醋酸鈣不動桿菌的分離鑒定及溶藻特性

王赟 張業(yè)猛 李佩佩

（河南城建學院生命科學與工程學院，平頂山 467036）

醋酸鈣不動桿菌的分離鑒定及溶藻特性

王赟 張業(yè)猛 李佩佩

（河南城建學院生命科學與工程學院，平頂山 467036）

淡水微囊藻水華不僅造成水體動植物缺氧死亡，而且釋放藻毒素，影響人類和其它動物的健康。利用液體感染技術(shù)，從河南省平頂山市白龜山水庫分離一株能夠溶解銅綠微囊藻PCC 7806的溶藻菌，命名為溶藻菌5，16S rDNA核苷酸序列測序證實該菌株為醋酸鈣不動桿菌。它具有一定的溶藻特異性，只溶解PCC 7806，對FACHB-930和斜生柵藻沒有影響，能夠促進衣藻和紅球藻的生長。最佳溶藻體積比為1∶1。溶藻菌5的菌體和無細胞培養(yǎng)物均具有相同的溶藻效果。顯微觀察藻細胞被溶解的黃化液顯示細菌并未附著在藻細胞周圍，也無菌膠膜形成。表明溶藻菌5可能通過釋放殺藻物質(zhì)和與藻競爭營養(yǎng)物質(zhì)兩種機制溶解藻細胞。

溶藻菌；醋酸鈣不動桿菌；16S rDNA；銅綠微囊藻；溶藻特性

近年來水體富營養(yǎng)化日益加劇，水華現(xiàn)象頻繁發(fā)生，致使水體惡化嚴重，我國有限的淡水資源愈加匱乏。藻類分泌的毒素不僅破壞了水域生態(tài)環(huán)境，而且嚴重影響人體和動物的飲用水安全［1-3］。

除藻的方法主要有物理、化學和生物方法［4］。物理法有微濾法、直接過濾法、氣浮除藻法等?；瘜W法主要分為直接滅殺法、絮凝劑沉淀法和天然礦物絮凝法［5］。但物理和化學方法都不能從根本上解決水華問題，并且耗資耗時。生物控藻已經(jīng)受到國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注，其中溶藻菌的研究最多。溶藻菌是水體中天然存在的一類細菌的總稱［1，6］，具有繁殖快、效率高和寄主特異性等特點。菌株取于環(huán)境用于環(huán)境，不會造成二次污染，節(jié)約了費用，因此溶藻菌作為一種安全有效的除藻方法［7］，其深入研究有望解決水華問題。

溶藻菌可通過直接或間接方式來殺死或抑制藻類的生長［8］，溶藻機理主要有以下5種：直接接觸溶藻、釋放溶藻物質(zhì)、細菌與藻競爭營養(yǎng)物質(zhì)、水體表面形成菌膠膜及菌進入藻細胞內(nèi)殺滅藻細胞［9-11］。已鑒定的溶藻菌有假單胞菌［5，12-14］、嗜胞菌［15］、弧菌［5，16-18］、芽孢桿菌［19］、粘細菌［20］、腐生螺旋體屬（Saprospira sp.）［21］、假交替單胞菌（Pseudoalteromonas nigrifaciens）［13，22，23］等，未見不動桿菌的報道。本研究分離一株高效溶藻菌，對其進行種屬及特性鑒定，旨在為溶藻菌的研究提供新資源，為解決水華問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種 微囊藻PCC 7806 和FACHB-930，紅球藻、衣藻和斜生柵藻均購自武漢水生所淡水藻種中心。PCC 7806 和FACHB-930在30℃，2 000 lx的光照強度下24 h光照培養(yǎng)。紅球藻、衣藻、斜生柵藻在25℃，2 000 lx的光照強度下24 h光照培養(yǎng)。

1.1.2 菌種 試驗菌株從平頂山市白龜山水庫中分離純化得到，命名為溶解酶5。

1.1.3 培養(yǎng)基 溶藻菌用LB培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，pH7.2；藻的培養(yǎng)基為BG11［22］，配制方法如下：首先配置下列母液，母液1-K2HPO4·3H2O 4 g/mL，母液2-MgSO4·7H2O 7.55 g/mL，母液3-CaCl23.6 g/mL，母液4-C6H8O7·H2O（檸檬酸）0.6 g/mL，母液5-（NH4）3FeC12H10O14（檸檬酸鐵銨）0.6 g/mL，母液6-EDTA·Na20.1 g/mL，母液7-Na2CO32 g/mL，A5：H3BO32.86 g/L，MnCl2·4H2O 1.81 g/L，ZnSO4·7H2O 0.222 g/L，CuSO4·5H2O 0.08 g/L，Na2·MoO4·2H2O 0.39 g/L，CoCl2·6H2O 0.01 g/L。然后按1∶1 000的比例在水中加入母液2、3、4、6、7、A5，以及1.5 g/L NaNO3，滅菌。使用前加入1/1 000的單獨滅菌的母液1和5。

1.2 方法

1.2.1 溶藻菌株的分離純化 從白龜山水庫中采集的水樣經(jīng)過濾除雜后按20%的體積接入培養(yǎng)至對數(shù)生長期的銅綠微囊藻PCC 7806的藻液中，于30℃光照混合培養(yǎng)，待藻液黃化后，取黃化藻液經(jīng)密度梯度稀釋，涂布LB平板，37℃培養(yǎng)24 h后，挑取形態(tài)差異顯著不同的單菌落，多次劃線分離得到純種菌株［24，25］。將分離的多株純種菌株經(jīng)活化擴大培養(yǎng)后，取30 mL菌液于離心管中4 000 r/min離心2 min，去上清，加入30 mL藻液，輕輕混勻后，30℃培養(yǎng)，每天觀察微囊藻的生理狀態(tài)，記錄。根據(jù)微囊藻的黃化程度篩選出溶藻效果明顯的菌株5。

1.2.2 溶藻菌5溶藻效果的測定 溶藻菌5經(jīng)活化擴大培養(yǎng)至OD600約為1.5時，取30 mL于離心管中4 000 r/min離心2 min后，去上清，加入30 mL OD750=0.807的藻液輕輕混勻后30℃培養(yǎng)。每隔24 h測定葉綠素a（Chl a）含量。測定方法為：取2 mL菌藻混合液12 000 r/min離心2 min，棄上清；加2 mL甲醇重懸藻細胞，用錫紙包裹后4℃黑暗條件下放置過夜；然后12 000 r/min離心5 min；取上清以甲醇為對照測664 nm下的吸光值，然后根據(jù)下式計算葉綠素a含量：葉綠素a含量（μg/mL）=13.34×OD664。

1.2.3 溶藻所需最少菌量的確定 培養(yǎng)溶藻菌5至OD600為1.6，微囊藻OD750為1.27時進行試驗。分別以菌藻體積比為1∶6（5 mL菌∶30 mL藻）、1∶3（10 mL菌∶30 mL藻）、2∶3（20 mL菌∶30 mL藻）和1∶1（30 mL菌∶30 mL藻）進行試驗，每組設(shè)置3個平行。每天觀察記錄藻的生長狀況。

1.2.4 菌種的鑒定 以溶藻菌5的基因組DNA為模板擴增其16S rDNA。引物：27F：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1495R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'。PCR反應條件：94℃預變性5 min 20 s；94℃變性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸90 s，擴增30個循環(huán)；70℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物由上海生工進行測序。

1.2.5 溶藻機理的研究 將溶藻菌5作用后的黃化藻液用0.22 μm的纖維素膜過濾［25］，得到菌體和無細胞濾液，分別用濾液和菌體感染藻液，每組3個平行，30℃培養(yǎng)，觀察記錄藻的生長狀況。

1.2.6 溶藻菌5溶藻特異性的研究 研究溶藻菌5對FACHB-930、紅球藻、衣藻、斜生柵藻是否具有溶藻效果。以30 mL菌液于離心管中4 000 r/min離心2 min，去上清，分別加入30 mL藻液，輕輕混勻后，30℃/25℃培養(yǎng)，觀察記錄藻的生長狀況。

1.2.7 顯微觀察溶藻菌5感染PCC 7806 溶藻菌5感染PCC 7806后，培養(yǎng)數(shù)天至藻細胞即將破裂時，取培養(yǎng)液10 μL于載玻片上，蓋上蓋玻片自然干燥后用正置顯微攝影系統(tǒng)觀察藻細胞的裂解情況。

2 結(jié)果

2.1 溶藻菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

白龜山水庫采集的水樣經(jīng)過濾除雜后以20%的體積接入對數(shù)生長期的毒性銅綠微囊藻PCC 7806，培養(yǎng)數(shù)天后將黃化藻液稀釋涂平板，37℃培養(yǎng)24 h后挑選單菌落，經(jīng)多次分離劃線純化單菌落，最終分離得到一株溶藻效果明顯的溶藻菌5。

為了鑒定溶藻菌5的種屬，PCR擴增其16S rDNA，電泳檢測顯示目的產(chǎn)物大小約為1.5 kb（圖1）。根據(jù)測序結(jié)果構(gòu)建進化樹（圖2）。利用ClustalX軟件對溶藻菌5及其同源序列進行初步的比對分析并進行人工校正，利用MEGA6軟件繪制進化樹。整個進化樹可以分為5大簇。溶藻菌5的基因序列與醋酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）的親緣關(guān)系最近。

圖1 PCR擴增溶藻菌5的16S rDNA

圖2 溶藻菌5與其它同源序列的進化關(guān)系樹

2.2 醋酸鈣不動桿菌的生長和溶藻特性

醋酸鈣不動桿菌的生長曲線（圖3）顯示，接入LB培養(yǎng)基后經(jīng)過2 h的適應期，細菌進入對數(shù)生長期，生長迅速，12 h后生長速率有所減慢。培養(yǎng)8 h時OD600=1.5，處于快速生長的對數(shù)期，此后試驗均以此為標準。

圖3 醋酸鈣不動桿菌的生長曲線

醋酸鈣不動桿菌培養(yǎng)8 h后，低速離心，去上清后與等體積的PCC 7806混合，培養(yǎng)11 d后藻液顏色由原來的墨綠色黃化變白（圖4-A，3-5號瓶），而對照組PCC 7806（圖4-A，1-2號瓶）則持續(xù)生長。葉綠素a測定（圖4-B）顯示，菌藻混合后第2天PCC 7806葉綠素a含量逐漸降低，說明PCC 7806開始被醋酸鈣不動桿菌溶解，隨著時間的延長，藻細胞幾乎被完全裂解。而對照組則持續(xù)生長，葉綠素a含量不斷增加。

為了研究醋酸鈣不動桿菌對其它藻類是否也有溶解效果，將其分別與本實驗室培養(yǎng)的微囊藻FACHB-930、紅球藻（Haematococcus sp.）、衣藻（Chlamydomonas sp.）和斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）混合培養(yǎng)，結(jié)果（表1）顯示，加入醋酸鈣不動桿菌后，F(xiàn)ACHB-930、斜生柵藻的葉綠素a含量與其對照組相比略微下降，溶藻效果不明顯。相反，紅球藻、衣藻的生長速率有所提高，其葉綠素a的含量分別高于其對照組，說明醋酸鈣不動桿菌促進了紅球藻和衣藻的生長。

為了確定溶藻所需最少菌量，將不同體積的醋酸鈣不動桿菌（OD600=1.6）與30 mL微囊藻PCC 7806（OD750=1.27，Chl a=4.76）混合，比較溶藻效果的差異。圖5顯示，隨著菌濃度升高，溶藻菌對藻的抑制作用就越大，菌藻比為1∶1時，葉綠素a含量明顯很低，溶藻效果最為明顯。初步判斷菌液濃度與溶藻效果成正相關(guān)關(guān)系。

圖4 醋酸鈣不動桿菌感染PCC 7806后藻液顏色（A）和葉綠素a含量的變化（B）

表1 醋酸鈣不動桿菌對FACHB-930、紅球藻、衣藻和斜生柵藻的溶藻特征分析

圖5 不同菌量的溶藻效果

2.3 醋酸鈣不動桿菌溶藻機理

利用0.22 μm的纖維素濾膜過濾醋酸鈣不動桿菌的培養(yǎng)物，分別得到濾液和菌體，將濾液和菌體分別感染PCC 7806（圖6），濾液和菌體對微囊藻PCC 7806均具有一定的溶藻效果。因此推測溶藻醋酸鈣不動桿菌既可以釋放胞外溶藻物質(zhì)溶解，也能夠通過自身來溶解藻細胞。進一步顯微觀察溶藻后的黃化液（圖7）顯示，藻細胞被裂解為片狀，周圍無附著細菌，也未形成菌膠膜。

圖6 醋酸鈣不動桿菌培養(yǎng)物的濾液和菌體溶藻效果比較

3 討論

銅綠微囊藻是我國淡水水華藻類中最為常見的一種，其毒素具有肝癌毒性。因此，尋找有效的控藻方法具有重要意義。從水體中篩選溶藻菌不會造成二次污染，已經(jīng)成為生物控藻領(lǐng)域的熱點之一。本研究從平頂山白龜山水庫分離一株溶藻菌，經(jīng)16S rDNA鑒定為醋酸鈣不動桿菌。16S rDNA普遍存在于細菌中，相對分子量大小適中，約1.5 kb，其分子中既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域。可變區(qū)序列因細菌不同而異，恒定區(qū)序列高度保守，因此可利用恒定區(qū)序列設(shè)計引物，將16S rDNA片段擴增出來，利用可變區(qū)序列的差異來對不同菌的種屬進行分類鑒定。因此16S rDNA是細菌的系統(tǒng)分類研究中最有用和最常用的分子鐘。

圖7 醋酸鈣不動桿菌（A）、PCC 7806（B）和裂解的藻細胞（C）的電鏡照片

醋酸鈣不動桿菌主要存在于土壤中，菌體短小呈球桿狀，在LB固體養(yǎng)培基上是光滑、且有黏度的圓形菌落。這是首次鑒定具有溶藻效果的醋酸鈣不動桿菌，為溶藻菌的研究提供了新的資源。

細菌感染藻細胞后，測定750 nm處吸光值的方法檢測藻的生物量變化具有一定的誤差。而葉綠素a含量能夠直接反映水體藻類的生物量，因此利用葉綠素a 含量的變化作為指標來測定溶藻效果更為準確。醋酸鈣不動桿菌特異性溶解微囊藻PCC 7806，對微囊藻FACHB-930和斜生柵藻沒有抑制效果，卻促進了紅球藻和衣藻的生長。紅球藻是一種淡水單細胞綠藻，富含蝦青素，是繼螺旋藻、小球藻之后，新發(fā)現(xiàn)的富含營養(yǎng)價值和藥用價值的藻類食品。衣藻隸屬于淡水單細胞真核生物，富含蛋白質(zhì)，可作飼料或食用。醋酸鈣不動桿菌在抑制產(chǎn)毒微囊藻PCC 7806生長的同時，促進了有益的紅球藻和衣藻的生長，較其它的溶藻菌更具有優(yōu)越性。

溶藻菌的溶藻效果不僅與自身有關(guān)，與菌的濃度也有密切關(guān)系，細菌溶藻的發(fā)生對細菌有一定濃度的要求，較低初始濃度會導致溶藻效果降低或無溶藻效果［8，26］，溶藻所需最少菌量也是判斷菌溶藻效果的重要指標，這與本研究結(jié)論一致。醋酸鈣不動桿菌的溶藻效果與其濃度呈正相關(guān)，隨著細菌數(shù)量的增加，溶藻效果增強。此外，還有研究表明溶藻菌的溶藻效果還與其生長速率密切相關(guān)［27］。醋酸鈣不動桿菌生長速率快，可以迅速增加濃度，有利于生物控藻。

細菌的溶藻方式很多，可分為直接接觸溶藻、釋放殺藻物質(zhì)、細菌與藻競爭營養(yǎng)物、形成菌膠膜和進入藻細胞內(nèi)殺滅藻細胞。菌進入藻細胞內(nèi)殺滅藻細胞的方式很罕見，已有的報道是從銅綠微囊藻中分離出的一種類似蛭弧菌的細菌，由于菌的進入，銅綠微囊藻的細胞被溶解［8］。本研究中醋酸鈣不動桿菌的菌體和濾液均具有相同的溶藻效果。說明其既通過自身裂解藻細胞，也分泌溶藻物質(zhì)來裂解藻細胞。顯微觀察顯示，黃化藻液中藻細胞的表面沒有粘附菌體，亦沒有菌膠膜的形成，說明不是通過直接接觸或形成菌膠膜溶藻。醋酸鈣不動桿菌感染PCC 7806第2天，其葉綠素a含量即開始下降，而對照組持續(xù)生長，說明此時藻類生長所需的N、P、K等營養(yǎng)物質(zhì)還十分充足，細菌不是通過與藻競爭生長所需的N、P、K等物質(zhì)抑藻。已有研究表明細菌釋放的特異性或非特異性的胞外物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、多肽類物質(zhì)以及抗生素、化學物質(zhì)等［3、6、7］，針對醋酸鈣不動桿菌釋放的溶藻物質(zhì)的研究可通過蛋白酶敏感試驗首先確定其是否為蛋白類。若對蛋白酶敏感，可通過SDS-PAGE電泳分離目標蛋白；若對蛋白酶不敏感，則可以通過有機溶劑萃取或者乙醇沉淀的方法分離溶藻物質(zhì)進行進一步研究。

4 結(jié)論

從白龜山水庫分離到一株溶藻菌，命名為溶藻菌5，經(jīng)16S rDNA測序和進化樹構(gòu)建確定其為醋酸鈣不動桿菌。醋酸鈣不動桿菌特異性溶解銅綠微囊藻PCC 7806；對微囊藻FACHB-930和斜生柵藻生長無影響；能夠促進紅球藻和衣藻的生長。醋酸鈣不動桿菌的溶藻效果隨濃度增加逐漸增強，最佳溶藻體積比為1∶1。醋酸鈣不動桿菌的菌體和無細胞培養(yǎng)液具有相同的溶藻效果。PCC 7806藻細胞裂解后未觀察到細菌的粘附和菌膠膜的形成。

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（責任編輯 馬鑫）

Isolation，Identification and Algicidal Activity of Acinetobacter calcoaceticus

Wang Yun Zhang Yemeng Li Peipei
（College of Life and Engineering，Henan University of Urban Construction，Pingdingshan 467036）

The microcystis bloom not only result in the death of the aquatic animals due to hypoxia， but also produce mycrocystins which is harmful to the human beings and wild animals. One algicidal bacterium against toxic Microcystis aeruginosa PCC 7806 was isolated from the Baiguishan Reservoir in Pingdingshan of Henan province using liquid infection technology and was named algicidal bacterium 5. The 16S rDNA sequence analysis indicated that this bacterium belongs to Acinetobacter calcoaceticus. It specifically removes PCC 7806 by cell lysis， but has no effect on FACHB-930 and Scenedesmus obliquus. Interestingly， the growth of haematococcus and Chlamydomonas reinhardtii are promoted. The algicidal effect of bacterium against PCC 7806 is better when the volume ratio of 1∶1. The thalli and cell-free filtrate shows the same lytic effect. There are no bacteria adhering to the surface of the PCC 7806. And no bacterial biofilm were observed. These results may suggest that The A. calcoaceticus may secrete substance and compete for nutrients to remove PCC 7806.

algicidal bacterium；Acinetobacter calcoaceticus；16S rDNA；Microcystis aeruginosa；algicidal characteristics

10.13560/j.cnki.biotech.bull 1985.2015.04.020

2014-08-14

河南城建學院?；痦椖?/p>

王赟，女，博士，講師，研究方向：分子生物學；E-mail：y-wang401@163.com