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    中藥材對(duì)黃曲霉毒素B1快速檢測(cè)的影響

    2015-10-26 14:39:30北京市藥品檢驗(yàn)所100035李輝
    首都食品與醫(yī)藥 2015年20期
    關(guān)鍵詞:膠體金黃曲霉紙條

    北京市藥品檢驗(yàn)所(100035)李輝

    黃曲霉毒素(Aflations,簡(jiǎn)稱AFs)是食品和藥用植物中最為常見霉菌毒素黃曲霉(Aspergillus. favus)和寄生曲霉菌(Aspergillus. parasiticus)的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]。其污染范圍廣泛,存在于花生、玉米、小麥以及中藥材等產(chǎn)品中。AFs的基本結(jié)構(gòu)為二呋喃環(huán)和香豆素,黃曲霉毒素B1(AFB1)是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌铮幸粋€(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀?,前者為基本有毒性成分結(jié)構(gòu),后者屬于引起致癌性作用的有效基團(tuán)[2]。AFB1是一種劇毒和強(qiáng)致癌性物質(zhì),主要作用的靶器官是肝臟,能夠引起慢性肝炎、肝壞死及肝硬化等肝臟疾病[3]。

    目前,已有檢測(cè)AFs含量的方法主要分為下列幾種,一類是以色譜技術(shù)為基礎(chǔ)的理化檢測(cè)方法,即生物鑒定法和儀器檢測(cè)法[4]。儀器檢測(cè)法包括薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)等;另一類是應(yīng)用免疫層析技術(shù)的化學(xué)檢測(cè)方法,包括放射免疫法(RIA)、免疫親和柱法(IAC)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)以及試紙條法等。由于常規(guī)儀器分析技術(shù)不能滿足毒素快速篩查目標(biāo),試紙條檢測(cè)法應(yīng)運(yùn)而生。但是,中藥材自身化學(xué)組分復(fù)雜,基質(zhì)干擾大,常對(duì)試紙條檢測(cè)結(jié)果造成假陽(yáng)性的干擾。因此,本文以蓮子、當(dāng)歸、山楂、麥芽及大黃為研究對(duì)象,初步探討試紙條檢測(cè)技術(shù)在中藥中AFB1快速檢測(cè)應(yīng)用及影響因素,為建立中藥中AFB1快速檢測(cè)方法提供參考。

    1 膠體金免疫層析技術(shù)在中藥材真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

    膠體金免疫層析技術(shù)是20世紀(jì)80年代繼熒光素標(biāo)記技術(shù)、放射性同位素標(biāo)記技術(shù)及酶標(biāo)記之后發(fā)展起來(lái)一種固相快速免疫診斷技術(shù)[5]。該技術(shù)利用金納米顆粒作為示蹤物,以抗原結(jié)合抗體表現(xiàn)出的直觀顏色變化來(lái)判定樣品中是否含有抗原,從而達(dá)到檢測(cè)目的。

    目前,膠體金免疫層析技術(shù)以其高特異性、高靈敏性、方便快速檢測(cè)應(yīng)用于食品、藥品等快速檢測(cè)中[6]。但是,應(yīng)用此技術(shù)用于檢測(cè)中藥中的真菌毒素研究尚未報(bào)道。大多由于中藥自身化學(xué)成分復(fù)雜、基質(zhì)干擾較大并需要繁瑣的前處理?xiàng)l件,以至于研究者很少關(guān)注中藥材真菌毒素快速檢測(cè)。隨著中藥的國(guó)際化,中藥出口的問題化也越來(lái)越嚴(yán)重,中藥“治病”和“產(chǎn)病”一直是大家關(guān)心的話題。大量研究表明中藥材易被真菌毒素(如:黃曲霉毒素,赭曲霉毒素等)污染[7]。所以,建立一種快速便捷的中藥材真菌毒素檢測(cè)方法勢(shì)在必行。膠體金免疫層析技術(shù)應(yīng)用的范圍越來(lái)越廣泛,今后,利用膠體金免疫層析技術(shù)檢測(cè)中藥材中真菌毒素將是篩查真菌毒素污染的最好方法。

    2 試紙條法對(duì)中藥材選取影響

    中藥材中可能存在的外源性污染主要包括真菌毒素殘留、農(nóng)藥殘留、重金屬及有害元素殘留等[8]。中藥中的有害殘留物主要來(lái)自于藥用植物在生長(zhǎng)過程中接觸的土壤、水、大氣等自然環(huán)境和炮制、加工、運(yùn)輸、貯藏等過程中的污染。為了監(jiān)測(cè)和控制真菌毒素的污染,同時(shí)保障人類的身體健康。簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)的真菌毒素分析方法的建立是近年的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

    由于,中藥材所含化學(xué)成分種類多,基質(zhì)復(fù)雜,而真菌毒素的分析又屬于痕量分析,大大增加了檢測(cè)難度。而膠體金免疫層析技術(shù)是金顆粒作為標(biāo)記物,以特異性的抗原和抗體結(jié)合反應(yīng)而表現(xiàn)出的顏色變化,來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果的,待測(cè)物結(jié)構(gòu)與最終制備的試紙條靈敏度關(guān)系甚大。中藥材中不乏有些化學(xué)成分與AFB1的結(jié)構(gòu)相似,常常會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性。為避免假陽(yáng)性事件的發(fā)生,選擇合適的中藥至關(guān)重要。

    另一方面,我國(guó)藥用植物資源豐富,臨床常用的預(yù)防治療疾病的植物多達(dá)700多種,不可能把所有中藥都作為研究對(duì)象。因此,優(yōu)選常見大宗藥材作為前期研究對(duì)象可為今后建立其他中藥中AFB1快速篩查提供依據(jù)。

    2.1 中藥藥用功效研究 選取即可藥用又可日常保健的中藥作為研究對(duì)象,這類中藥兼具保健、食補(bǔ)、強(qiáng)身、健體多重功效,現(xiàn)實(shí)生活使用頻率較高。選取此類中藥不僅可以提高中藥品質(zhì),也能夠保障人類身體用藥安全[9][10][11][12]13]。同時(shí),對(duì)補(bǔ)充和完善中藥AFB1快速檢測(cè)方法非常必要。本文以蓮子、當(dāng)歸、山楂、麥芽及大黃為研究對(duì)象,其性效用見附表1。

    附表1 5種中藥藥性效用分析

    附表2 選取的5種中藥化學(xué)成分分析

    附表3 中藥的基質(zhì)效應(yīng)考察

    2.2 中藥的化學(xué)成分研究 在選取中藥時(shí),化學(xué)結(jié)構(gòu)對(duì)中藥中黃曲霉毒素B1的快速篩查的影響大。由于AFB1結(jié)構(gòu)含有香豆素類成分,所以,應(yīng)用膠體金免疫層析試紙條會(huì)對(duì)含有香豆素類成分的中藥檢測(cè)的假陽(yáng)性出現(xiàn)率高。5種中藥所含的化學(xué)成分見附表2。可以看出,中藥化學(xué)組分中不含有香豆素類成分,可能對(duì)試紙條檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性率影響較小。

    2.3 中藥的基質(zhì)效應(yīng)考察 中藥材基質(zhì)效應(yīng)是造成試紙條檢測(cè)假陽(yáng)性重要原因,同時(shí),基質(zhì)效應(yīng)簡(jiǎn)單的藥材對(duì)制備的試紙條前處理液有良好的適應(yīng)性??疾爝x取的5種中藥的基質(zhì)效應(yīng)影響。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下。

    ①將藥材粉碎,過40目篩,精密稱取供試品粉末2g,加入10mL甲醇-水(80:20,v/v),浸泡20min,渦旋振蕩10min,5000rpm離心5min;②精密吸取500μL上清液經(jīng)N2吹干,配制成低、中、高三個(gè)濃度水平的加標(biāo)溶液,其中AFB1的加標(biāo)水平為1,5,25ng/mL,將制得樣品液;③采用UPLC-MS/MS進(jìn)行分析檢測(cè),每個(gè)濃度2份,每份樣品重復(fù)測(cè)定3次;再用色譜甲醇配制相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,每個(gè)濃度2份,進(jìn)樣分析,按照以下公式基質(zhì)效應(yīng)(ME%)=(加標(biāo)樣品峰面積/標(biāo)品峰面積)×100%[14]計(jì)算兩組峰面積的比值,分別考察5種藥材的基質(zhì)效應(yīng),結(jié)果見附表3。中藥材的基質(zhì)效應(yīng)影響小,藥材中AFB1經(jīng)一步提取法檢測(cè)時(shí)受基質(zhì)效應(yīng)的影響越小。簡(jiǎn)單的樣品檢測(cè)液也能保證在制備的試紙條上順利地完成檢測(cè)過程。

    3 討論

    AFB1是由黃曲霉菌和寄生曲霉產(chǎn)生的刺激代謝產(chǎn)物,為有害致癌性物質(zhì)。其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,不易被分解,毒性強(qiáng),可通過食物鏈在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)移并蓄積。不斷堆積的AFB1不僅給農(nóng)作物生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失,而且嚴(yán)重危害人類的身體健康。隨著,中藥材國(guó)際化進(jìn)程的加快,中藥的質(zhì)量安全和品質(zhì)保證成為關(guān)注的熱點(diǎn)話題。為保障人類健康不受危害,需要通過一種快速檢測(cè)的手段對(duì)真菌毒素進(jìn)行初步篩查。膠體金免疫層析技術(shù)以其快速、靈敏、便捷、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)受到廣泛的重視。

    由于免疫層析技術(shù)并沒有在中藥檢測(cè)方面得到廣泛地應(yīng)用。因此,在中藥材作為檢測(cè)研究對(duì)象時(shí),一般需要遵循以下原則:①選取常見大宗中藥中易污染黃曲霉毒素的中藥作為研究對(duì)象。②剔除化學(xué)成分上與AFB1結(jié)構(gòu)相似的中藥,如理化結(jié)構(gòu)中含有香豆素類成分不作為本次實(shí)驗(yàn)的研究品種。③選取即可藥用又可日常保健的中藥作為研究對(duì)象,這類中藥多具保健、食補(bǔ)、強(qiáng)身、健體多重功效,現(xiàn)實(shí)生活使用頻率較高。選取這類藥物不僅可以提高中藥品質(zhì),而且,能夠保障人類身體用藥安全。

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