納豆激酶生產(chǎn)菌的篩選及發(fā)酵納豆特性研究

趙仲麟李淑英聶瑩李燕袁超唐選明

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，鄭州 450002；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；3.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450002）

納豆激酶生產(chǎn)菌的篩選及發(fā)酵納豆特性研究

趙仲麟1李淑英2聶瑩2李燕3袁超1唐選明2

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，鄭州 450002；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；3.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450002）

為開發(fā)具有特定生理活性的新型納豆保健品，從發(fā)酵豆制品中分離篩選得到一株納豆激酶高產(chǎn)菌株。利用該菌株以及市售的3種納豆中的納豆菌進行納豆發(fā)酵，比較了4株納豆菌發(fā)酵納豆的特性，并對納豆激酶活性進行分析。結(jié)果表明5號菌株發(fā)酵生產(chǎn)納豆周期短，顏色金黃，具有醬香味，拉絲長度最佳。同時，對產(chǎn)納豆激酶的最佳發(fā)酵時間進行研究，結(jié)果表明發(fā)酵至17 h納豆激酶活性達到最大值。

納豆激酶；篩選；酶活；特性

納豆作為一種日本傳統(tǒng)食物已有上千年的歷史，是大豆經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵而來。納豆中含有納豆激酶，是具有強力的纖維蛋白溶解特性一種酶類［1］。利用其特性可以開發(fā)相關(guān)的抗血栓癥藥物。血栓則是由血小板和纖維蛋白聚集形成的，有效的血栓溶解劑能切開血栓上纖維蛋白凝塊，如纖溶酶。納豆激酶屬于枯草桿菌絲氨酸蛋白酶，其溶血栓活性是纖溶酶的4倍［2］。研究顯示納豆激酶可在體外將血栓水解，間接地將血纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化為血纖維蛋白溶酶，使纖維蛋白凝塊水解，通過抑制血小板的凝聚和血栓的形成從而改善血流［3］。Xu等［4］使用不同劑量的納豆激酶處理血栓小鼠，發(fā)現(xiàn)納豆激酶對血栓還具有體內(nèi)活性。

納豆激酶不僅可以直接溶解交聯(lián)狀的血栓，還可以催化血纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化為有活性的血纖維蛋白溶酶，增加體內(nèi)血栓溶解因子，諸如t-PA的合成，失活纖維蛋白溶酶抑制劑（PAI-1）等，在體內(nèi)具有增強的血栓溶解活性［5］；與臨床藥物相比，具有纖溶活性高、無毒副作用、半衰期長、生產(chǎn)成本低廉等優(yōu)點［6，7］。Fadl等［8］發(fā)現(xiàn)納豆激酶對緩解阿爾茨海默病也有一定幫助。因此，納豆是一種潛在的、可以開發(fā)為一種預(yù)防和治療心腦血管疾病的功能食品［9］。本研究對納豆激酶生產(chǎn)菌進行了分離篩選，并將得到的高產(chǎn)菌株到與其他3種市售納豆菌進行納豆發(fā)酵，對產(chǎn)品的感官和納豆激酶酶活進行比較，以期為納豆激酶生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)應(yīng)用及潛在的市場應(yīng)用價值進行評估。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 市售及民間豆醬、豆豉等各種發(fā)酵豆制品，均購買于超市。

1.1.2 試劑 纖維蛋白原（牛血，批號：140626-201009）、尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品（1280 U/支）和凝血酶（560 U/支）均購于中國藥品生物制品檢定所；LB Broth Ultrapure（USB），胰蛋白胨（OXOID），酪蛋白（Sigma），其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 篩選培養(yǎng)基為酪蛋白平板培養(yǎng)基，具體配方：酪蛋白 1%、酵母提取物 0.5%、NaCl 0.9%、瓊脂2%，pH7.2-7.4，121℃滅菌20 min，現(xiàn)配現(xiàn)用。種子和液體發(fā)酵培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基，酪蛋白 1%、酵母提取物 0.5%、NaCl 1%，pH7.0，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 納豆激酶生產(chǎn)菌株篩選 取 5 g 發(fā)酵豆制品，放入裝有 20 mL 無菌生理鹽水和10余顆玻璃珠的三角瓶中，每隔10 min 振蕩1 次，室溫下浸提1 h，3 000 r/min離心5 min，制得菌懸液；85℃熱處理30 min，生理鹽水倍比稀釋后，取 100 μL 涂布酪蛋白平板，30℃培養(yǎng)18 h。復(fù)篩時，觀察酪蛋白平板上的單菌落，挑選溶解圈大的菌株用無菌牙簽點酪蛋白平板，30℃培養(yǎng)12 h，選取溶解圈較大的菌株，反復(fù)篩選5次后，接種LB單菌落平板，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 納豆制備及粗酶液的提取 將篩選菌株接種到3 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)活化菌株；2%的接菌量轉(zhuǎn)接到50 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)4 h，4 000 r/min離心10 min收集菌株，生理鹽水洗3次，稱取菌株濕重，加入生理鹽水，配置成相同菌液濃度的菌懸液（菌落數(shù)約為107/mL）備用。大豆原料洗凈，浸泡后分裝成200 g每瓶，蒸煮，放涼（約50℃左右），將1 mL菌懸液加入滅菌的黃豆中，發(fā)酵至表面產(chǎn)生白膜后停止發(fā)酵，4℃后熟12 h得納豆成品。

取從各種豆制品中分離純化得到的高活力菌株，按照以上工藝生產(chǎn)納豆，以拉絲長度評價納豆品質(zhì)。拉絲長度測定：用筷子挑起，20 cm為一單位，從中間部位再拉20 cm，重復(fù)進行，直至拉斷。

取適量發(fā)酵好的納豆放入燒杯，加入5倍體積的生理鹽水，于4℃下以磁力攪拌器攪拌2 h，以6層紗布過濾除豆渣，取納豆液，12 000×g、4℃離心5 min，所得上清液，即為納豆激酶粗提液。

1.2.3 納豆激酶酶活分析 纖維蛋白平板法測納豆激酶活力，為改進的Astrup法［10］，具體如下：0.1 g瓊脂糖加到10 mL 10 mmol/L PBS（pH7.2），微波爐加熱溶解，50℃恒溫水浴10 min；0.01 g纖維蛋白原加到10 mL 10 mmol/L PBS（pH7.2），玻璃棒攪勻，50℃恒溫水浴10 min；將10 μL凝血酶（0.1 IU/μL）加到瓊脂糖溶液中，混勻；再將纖維蛋白原溶液加入瓊脂糖溶液中，迅速混勻并倒于9×9 cm平皿中，室溫放置90 min，使其充分凝固。5 mm打孔器打孔，上樣，室溫放置10 min，于37℃恒溫18 h，游標(biāo)卡尺測量溶解圈的兩個垂直直徑，計算溶解圈的面積，根據(jù)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶的活力單位。尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考馬明等［11］的方法。

1.2.4 最適發(fā)酵時間分析 將篩選菌株活化后，按方法1.2.2和1.2.3進行納豆的發(fā)酵，于13 h 起每隔1 h取5 g納豆，連續(xù)取5 h，分別提取納豆激酶粗酶液進行酶活分析。

2 結(jié)果

2.1 納豆菌的篩選

以從日本納豆中篩選的菌株為陽性對照，從多家超市購買納豆、豆醬、豆豉及民間自釀豆醬等發(fā)酵豆制品中篩選納豆激酶產(chǎn)生菌。通過酪蛋白平板法檢測菌落蛋白酶水解活性，最終獲得具有較明顯溶解圈的菌株 8株，其中5號菌落水解圈最大。通過納豆激酶活性測定，結(jié)果顯示5號菌落具有最好的酶活性（圖1-A），納豆激酶活性分析顯示5號菌產(chǎn)的激酶活性最高（圖1-B）。

圖1 菌落蛋白酶水解活性試驗

2.2 納豆的感官評價

利用5號菌株以及從市售的3種納豆（S1，S2，S3）中分離到的納豆菌進行納豆發(fā)酵，對大豆發(fā)酵后制得納豆進行感官評價。4種發(fā)酵納豆產(chǎn)品均為亮黃色，具有納豆特有的醬香氣味，納豆絲里含納豆激酶，拉絲長度測定結(jié)果，如圖2。5號菌株發(fā)酵所得納豆拉絲長度最好，為75 cm；其次為S2納豆菌發(fā)酵所得納豆，拉絲長度60 cm；S1納豆和S3納豆相對較短，拉絲長度分別為54 cm和45 cm。

圖2 納豆產(chǎn)品的拉絲長度比較

2.3 納豆激酶活性分析

從5號菌株和其他市售的3種納豆分離出的納豆菌發(fā)酵得到的納豆中提取粗酶液，進行活性分析，結(jié)果如表1所示。S2納豆菌和S1納豆菌所產(chǎn)的納豆激酶活性最高，約為131 FU/g，5號納豆的納豆激酶活性次之，為121.538 FU/g，S3納豆中納豆激酶活性為100 FU/g。雖然5號菌株發(fā)酵納豆的納豆激酶活性居中，但是該菌株實現(xiàn)了較快的發(fā)酵速度，發(fā)酵形成白膜的時間較其他菌株早大約2 h，且產(chǎn)生白膜的厚度和黏度明顯強于其他菌株，這也可能是其拉絲長度強于其他菌株的原因。

表1 納豆激酶酶活分析

2.4 最適發(fā)酵時間分析

為研究5號菌株發(fā)酵納豆的特性，找到最佳發(fā)酵時間，將5號菌株活化后進行納豆發(fā)酵，從13 h開始每隔1 h取樣，提取粗酶液，纖維蛋白法測定粗酶液活性，并繪制5號菌株納豆發(fā)酵過程中納豆激酶活性曲線（圖3）。結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時間的延長，5號菌株發(fā)酵納豆產(chǎn)生的納豆激酶呈緩慢遞增的趨勢，17-18 h趨于平緩，17 h時的納豆激酶活性最高，為92.278 FU/g。

圖3 5號菌株納豆激酶活性曲線

3 討論

本試驗對分離篩選的納豆激酶生產(chǎn)菌與其他3種市售納豆菌進行了納豆發(fā)酵，對產(chǎn)品和納豆激酶酶活性進行了比較。5號菌發(fā)酵得到的產(chǎn)品口感佳、氣味好，雖然酶活相對居中，但具有最高的拉絲長度。此外，5號菌株發(fā)酵納豆產(chǎn)生的納豆激酶呈緩慢遞增的趨勢，17 h的納豆激酶活性最高，相比其他3株納豆菌發(fā)酵時間略短。菌株的發(fā)酵條件對產(chǎn)品中納豆激酶含量的影響較大，可以通過酶活優(yōu)化培養(yǎng)基組成和發(fā)酵工藝提高芽孢桿菌的納豆激酶產(chǎn)量［12］，通過采用單因素和正交試驗對篩選菌株的納豆激酶的液體發(fā)酵條件進行研究，也可通過分子生物學(xué)的手段對納豆激酶基因進行改造［13］，以期提高納豆激酶產(chǎn)量，為該酶的進一步擴大培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

目前已商業(yè)化應(yīng)用的納豆激酶熱穩(wěn)定性較差，溫度到達60℃時，納豆激酶瞬間失活，在制備膠囊和長期運輸?shù)倪^程中會喪失大部分活力，影響其實際使用效果。通過增加酶量，且在低溫儲運來緩解納豆激酶的活性損失，不利用工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)及推廣。另外，納豆激酶在酸性環(huán)境下也容易失活，在胃液環(huán)境中將完全失去活性。因此，未來的研究主要集中在納豆激酶基因的篩選及產(chǎn)品包被膠囊化等方面［14，15］，以期得到性能優(yōu)良、可商品化的納豆激酶。我們后期的研究主要是克隆該納豆激酶的基因，并對其進行突變改造，以期提高其酶活性及熱穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

本研究篩選到了一株納豆激酶生產(chǎn)菌，利用該菌株以及市售的3種納豆中的納豆菌進行納豆發(fā)酵試驗，篩選到的5號菌株發(fā)酵生產(chǎn)納豆的周期較短，得到的納豆產(chǎn)品顏色金黃，具有醬香味，拉絲長度極佳。表明發(fā)酵至17 h納豆激酶活性達到最大值，該菌株可作為潛在的納豆生產(chǎn)菌株。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Screening of Nattokinase Producing Strain and Characterazation of Nattokinase

Zhao Zhonglin1Li Shuying2Nie Ying2Li Yan3Yuan Chao1Tang Xuanming2
（1. College of Sciences，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002；2. Institute of Agro-products Processing Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193；3. School of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002）

To develop new kinds of natto health care products with specific physiological activity， a nattokinase high-yield strain was isolated and used for natto production. The characteristics and nattokinase activities of the isolated strain were compared with other 3 kinds of natto strains. Results showed that the natto products of munber 5 strain have golden color and soy sauce flavor， and have the best length of natto wire drawing. The result of fermentation time showed that nattokinase content reached the maximum value at 17 h.

nattokinase；screen；enzyme activity；characteristic

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.023

2014-09-05

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技經(jīng)費項目（201211），公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費項目（201303080）

趙仲麟，男，博士，副教授，研究方向：化學(xué)生物學(xué)、環(huán)境微生物；E-mail：rayzzl@163.com

李淑英，女，博士，助研，研究方向：微生物生化與分子生物學(xué)；E-mail：lishuying@caas. cn