S100A4和P53蛋白在肥厚型心肌病心肌纖維化中的表達(dá)及意義

戚曉琳　韓繼召　董嫻寧　趙鵬▲

1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島266071；2.山東省青島市公安局刑警支隊(duì)法醫(yī)科，山東青島266034；3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，山東青島266061

S100A4和P53蛋白在肥厚型心肌病心肌纖維化中的表達(dá)及意義

戚曉琳1韓繼召2董嫻寧3趙鵬3▲

1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島266071；2.山東省青島市公安局刑警支隊(duì)法醫(yī)科，山東青島266034；3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，山東青島266061

目的研究肥厚型心肌病（HCM）患者心肌細(xì)胞中S100A4、P53蛋白的表達(dá)，探討其與HCM心肌纖維化的關(guān)系。方法選擇2013年1月～2014年6月就診于北京阜外心血管醫(yī)院的HCM手術(shù)患者10例作為HCM組，10例青島地區(qū)交通事故及高墜致死者心肌組織為對(duì)照組。應(yīng)用苦味酸天狼星紅染色法比較兩組的膠原容積分?jǐn)?shù)；運(yùn)用免疫組化法比較兩組心肌組織內(nèi)S100A4、P53陽性表達(dá)情況；運(yùn)用原位雜交方法檢測S100A4、P53 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果HCM組心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。HCM組心肌組織S100A4、P53的IOD值均高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。HCM組心肌組織S100A4、P53的原位雜交值均高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論S100A4、P53蛋白過度表達(dá)可能在HCM心肌纖維化過程中發(fā)揮重要作用，可能為HCM心肌纖維化的治療提供新的方向。

肥厚型心肌??；心肌纖維化；S100A4；P53

肥厚型心肌?。╤ypertrophic cardiomyopathy，HCM）是常見的遺傳性心肌病，是以心肌非對(duì)稱性肥厚、左心室充盈受限、心室腔變小、舒張期順應(yīng)性下降為特征的心肌?。?-3］。HCM是青壯年心源性猝死（sudden cardiac death，SCD）的首要病因［4］。HCM年死亡率約為1%，世界范圍內(nèi)的發(fā)病率約為0.2%［5］。HCM心肌纖維化，尤其是瘢痕形成被認(rèn)為是導(dǎo)致惡性心律失常的重要原因［6-7］。HCM患者發(fā)生猝死主要由惡性心律失常所致。因此對(duì)于HCM心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制及其影響因素的研究已經(jīng)成為HCM的研究熱點(diǎn)。

S100A4是鈣離子結(jié)合蛋白家族成員之一，S100A4蛋白定位在細(xì)胞核中，有報(bào)道證實(shí)，S100A4參與心肌纖維化的發(fā)生，從而導(dǎo)致心肌膠原蛋白過度降解，引發(fā)心臟組織重構(gòu)［8-9］。它還能調(diào)節(jié)DNA與P53結(jié)合并影響其功能［10］。然而S100A4在HCM心肌組織中的作用機(jī)制還不清楚。本研究主要探討S100A4在心肌纖維化中的作用及其與P53的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇2013年1月～2014年6月就診于北京阜外心血管醫(yī)院的HCM手術(shù)患者10例作為HCM組，排除標(biāo)準(zhǔn)：患有嚴(yán)重感染、腫瘤、腎衰竭、自身免疫疾病、結(jié)締組織疾病和其他嚴(yán)重慢性病者［11］。10例交通事故及高墜致死者心肌組織為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：無心血管及嚴(yán)重慢性病病史，無心律失常、心肌肥厚及心臟結(jié)構(gòu)性病變。本研究的實(shí)施嚴(yán)格遵照赫爾辛基宣言，已通過北京阜外醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查。每例入組的參與者（及對(duì)照組家屬）均簽署書面知情同意書。

1.2主要儀器與試劑

Excelsior TM ES自動(dòng)組織脫水機(jī)、Histocentre 3TM組織包埋機(jī)（德國Leica公司），SM2000R石蠟切片機(jī)（德國Leica公司），DP-BSW軟件（日本奧林巴斯公司），電熱恒溫水浴箱（北京醫(yī)療器械廠），Image-Pro Plus 6.0彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）。

一抗兔抗人S100A4、一抗兔抗人P53、山羊抗兔二抗、DAB顯色劑、PBS磷酸鹽緩沖液、抗體稀釋液、Tris/EDTA修復(fù)液（pH 9.0）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），天狼星紅染色試劑盒（上海榕柏生物技術(shù)有限公司），mRNA原位雜交探針（武漢Stargene實(shí)驗(yàn)技術(shù)研發(fā)中心），Cyclin B1 mRNA原位雜交試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。S100A4靶基因的mRNA序列為：5′-GATGAGCAACTTGGACAGCAA-3′；5′-CTGGGCTGCTTATCTGGGAAG-3′。P53靶基因的mRNA序列為：5′-ACGACGGTGACACGCTTCCCTG-3′；5′-CGCTAGGATCTGACTGCGGCTC-3′。

1.3固定、取材及切片

常規(guī)取材入組心肌組織進(jìn)行脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片5張，厚度為4 μm，用于進(jìn)行苦味酸天狼星紅染色、免疫組化染色和mRNA原位雜交。

1.4苦味酸天狼星紅染色法檢測心肌纖維化程度

苦味酸天狼星紅染色方法［12］：常溫下（25℃）滴加苦味酸混合液、天狼星紅（天狼星紅1 g，飽和苦味酸100 mL，蒸餾水100 mL配制而成）適量，15～20 min后用95%乙醇洗片至無色，晾干切片，用中性樹膠進(jìn)行封片。

心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）計(jì)算：每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野（200×）進(jìn)行拍照，用Image-Pro Plus 6.0軟件分別對(duì)5個(gè)圖像進(jìn)行分析，計(jì)算心肌間質(zhì)CVF后取均值［13］。CVF=膠原面積/全視野面積。

1.5 S100A4、P53免疫組化染色

采用PV-6000免疫組化染色方法分別對(duì)兩組進(jìn)行S100A4、P53免疫組化染色。一抗S100A4、P53稀釋度為1∶150，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

心肌細(xì)胞S100A4、P53陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒。每張切片按等距抽樣原則隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)視野（400×）進(jìn)行拍照，用Image-Pro Plus 6.0軟件分別對(duì)圖像進(jìn)行分析，分別測出其平均光密度、面積，計(jì)算心肌細(xì)胞內(nèi)S100A4、P53陽性表達(dá)的積分光密度［14］（integral optical density，IOD）后取均值。IOD=平均光密度×面積。

1.6原位雜交檢測心肌S100A4、P53 mRNA表達(dá)

原位雜交檢測心肌S100A4、P53 mRNA表達(dá)，每片組織滴加20 μL雜交液［包含1 ng/μL cRNA探針，200 μg/mL葡萄糖，4×鹽水枸櫞酸鈉（SSC）］，然后放入含50%甲酰胺濕盒中雜交16～20 h，于2×SSC洗3次，用1∶100馬血清封閉后，用Avidin+Biotin-HRP孵育，最后用NBT/BCTP（450 μg/mL∶175 μg/mL）顯色30 min后終止并用明膠封片。

原位雜交結(jié)果以結(jié)構(gòu)清晰且著色顯著高于背景，在細(xì)胞核或胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的為陽性，不著色或顯色強(qiáng)度與背景無明顯差別者為陰性細(xì)胞［15］。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（400×），統(tǒng)計(jì)其陽性細(xì)胞數(shù)量和著色程度，取均值。采用原位雜交值法進(jìn)行陽性結(jié)果統(tǒng)計(jì)［16］。A表示陽性細(xì)胞數(shù)分級(jí)：0%～1%=0、1%～10%=1、10%～50%=2、50%～80%=3、80%～100%=4；B表示陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí)：0（陰性）、1（弱陽性）、2（陽性）、3（強(qiáng)陽性），原位雜交值=A×B。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組心肌組織天狼星紅染色結(jié)果

HCM組心肌組織CVF為0.218±0.087，較對(duì)照組的0.098±0.031高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝4.10，P＜0.01）。

HCM組：心肌細(xì)胞呈現(xiàn)紫紅色，多數(shù)細(xì)胞的橫切面積明顯肥大，心肌間質(zhì)可見大量膠原纖維組織增生（圖1A）。對(duì)照組：心肌細(xì)胞呈紅色，細(xì)胞橫切面積未見明顯異常，心肌間質(zhì)可見少量紅色膠原纖維（圖1B）。2.2兩組心肌組織S100A4、P53免疫組化染色結(jié)果

圖1　兩組心肌組織天狼星紅染色結(jié)果（200×）

HCM組心肌組織S100A4、P53的IOD值均高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1　兩組心肌組織S100A4、P53的IOD值比較（x±s）

HCM組心肌細(xì)胞內(nèi)S100A4、P53陽性顆粒表達(dá)顯著增多，對(duì)照組心肌細(xì)胞內(nèi)S100A4、P53呈少量表達(dá)。見圖2。

2.3兩組心肌組織S100A4、P53原位雜交結(jié)果

HCM組心肌組織S100A4、P53的原位雜交值均高于對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

HCM組心肌細(xì)胞內(nèi)S100A4、P53 mRNA陽性表達(dá)顯著增多，對(duì)照組心肌細(xì)胞內(nèi)S100A4、P53 mRNA呈少量表達(dá)。見圖3。

圖2　兩組心肌組織S100A4、P53免疫組化染色結(jié)果（200×）

表2　兩組心肌組織S100A4、P53原位雜交值比較（x±s）

圖3　兩組心肌組織S100A4、P53原位雜交結(jié)果（200×）

3　討論

心肌纖維化是HCM患者典型的病理學(xué)改變，也是一系列臨床表現(xiàn)的病理基礎(chǔ)，在一定程度上心肌纖維化的程度決定患者的預(yù)后［17］。本研究應(yīng)用苦味酸天狼星紅染色法比較兩組的CVF，研究發(fā)現(xiàn)，HCM組膠原含量明顯高于對(duì)照組，提示心肌組織膠原重構(gòu)時(shí)在體內(nèi)的膠原合成增強(qiáng)。S100A4蛋白是鈣結(jié)合蛋白家族成員之一，有研究表明，S100A4蛋白參與心肌纖維化的發(fā)生，促進(jìn)其心肌膠原蛋白過度降解，進(jìn)而導(dǎo)致心臟組織重構(gòu)加重［10，18］。

P53蛋白是S100A4的靶蛋白之一，與S100A4蛋白共同定位在細(xì)胞核內(nèi)并相互作用，主要誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和促進(jìn)分化［19］。在滑膜組織成纖維細(xì)胞上，S100A4可能與P53相互作用從而導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的異常增殖［20］。有實(shí)驗(yàn)顯示，在心肌肥大的大鼠心肌纖維化過程中，S100A4能通過調(diào)節(jié)P53相關(guān)基因，使S100A4蛋白與野生型P53蛋白發(fā)生整合，使野生型P53蛋白作用于成纖維細(xì)胞，促進(jìn)其異常增殖，膠原合成增加，并在細(xì)胞外間質(zhì)不斷沉積，最終表現(xiàn)為間質(zhì)纖維化［20］。

免疫組化法檢測HCM患者心肌組織中S100A4、P53的蛋白表達(dá)，運(yùn)用原位雜交法結(jié)果表明，HCM心肌組織中的S100A4、P53蛋白表達(dá)陽性率顯著高于對(duì)照組，提示S100A4、P53的相互作用可能導(dǎo)致某些細(xì)胞因子作用于成纖維細(xì)胞，促使其遷移、過度增殖，進(jìn)而導(dǎo)致膠原合成增加。目前已有研究支持心肌纖維化是HCM的原發(fā)改變而非繼發(fā)于心肌肥厚之后的病理改變［21］。

S100A4、P53的相互作用與HCM心肌纖維化的關(guān)系尚未見國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，本研究盡管在mRNA水平和蛋白水平顯示HCM組S100A4、P53表達(dá)以及膠原含量變化較對(duì)照組明顯增高，但S100A4、P53在HCM心肌纖維化過程中的詳盡作用有待進(jìn)一步研究。

［1］HughesSE.Thepathologyofhypertrophiccardiomyopathy［J］. Histopathology，2004，44（5）：412-427.

［2］Hershberger RE，Cowan J，Morales A，et al.Progress with genetic cardiomyopathies：screening，counseling，and testing in dilated，hypertrophic，and arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy［J］.Circ Heart Fail，2009，2（3）：253-261.

［3］宋金萍.63例肥厚型心肌病的心電圖分析［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（6）：138-139.

［4］Maron BJ，Maron MS.Hypertrophic cardiomyopathy［J］. Lancet，2013，381（9862）：242-255.

［5］Moreno V，Hernandez-Romero D，Vilchez JA，et al.Serum levelsofhighsensitivitytroponinT：anovelmarkerforcardiac remodeling in hypertrophic cardiomyopathy［J］.J Card Fail，2010，16（12）：950-956.

［6］Maron BJ.Hypertrophic cardiomyopathy：a systematic review［J］.JAMA，2012，287（10）：1308-1320.

［7］于瑞，王幼平，崔琳，等.心肌纖維化的發(fā)病機(jī)制及其研究進(jìn)展［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2015，53（13）：157-160.

［8］Grotterod I，Maelandsmo GM，Boye K.Signal transduction mechanisms involved in S100A4-induced activation of the transcription factor NF-kappaB［J］.BMC Cancer，2010，10：241.

［9］Schneider M，Kostin S，Strom CC，et al.S100A4 is upregulated in injured myocardium and promotes growth and survival of cardiac myocytes［J］.Cardiovasc Res，2007，75（1）：40-50.

［10］Fernandez-Fernandez MR，Veprintsev DB，F(xiàn)ersht AR.Proteins of the S100 family regulate the oligomerization of p53 tumor suppressor［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（13）：45-47.

［11］Spoladore R，Camici PG，Olivotto I.Pharmacological treatment options for hypertrophic cardiomyopathy：high time for evidence［J］.Eur Heart J，2012，33（14）：17-24.

［12］賈志梅，高遠(yuǎn).心肌梗死大鼠非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡與間質(zhì)纖維化的關(guān)系［J］.中國心血管雜志，2007，12（5）：467.

［13］Wolff RB.Glucosamine and chondroitin sulfate association increases tibial epiphyseal growth plate proliferation and bone formation in ovariectomized rats［J］.Clinics（Sao Paulo），2014，69（12）：847-853.

［14］Henrotin Y，Marty M，Mobasheri A.What is the current status of chondroitin sulfate and glucosamine forthe treatment of knee osteoarthritis？［J］.Maturitas，2014，78（3）：184-187.

［15］馮相平，董文彬，陳新山.冠心病猝死冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊單核細(xì)胞趨化蛋白1表達(dá)的研究［J］.中華心血管病雜志，2006，34（7）：598-601.

［16］Teunissen BE，Smeets PJ，Willemsen PH，et al.Activation of PPAR delta inhibits cardiac fibroblast proliferation and the transdifferentiation into myofibroblasts［J］. Cardiovasc Res，2007，75（3）：519-529.

［17］顏玲玲，郝晶，宋寧，等.肥厚型心肌病患者心肌纖維化指標(biāo)變化及其相關(guān)性［J］.江蘇醫(yī)藥，2014，40（22）：2691-2693.

［18］張海燕，魏宗德.心肌膠原網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)的研究進(jìn)展［J］.心血管病學(xué)進(jìn)展，2003，24（5）：359-362.

［19］Berge G，Maelandsmo GM.Evaluation of potential interactionsbetweenthemetastasis-associatedprotein S100A4 and the tumor suppressor protein p53［J］.Amino Acids，2011，41（4）：863-873.

［20］CreemersEE，PintoYM.Molecular mechanisms that control interstitial fibrosis in the pressure-overloaded heart［J］. Cardiovasc Res，2011，89（2）：265-272.

［21］Tamaki Y，Iwanaga Y，Niizuma S，et al.Metastasis-associated protein，S100A4 mediates cardiac fibrosis potentially through［J］.J Mol Cell Cardiol，2013，57：72-81.

Expression and significance of S100A4 and P53 in myocardial fibrosis of hypertrophic cardiomyopathy

QI Xiaolin1HAN Jizhao2DONG Xianning3ZHAO Peng3▲
1.Medical College of Qingdao University，Shandong Province，Qingdao266071，China；2.Department of Forensic Medicine，Public Security Bureau Criminal Police Detachment of Qingdao City，Shandong Province，Qingdao 266034，China；3.Department of Pathology，Affiliated Hospital of Qingdao University，Shandong Province，Qingdao266061，China

Objective To investigate the expression of S100A4 and P53 of cardiomyocytes in patients with hypertrophic cardiomyopathy（HCM）and their correlation with myocardial fibrosis of HCM.Methods 10 cases of patients with HCM operation in Beijing Fuwai Cardiovascular Hospital from January 2013 to June 2014 were selected as HCM group.10 cases of myocardial tissues of traffic accidents and high fall to the death in Qingdao area were selected as control group.Collagen volume fraction between two groups was compared by using picrosirius red staining method.Positive expression of S100A4 and P53 in myocardial tissue between two groups were compared by using immunohistochemical method.Expression of S100A4 mRNA and P53 mRNA were detected by using in situ hybridization method.Results Collagen volume fraction of myocardial interstitial in HCM group was significantly higher than that in control group（P＜0.01）.IOD of S100A4，P53 in HCM group were significantly higher than those in control group，the differences were statistically significant（P＜0.01）.In situ hybridization value of S100A4，P53 in HCM group were significantly higher than those in control group，the differences were statistically significant（P＜0.01）.Conclusion Overexpression of S100A4 and P53 may play an important role in the process of myocardial fibrosis in HCM，may provide a new direction for the treatment of myocardial fibrosis in HCM.

Hypertrophic cardiomyopathy；Myocardial fibrosis；S100A4；P53

R542.2

A

1673-7210（2015）12（b）-0044-04

2015-09-23本文編輯：李亞聰）

山東省青島市產(chǎn)學(xué)研合作引導(dǎo)計(jì)劃（應(yīng)用基礎(chǔ)研究）（13-1-4-141-jch）。

戚曉琳（1989.10-），女，青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)病理學(xué)專業(yè)2013級(jí)在讀碩士研究生；研究方向：肥厚型心肌病與心源性猝死。