養(yǎng)基中碳源。將活化后的植物乳桿菌和長雙歧桿菌培養(yǎng)液以10%的接種量接種到上述改良后的含有4種不同碳源的MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)36 h。取發(fā)酵液，8 000 r/min離心10 min除去菌體，收集上清液500 μL，過0.22 μm濾膜，液相色譜檢測發(fā)酵36 h后上清液中碳源。高效液相色譜法檢測條件［9，10］：檢測器：示差折光檢測器，色譜柱：氨基柱，流動相：乙腈∶水=3∶1（V/V），流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：35℃，檢測時間：40 min。

1.2.6 腸道益生菌胞外多糖對大腸桿菌的黏附 環(huán)境掃描電子顯微鏡（ESEM）是目前在自然狀態(tài)下觀察生物醫(yī)學(xué)樣品和生物大分子的必要研究工具［16］。取活化的長雙歧桿菌和植物乳桿菌培養(yǎng)液以10%的接種量接種到碳源為2%低聚半乳糖的改良MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)36 h。取甘油管保藏的大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)8 h，取活化后的大腸桿菌培養(yǎng)液以10%的接種量接種到LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)10 h［11-13］。用生理鹽水調(diào)整腸道益生菌和大腸桿菌的菌體濃度分別為107CFU/mL，取大腸桿菌菌液分別與長雙歧桿菌、植物乳桿菌等體積混合，模擬腸道環(huán)境。通常胃液的pH在3.0左右，腸膽汁的濃度一般為2.0%，以鹽酸和牛膽酸鈉模擬胃腸道環(huán)境［14］，于37℃，厭氧靜置共培養(yǎng)6 h。取共培養(yǎng)的菌液離心收集菌體，以2.0%戊二醛于4℃條件下固定18 h后涂片，自然風(fēng)干后得到樣品。環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察黏附情況。

2 結(jié)果

2.1 碳源對腸道益生菌生長曲線的影響

以不同碳源制成的改良MRS培養(yǎng)基中的長雙歧桿菌和植物乳桿菌在不同時間點的OD600值的變化如圖2所示。圖2-A結(jié)果表明，長雙歧桿菌以10%的接種量接種后，碳源不同影響了長雙歧桿菌的生長。利用4種不同碳源生長的長雙歧桿菌，在0-5 h為延滯期，在約5-12.5 h為指數(shù)生長期，以葡萄糖為碳源在約28 h進(jìn)入穩(wěn)定期，以半乳糖為碳源在約30 h進(jìn)入穩(wěn)定期，以乳糖為碳源在約28 h進(jìn)入穩(wěn)定期，以低聚半乳糖為碳源在約30 h進(jìn)入穩(wěn)定期。菌株在穩(wěn)定期維持的時間約為3 h。菌株對低聚半乳糖利用OD600最高可達(dá)13，利用乳糖OD600最高可達(dá)10.5，利用葡萄糖和半乳糖能力相當(dāng)，OD600最高可達(dá)9.8。圖2-B結(jié)果表明，植物乳桿菌以10%的接種量接種后，碳源的不同影響了植物乳桿菌的生長。以4種碳源生長的植物乳桿菌，在0-5 h為延滯期，在約5-12.5 h為指數(shù)生長期，以葡萄糖為碳源在約25 h進(jìn)入穩(wěn)定期，以半乳糖為碳源在約23 h進(jìn)入穩(wěn)定期，以乳糖為碳源在約28 h進(jìn)入穩(wěn)定期，以低聚半乳糖為碳源在約39 h進(jìn)入穩(wěn)定期。菌株對低聚半乳糖利用OD600最高可達(dá)11.5，利用乳糖OD600最高可達(dá)9.3，利用葡萄糖和半乳糖能力相當(dāng)，OD600最高可達(dá)8.5。

圖2 腸道益生菌的生長曲線

2.2 碳源對腸道益生菌產(chǎn)胞外多糖的影響

腸道益生菌長雙歧桿菌和植物乳桿菌利用不同碳源產(chǎn)胞外多糖含量的變化如圖3所示。圖3-A的結(jié)果表明，以10%的接種量轉(zhuǎn)接后，在0-9 h內(nèi)，長雙歧桿菌沒有產(chǎn)生胞外多糖；在10-30 h菌株產(chǎn)胞外多糖含量呈上升趨勢，30 h后產(chǎn)胞外多糖含量逐漸趨于穩(wěn)定。其中，利用低聚半乳糖的長雙歧桿菌產(chǎn)生的胞外多糖產(chǎn)量在36 h時達(dá)到最大，為208.78 μg/mL；利用乳糖產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量在34 h時達(dá)到最大，為182.68 μg/mL；利用葡萄糖產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量在30 h時達(dá)到最大，為127.07 μg/mL。而利用半乳糖產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量在31.8 h達(dá)到最大，為98.67 μg/mL。圖3-B的結(jié)果表明，以10%的接種量轉(zhuǎn)接后，在0-10 h內(nèi)，植物乳桿菌沒有產(chǎn)生胞外多糖；在10-32 h菌株產(chǎn)胞外多糖含量呈上升趨勢，32 h后產(chǎn)胞外多糖含量逐漸趨于穩(wěn)定。其中，利用低聚半乳糖的長雙歧桿菌產(chǎn)生的胞外多糖產(chǎn)量在36 h時達(dá)到最大，為192.78 μg/mL；利用乳糖產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量在33 h時達(dá)到最大，為160.34 μg/mL；利用葡萄糖產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量在30 h時達(dá)到最大，為114.07 μg/mL。而利用半乳糖產(chǎn)胞外多糖產(chǎn)量在34 h達(dá)到最大，為88.21 μg/mL。圖3-A和圖3-B比較，長雙歧桿菌比植物乳桿菌利用糖類產(chǎn)胞外多糖的能力更高。

圖3 胞外多糖產(chǎn)量曲線

2.3 培養(yǎng)前后培養(yǎng)基中糖類物質(zhì)的液相檢測

通過液相色譜檢測長雙歧桿菌發(fā)酵前后糖類的變化（圖4）表明，長雙歧桿菌能夠利用葡萄糖、半乳糖、乳糖和低聚半乳糖4種碳源，在發(fā)酵36 h后，初始的碳源完全被利用，生成了胞外多糖，且種類不同。利用低聚半乳糖（圖4-D）產(chǎn)的胞外多糖的種類和含量明顯較其他3種糖（圖4-A，4-B，4-C）多。液相色譜檢測植物乳桿菌發(fā)酵前后糖類的變化（圖5）表明，植物乳桿菌能夠利用葡萄糖、半乳糖、乳糖和低聚半乳糖4種碳源，且發(fā)酵36 h后，初始的碳源也被完全利用，生成了胞外多糖，且種類不同。利用低聚半乳糖（圖5-D）產(chǎn)胞外多糖的種類和含量明顯較其他3種糖（圖5-A，5-B，5-C）多。

2.4 腸道益生菌產(chǎn)胞外多糖對大腸桿菌黏附的影響

模擬腸道微環(huán)境，選取腸道中最常見的致病菌大腸桿菌為研究菌，與腸道中公認(rèn)的益生菌長雙歧桿菌和植物乳桿菌共培養(yǎng)，研究腸道益生菌分泌胞外多糖對致病菌的黏附作用如圖6、圖7所示?；旌吓囵B(yǎng)初期的植物乳桿菌與大腸桿菌（圖6-A）呈單個菌獨(dú)立生長狀態(tài)，兩種菌的形態(tài)飽滿，表面光滑。由于混合初期植物乳桿菌生成的胞外多糖含量較少，且與大腸桿菌共培養(yǎng)，使得胞外多糖被稀釋，因而兩種菌在混合培養(yǎng)初期呈單個獨(dú)立生長；由于營養(yǎng)物質(zhì)豐富且培養(yǎng)條件適宜，兩種菌體形態(tài)都飽滿且表面光滑。兩種菌混合培養(yǎng)6 h后（圖6-B），大腸桿菌明顯被植物乳桿菌牢牢地黏附在表面，植物乳桿菌仍舊形態(tài)飽滿，表面光滑，與混合培養(yǎng)初期形態(tài)無差異，而大腸桿菌表面出現(xiàn)褶皺，形態(tài)沒有混合培養(yǎng)初期飽滿。圖6-A與圖6-B比較結(jié)果表明，混合培養(yǎng)后植物乳桿菌分泌的胞外多糖含量增多，分泌到細(xì)胞外，使植物乳桿菌菌體表面牢牢黏附大腸桿菌，抑制了大腸桿菌的生長。

圖4 長雙歧桿菌發(fā)酵液糖類物質(zhì)液相色譜圖

圖5 植物乳桿菌發(fā)酵不同碳源液相色譜圖

混合培養(yǎng)初期的長雙歧桿菌與大腸桿菌（圖7-A）呈單個菌獨(dú)立生長狀態(tài)，且兩種菌的形態(tài)飽滿，表面光滑。由于混合初期長雙歧桿菌生成的胞外多糖含量較少，且與大腸桿菌共培養(yǎng)，使得胞外多糖被稀釋，因而兩種菌在混合培養(yǎng)初期呈單個獨(dú)立生長；由于營養(yǎng)物質(zhì)豐富且培養(yǎng)條件適宜，兩種菌體形態(tài)都飽滿且表面光滑。兩種菌混合培養(yǎng)6 h后（圖7-B），大腸桿菌明顯被長雙歧桿菌牢牢地黏附在表面，兩種仍舊形態(tài)飽滿，表面光滑，與混合培養(yǎng)初無差異。圖7-A與圖7-B相比較結(jié)果表明，混合培養(yǎng)后隨著培養(yǎng)時間的增長，長雙歧桿菌分泌的胞外多糖含量增多并分泌到細(xì)胞外，使長雙歧桿菌將大腸桿菌牢牢黏附在表面。

圖6 植物乳桿菌產(chǎn)胞外多糖對大腸桿菌黏附的影響

圖7 長雙歧桿菌產(chǎn)胞外多糖對大腸桿菌粘附的影響

3 討論

腸道益生菌（長雙歧桿菌和植物乳桿菌）能利用低聚半乳糖大量增殖，這與較多關(guān)于低聚半乳糖作用的報道一致［3，6，15］。長雙歧桿菌和植物乳桿菌的生長周期呈“S”型，并且利用4種不同碳源均呈相同的生長趨勢。這兩種益生菌利用低聚半乳糖的生長狀況最佳，菌體密度達(dá)到最高；其次是乳糖，再次是葡萄糖和半乳糖。在菌體培養(yǎng)產(chǎn)胞外多糖的過程中，長雙歧桿菌和植物乳桿菌起初利用碳源大量增殖，未檢測到胞外多糖的產(chǎn)生，之后伴隨著菌體的大量增殖同時分泌胞外多糖。但隨著碳源利用的殆盡，胞外多糖開始作為營養(yǎng)物質(zhì)被菌體利用。其中，兩種益生菌皆利用低聚半乳糖產(chǎn)生的胞外多糖的含量最高；其次是乳糖，再次是葡萄糖，利用半乳糖產(chǎn)胞外多糖含量最少。從菌體量和產(chǎn)胞外多糖含量來看，低聚半乳糖較其他幾種碳源，具有明顯的優(yōu)勢。不僅能促進(jìn)菌體的大量增殖，而且對益生菌發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖也有促進(jìn)作用，這也充分證實了低聚半乳糖的增殖性［17］和產(chǎn)胞外多糖的能力。

液相色譜檢測直觀地反映了長雙歧桿菌和植物乳桿菌可以利用4種不同的碳源產(chǎn)胞外多糖，利用低聚半乳糖產(chǎn)的胞外多糖的種類和含量較多。胞外多糖的種類多的可能原因是低聚半乳糖是一種混合糖，當(dāng)被菌體利用時，菌體內(nèi)的葡聚糖苷酶、己糖激酶、糖基-核苷酸合成及轉(zhuǎn)移酶，聚合酶等［19，20］充分發(fā)揮作用，生產(chǎn)不同種類的多糖。

通過模擬腸道微環(huán)境，檢測腸道益生菌產(chǎn)的胞外多糖對有害菌的黏附作用，電鏡掃描結(jié)果充分證實了長雙歧桿菌和植物乳桿菌將胞外多糖分泌到細(xì)胞外，在細(xì)胞表面的胞外多糖直接黏附致病菌，此時加之益生菌分泌抑菌素，在黏附的同時，將致病菌殺死，從而維持了腸道環(huán)境的平衡，保證了腸道的健康。由電鏡掃描的兩種益生菌的菌體形態(tài)飽滿，表明了長雙歧桿菌、植物乳桿菌都能耐受腸道的偏酸環(huán)境，在腸道中穩(wěn)定生存，更好的保證腸道環(huán)境的健康。

本實驗通過體外實驗對低聚半乳糖影響腸道益生菌的產(chǎn)胞外多糖進(jìn)行研究，與其他碳源比較，研究菌體生長、胞外多糖產(chǎn)量，運(yùn)用液相色譜檢測和環(huán)境掃描電鏡觀察，結(jié)果顯示，低聚半乳糖相對其他碳源的優(yōu)越性，胞外多糖種類和產(chǎn)量都較其他3種碳源更多。原因是腸道益生菌利用低聚半乳糖充分發(fā)揮了體內(nèi)各糖酶的催化潛力。益生菌在人體腸道中分泌的胞外多糖，還可能直接參與調(diào)節(jié)機(jī)體的內(nèi)源性抗氧化劑的作用，參與淬滅自由基，增強(qiáng)對人體健康的保護(hù)作用［21］。

4 結(jié)論

本研究采用4種碳源對照的方法對兩種益生菌的生長和產(chǎn)胞外多糖的含量進(jìn)行定量分析，并結(jié)合高效液相色譜法和環(huán)境電鏡掃描法對其產(chǎn)的胞外多糖進(jìn)行定性分析。試驗結(jié)果顯示，低聚半乳糖有促進(jìn)腸道益生菌產(chǎn)胞外多糖的作用，且相比其他幾種碳源，能較好地促進(jìn)長雙歧桿菌和植物乳桿菌大量增殖和提高胞外多糖的產(chǎn)量，其最高產(chǎn)量可達(dá)208.78 μg/mL。液相色譜檢測結(jié)果表明，與其他3種碳源比較，菌體利用低聚半乳糖分泌的胞外多糖種類更多，且各組分含量較高。掃描電鏡結(jié)果表明這兩種益生菌分泌的保外多糖能夠緊密黏附大腸桿菌，從而影響大腸桿菌的生長。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Effects of Galactooligosaccharide on Exopolysaccharide Produced by Intestinal Probiotics

Xin Yueqiang Liang Rongrong Wang Ruiming
（Department of Biotechnology，Qilu University of Technology，Key Laboratory for Microbial Engineering in Shandong Province，Ji’nan 250353）

The aim of the study is to investigate the effects of galactooligosaccharide on the yield of exopolysaccharides produced by intestinal probiotics. Using galactooligosaccharide， glucose， galactose and lactose as carbon sources， the utilization of carbon sources， the yield and varieties of exopolysaccharides and the adhesion of harmful bacteria were studied. Results indicated that galactooligosaccharide not only promoted reproduction of Bifidobacterium longum and Lactobacillus plantarum， but also improved the yield of exopolysaccharides with 208.78 μg/mL and 192.78 μg/mL respectively. Varieties of exopolysaccharides produced while using galactooligosaccharide as carbon source were more than other 3 ones， and the adhesion to harmful bacteria such as Escherichia coli was obvious. It is proved that galactooligosaccharide could promote B. longum and L. plantarum to produce more exopolysaccharides compared with the other 3 carbon sources.

galactooligosaccharide；exopolysaccharide；intestinal probiotics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.023

2014-10-19

辛躍強(qiáng)，男，碩士研究生，研究方向：微生物酶技術(shù)；E-mail：qiangzi890125@163.com

王瑞明，男，教授，研究方向：微生物酶技術(shù)；E-mail：ruiming3k@163.com