河北區(qū)試小麥品種（系）DNA指紋圖譜構(gòu)建及遺傳差異分析

李宏博龐斌雙劉麗華劉陽(yáng)娜趙昌平陳景堂

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，保定 071001；2. 北京市農(nóng)林科學(xué)院雜交小麥工程技術(shù)研究中心 雜交小麥分子遺傳北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097）

河北區(qū)試小麥品種（系）DNA指紋圖譜構(gòu)建及遺傳差異分析

李宏博1，2龐斌雙2劉麗華2劉陽(yáng)娜2趙昌平2陳景堂1

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，保定 071001；2. 北京市農(nóng)林科學(xué)院雜交小麥工程技術(shù)研究中心 雜交小麥分子遺傳北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097）

采用42個(gè) SSR 標(biāo)記為 2009-2013年河北省區(qū)域試驗(yàn)的70份小麥品種（系）構(gòu)建DNA指紋圖譜，進(jìn)行遺傳差異分析，為小麥品種改良和種質(zhì)資源創(chuàng)新提供參考。結(jié)果表明，42個(gè)SSR 標(biāo)記在70份品種（系）中共檢測(cè)到303個(gè)等位變異，單個(gè)SSR位點(diǎn)的平均等位變異為7.21個(gè)，PIC值平均0.69；基因多樣性平均0.73，遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.05-1.00，平均0.28；表明參加河北省區(qū)域試驗(yàn)的品種（系）間存在不同程度的遺傳差異。聚類分析把70份品種（系）劃分為4大類，6個(gè)亞類，表明同一育種單位或地區(qū)品種（系）遺傳背景相近，應(yīng)該加大外來(lái)小麥種質(zhì)資源的引進(jìn)和利用力度。

小麥；SSR標(biāo)記；DNA指紋圖譜；遺傳差異

小麥?zhǔn)鞘澜缟现饕Z食作物之一，也是我國(guó)繼玉米和水稻之后的第三大糧食作物。小麥區(qū)域試驗(yàn)是篩選優(yōu)良品種、促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)持續(xù)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的舉措，同時(shí)也是防止品種混雜退化、提高種子質(zhì)量的重要手段［1］。我國(guó)《主要農(nóng)作物品種審定辦法》規(guī)定（農(nóng)業(yè)部令2013年第4號(hào)），參加國(guó)家或省級(jí)區(qū)域試驗(yàn)的農(nóng)作物品種必須具備特異性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和穩(wěn)定性（Stability）。多年來(lái)隨著育成品種遺傳背景日漸趨同化，派生品種日益增多。因此，對(duì)參試小麥品種的遺傳背景進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，對(duì)于維護(hù)我國(guó)小麥種業(yè)健康持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展，保障我國(guó)小麥糧食安全意義重大。

SSR分子標(biāo)記由于數(shù)量豐富、多態(tài)性高、覆蓋全基因組、呈共顯性、技術(shù)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)［2-4］，被廣泛應(yīng)用在作物的DNA指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性研究。關(guān)于作物的DNA圖譜研究，我國(guó)已經(jīng)構(gòu)建了玉米［5］、水稻［6］、棉花［7］等主要農(nóng)作物品種的DNA指紋圖譜，在構(gòu)建小麥品種DNA指紋圖譜方面也開(kāi)展了相關(guān)研究工作［8-10］。而將SSR標(biāo)記用于小麥親緣關(guān)系、遺傳差異分析和遺傳多樣性等研究，前人做了大量工作。郝晨陽(yáng)等［11］對(duì)我國(guó)近50年育成小麥品種的遺傳多樣性演變規(guī)律進(jìn)行分析，詹克慧等［12］對(duì)黃淮麥區(qū)的部分小麥種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳差異研究。蒲艷艷等［13］、耿惠敏等［14］利用SSR標(biāo)記分別對(duì)山東省、河南省小麥品種進(jìn)行遺傳多樣性分析。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，采用42個(gè)SSR標(biāo)記，對(duì)70份2009-2013年參加河北省區(qū)域試驗(yàn)的小麥品種（系）構(gòu)建DNA 指紋圖譜，并對(duì)其進(jìn)行遺傳差異分析，以期為小麥的品種改良和種質(zhì)創(chuàng)新等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

為70份2009-2013年參加河北省小麥區(qū)域試驗(yàn)的品種（系），分為4個(gè)組別，黑龍港節(jié)水組17個(gè)，冀中北水地優(yōu)質(zhì)組11個(gè)，冀中南水地組28個(gè)和優(yōu)質(zhì)組14個(gè)，由河北省種子管理站提供（表1）。

1.2 方法

1.2.1 SSR標(biāo)記 選用均勻分布于小麥基因組的42對(duì) SSR標(biāo)記進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建和遺傳差異分析，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 基因組DNA提取 采用簡(jiǎn)化的CTAB法［15］提取70份材料的基因組DNA，每份材料取20個(gè)種胚混為一個(gè)樣品提取總DNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度，總DNA 用0.1×TE稀釋至50 ng/μL備用。

1.2.3 PCR擴(kuò)增、電泳與顯影 PCR 體系為10 μL，含 10×buffer 1.0 μL、10 mmol/L dNTP 0.2 μL、1.25 μmol/L引物 2.0 μL、2 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.25 μL、10 ng/μL模板DNA 3.0 μL、超純水3.55 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50-68℃（因引物而異）退火60 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，10℃保存。

PCR 產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離，采用簡(jiǎn)化硝酸銀染色法顯色［15］。擴(kuò)增產(chǎn)物的各種帶型按Wang 等［16］的方法賦值，構(gòu)建84位數(shù)的參試品種 DNA指紋。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用 Power marker V3.25軟件［17］對(duì)等位變異數(shù)、基因多樣性和多態(tài)性信息量（PIC值）等進(jìn)行分析。SSR引物的鑒別能力用PIC值表示，其計(jì)算公式為：PIC = 1-Σfi2，其中fi為I位點(diǎn)的基因頻率［18］。基因多樣性，是指群體內(nèi)隨機(jī)選擇的等位基因間可能存在的差異，對(duì)于第i個(gè)座位的基因多樣性的無(wú)偏估計(jì)值為：H=（n/n-1）（1-∑Pij2），其中 n 為材料數(shù)，Pij為第i 個(gè)位點(diǎn)第j個(gè)等位變異的頻率。利用NTSYS 2.10 軟件計(jì)算各品種間Dice遺傳相似系數(shù)，采用非加權(quán)組平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析［19］。

2 結(jié)果

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

42對(duì)SSR標(biāo)記在70份材料中共檢測(cè)到303個(gè)等位變異（表2），每個(gè)DNA位點(diǎn)的等位變異為4-12個(gè)，平均為7.21個(gè)；其中最多的引物為Xgwm334，有12個(gè)等位變異；其次為Xgwm285、Xcfd29和Xcfd35均有11個(gè)等位變異；而Xgwm610、Xgwm333的等位變異僅為4個(gè)。引物在PIC值變化范圍為0.41-0.84，平均值為0.69，說(shuō)明所采用的SSR引物對(duì)小麥品種的區(qū)分能力較好。比較了42個(gè)位點(diǎn)在A、B、D三個(gè)基因組的平均遺傳豐富度和遺傳多樣性指數(shù)，分別為6.94、6.53和7.50（D＞A＞B）和0.675、0.681和0.708（D＞B＞A）。結(jié)果表明，D基因組的遺傳多樣性較高。

2.2 小麥品種（系）DNA指紋圖譜分析

采用42個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)70份品種（系）進(jìn)行DNA指紋分析（圖1），19個(gè)品種（系）具有特征等位變異，即某種等位變異僅有1個(gè)品種具有（表3）。其中硬B216-6、師欒08-4、滄麥2007-102和SH299在3個(gè)位點(diǎn)上具有特征等位變異，具有2個(gè)和1個(gè)特征等位變異的分別為7個(gè)和8個(gè)。但隨著群體材料變化，特征等位變異可能出現(xiàn)在其他品種上。引物“Xgwm334”可鑒別出衡08觀29、滄麥2007-140、科0801、石H083-366和SH299，引物“barc174”可鑒別濟(jì)067251、冀麥185和寶麥38，表明這兩對(duì)引物多態(tài)性豐富，鑒別能力較強(qiáng)，可以用于DNA指紋圖譜構(gòu)建時(shí)的優(yōu)選標(biāo)記。

表1 小麥品種（系）信息

2.3 小麥品種（系）間遺傳差異分析

參試品系的遺傳相似系數(shù)（GS）為0.05-1.00，平均為0.28，品系間遺傳相似性變化較大。黑龍港節(jié)水組、冀中北水地優(yōu)質(zhì)、冀中南水地組、冀中南優(yōu)質(zhì)組平均遺傳相似系數(shù)分別為0.30、0.23、0.31和0.26，不同的區(qū)試組之間相差較??；其中科0901與邯農(nóng)531遺傳相似系數(shù)最高，GS值為1.00；相似系數(shù)最低的為衡5317和邯07-6092?；蚨鄻有越橛?.43-0.85之間，平均為0.73。以上結(jié)果表明，參試品系間存在不同程度的遺傳差異。

表2 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

表3 19個(gè)小麥品種（系）特征等位變異

2.4 聚類分析

根據(jù)70份小麥品種（系）42個(gè)SSR位點(diǎn)的DNA指紋圖譜計(jì)算材料間Dice相似系數(shù)，進(jìn)行UPGMA聚類分析。結(jié)果表明，在相似系數(shù)0.28處被分為4大類。

A類包括7個(gè)品種，均為參加優(yōu)質(zhì)組試驗(yàn)，其中6個(gè)品種為冀中南優(yōu)質(zhì)組，河北師范大學(xué)和藁城市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究選育的分別有3個(gè)和2個(gè)。

圖1 30個(gè)小麥品種（系）Xbarc59位點(diǎn)的指紋圖譜

B類包括14個(gè)品種，又分為B1和B2亞類。B1亞類的4個(gè)品系均為河北農(nóng)業(yè)大學(xué)育成。B2亞類包括10個(gè)品種，其中8個(gè)為參加冀中南水地組和優(yōu)質(zhì)組。其中濟(jì)067251、泰農(nóng)18和SH299的育成單位來(lái)自山東省，其余5個(gè)品種均來(lái)自石家莊地區(qū)。

C類包括21個(gè)品種，又被分為C1和C2亞類。C1亞類包括6個(gè)品種，有4個(gè)為參加冀中北水地優(yōu)質(zhì)組試驗(yàn)品種。C2亞類包括15個(gè)品種，其中參加冀中南區(qū)試的品種8個(gè)、黑龍港節(jié)水組6個(gè)，參試單位來(lái)自石家莊、邯鄲、邢臺(tái)、衡水和滄州地區(qū)。滄州市農(nóng)林科學(xué)院參試的3個(gè)品種被聚在一起。

D類包括28個(gè)品種，占供試材料的40%，其中主要包括參加冀中南水地組的17個(gè)、黑龍港節(jié)水組7個(gè)及冀中北水優(yōu)質(zhì)組的3個(gè)品系。該組育種單位多集中在河北省中部，僅河北農(nóng)業(yè)大學(xué)、石家莊市農(nóng)科院和河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作所參試品種就有15份。

3 討論

本研究采用帶紋清晰、簡(jiǎn)單、多態(tài)性好、重復(fù)性和穩(wěn)定性高的42對(duì)SSR標(biāo)記，為2009-2013年河北省區(qū)域試驗(yàn)小麥品種（系）構(gòu)建了DNA指紋圖譜，其中攜帶1-3個(gè)特征等位變異的品種有17份，因此利用1對(duì)引物即可將該品種與其他品種區(qū)分開(kāi)。對(duì)于檢測(cè)的70份材料，除科0901與邯農(nóng)531外，其余68個(gè)均能分開(kāi)，表明所采用的SSR引物的品種鑒別能力較強(qiáng)。42對(duì)SSR標(biāo)記在參試品種中共擴(kuò)增出303個(gè)等位變異，每個(gè)DNA位點(diǎn)平均7.21個(gè)，PIC值平均0.69，均高于劉路平等［20］、陳先紅等［21］每對(duì)引物平均3.88和5.89個(gè)等位變異，以及PIC值為0.53和0.61的研究結(jié)果，表明采用的SSR標(biāo)記對(duì)于構(gòu)建70份河北省參試品種的DNA指紋圖譜具有較強(qiáng)的區(qū)分能力和代表性。因此，可作為河北省小麥品種DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)的一部分使用。

潘玉朋等［22］對(duì)25份黃淮麥區(qū)近年大面積推廣品種進(jìn)行分析，遺傳相似系數(shù)為0.34-0.85，平均為0.61；蒲艷艷等［13］采用68個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)44份山東省近期育成品種進(jìn)行遺傳多樣性研究，品種間的遺傳相似系數(shù)為0.59-0.92，平均為0.69，兩者均表明所研究品種間的遺傳差異較小，遺傳基礎(chǔ)較窄。而本研究的70份材料的遺傳相似系數(shù)在0.05-1.00之間，平均0.28，參試品種間的遺傳相似系數(shù)變化幅度大，表明參加河北省區(qū)域試驗(yàn)小麥品種（系）間遺傳差異較大，遺傳基礎(chǔ)相對(duì)豐富。分析原因，可能與參試品系的來(lái)源有關(guān)，既有河北省科研單位，又有中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院、山東省育種單位；另一原因，按照國(guó)家冬小麥區(qū)域試驗(yàn)分組，河北省中南部屬于黃淮麥區(qū)北片，而中北部屬于北部冬麥區(qū)，使得選育的小麥品種生態(tài)類型比較豐富。

通過(guò)聚類將70份材料分為四大類，A類所包含的材料均為參加優(yōu)質(zhì)組試驗(yàn)，與其他類群中多數(shù)材料的遺傳差異較大。在四大類中，每個(gè)類群中均包括石家莊地區(qū)育種單位選育的材料，可能與該地區(qū)的育種單位所處于河北省的中部，使選育的品系有著較多的生態(tài)類型有關(guān)；而河北農(nóng)業(yè)大學(xué)參試的9個(gè)品系，4個(gè)被分在B1亞類，5個(gè)分在D類；河北省農(nóng)林科學(xué)院旱作所參試品種大多數(shù)被分D類，邯鄲、邢臺(tái)、滄州地區(qū)的參試品種均被分在C類。結(jié)果表明，同一地區(qū)或同一單位選育的品種多聚在相同類群，相似程度與育種單位或地區(qū)有著較明顯的關(guān)系，與王升星等［23］研究將同一麥區(qū)或者有共同系譜來(lái)源的小麥品種地聚為一類的結(jié)果較為一致。因而，在利用本地優(yōu)良資源的同時(shí)，加大國(guó)內(nèi)外優(yōu)良資源的引進(jìn)和利用，創(chuàng)制適應(yīng)本地區(qū)的育種中間材料，從而更加豐富新育成品種的遺傳差異。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，采用42對(duì)SSR標(biāo)記為2009-2013年參加河北省區(qū)域試驗(yàn)小麥品種（系）構(gòu)建的DNA指紋圖譜具有較強(qiáng)代表性，可作為河北省小麥品種的DNA指紋數(shù)據(jù)庫(kù)一部分使用。并利用DNA指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行區(qū)域試驗(yàn)小麥品種（系）間的遺傳差異分析，表明參試品種的遺傳差異較大，但品種間的相似程度與育種單位或地區(qū)有著較明顯的關(guān)系。因而，DNA指紋圖譜對(duì)于小麥品種親緣關(guān)系鑒定是非常有效的技術(shù)手段。

致謝：特別感謝河北省種子管理站鮑聰和張力同志對(duì)本實(shí)驗(yàn)材料的提供和幫助。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Construction of DNA Fingerprinting and Analysis of Genetic Diversity for Wheat Varieties（Lines）in Regional Test of Hebei

Li Hongbo1，2Pang Binshuang2Liu Lihua2Liu Yangna2Zhao Changping2Chen Jingtang1
（1. Department of Agronomy，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001；2. Hybrid Technology Engineering Research Center of Wheat，Beijing Academy of Agriculture and Forestry，The Municipal Key Laboratory of Hybrid Wheat Molecular Genetic，Beijing 100097）

In order to provide a reference for improving and innovating breeding materials， we used forty two pairs of SSR primers to construct DNA fingerprints and detect genetic diversity among 70 wheat varieties（lines）， which participated in regional test of Hebei in 2009-2013. The results showed that 303 allelic were revealed on 42 SSR loci， 7.21 alleles were detected for each SSR locus， and the average PIC（polymorphism information content）value was 0.69. Moreover， the average gene diversity was 0.73， and the genetic similarity varied from 0.05 to 1.00 with the average of 0.28. These results indicated that there is a large genetic difference between the wheat varieties（lines）in regional test of Hebei. The cluster analysis divided the 70 wheat varieties（lines）into four groups and six subgroups by UPGMA method. These results show that the wheat varieties（lines）have similar genetic background in the same breeding institute or region. We should strengthen the introduction and utilization of foreign wheat germplasm resources.

wheat；SSR markers；DNA fingerprinting；genetic varieties

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.034

2015-03-24

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2014BAD01B09，2013BAD04B01），北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新重大專項(xiàng)（KJCX20140421，KJCX20140202）

李宏博，男，碩士研究生，研究方向：分子育種；E-mail：li-hb1208@163.com

陳景堂，男，博士，教授，研究方向：作物性狀遺傳改良；E-mail：chenjingtang@126.com趙昌平，男，博士，研究員，研究方向：小麥遺傳育種；E-mail：cp_zhao@vip.sohu.com